UPLC—MS/MS法測定蝦肉中氯霉素殘留量的不確定度分析

李 濤

周艷華2

楊 滔1

孫桂芳1

(1. 湖南省食品質量監(jiān)督檢驗研究院，湖南 長沙 410111；2. 長沙環(huán)境保護職業(yè)技術學院，湖南 長沙 410004)

UPLC—MS/MS法測定蝦肉中氯霉素殘留量的不確定度分析

李 濤1

周艷華2

楊 滔1

孫桂芳1

(1. 湖南省食品質量監(jiān)督檢驗研究院，湖南 長沙 410111；2. 長沙環(huán)境保護職業(yè)技術學院，湖南 長沙 410004)

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜(UPLC—MS/MS)法測定Fapas能力驗證項目蝦肉中氯霉素的殘留量，并進行不確定度評定，給出了不確定度。先建立了測定蝦肉中氯霉素殘留量的不確定度的數(shù)學模型，再對不確定度來源進行分析。通過對不確定度分量進行量化和合成，得出當蝦肉中氯霉素殘留量為0.820 8 μg/kg時，其擴展不確定度為0.146 2 μg/kg(k=2)，結果符合Fapas能力驗證指定范圍。評定結果表明，UPLC—MS/MS法測定蝦肉中氯霉素試驗過程中，樣品稱量、樣品提取、校準曲線的配制、質譜測定、校準曲線的擬合等過程都會引入不確定度，其中，標準系列溶液配制和標準曲線的擬合引入的不確定度最大。

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜(UPLC—MS/MS)；蝦；氯霉素；不確定度；Fapas

測量不確定度簡稱不確定度，是根據(jù)所用到的信息，表征賦予被測量值分散性的非負參數(shù)[1]。不確定度大小反應測量水平的高低，直接影響到產(chǎn)品合格判定。不確定分析對于質量控制具有重要意義，GB/T 27025—2008/ISO/IEC 17025:2005明確了檢測和校準實驗室應具有應用評定測量不確定的程序。

氯霉素是一類廣譜抗生素，曾在中國畜牧水產(chǎn)業(yè)中被廣泛應用[2-3]，但其對人類有很大的毒副作用，可抑制人類骨髓造血功能，引起再生性障礙貧血和其他血液病等[4]。中國已于2002年禁止使用氯霉素，并要求所有動物可食組織中不得檢出氯霉素[5]。但少量不法分子為降低成本，仍少量使用效價高、價格低廉的氯霉素。氯霉素檢測方法有液質法[6-8]、氣相色譜法[9]、氣質法[10]、電化學法[11]、傳感器法[12-13]和膠體金法[14]等。超高效液相色譜-串聯(lián)質譜(UPLC—MS/MS)是氯霉素檢測使用最廣泛的方法，其具有靈敏度高、選擇性強等特點，氯霉素檢出限為0.1 μg/kg，為確保檢出結果的可信度，必須進行不確定度的評定[15-16]。

英國Fapas能力驗證是專門用于食品檢測分析方面的能力評估體系，通過實驗室間測試結果的比對來判定實驗室能力的合格評定活動。本試驗采用UPLC—MS/MS法測定Fapas能力驗證項目蝦肉中氯霉素殘留量，依據(jù)JF 1059.1—2012和JJF 1135—2005評定整個試驗過程的不確定度，為檢驗數(shù)據(jù)上報提供提供科學、準確的依據(jù)，確保檢出結果的可信度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯霉素(純度為98.6%)、氘代氯霉素(純度為 98.0%)：德國Dr.Ehrenstorfer公司；

甲醇、乙腈、乙酸銨：色譜純；

蝦肉和蝦肉空白基質：FAPAS 中國代理處。

1.2 儀器與設備

超高壓液相色譜儀：LC-30型，日本島津公司；

串聯(lián)質譜儀：API 5500型，美國 AB Sciex 公司；

電子分析天平：BS224S型，德國賽多利斯公司；

臺式冷凍離心機：X1R型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

漩渦振蕩器：HMS-350型，上海珂淮儀器有限公司；

氮吹儀：MV-5型，北京萊伯泰科股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 前處理方法 準確稱取約2.0 g樣品(精確至0.1 mg)于50 mL離心管中，加入乙腈10 mL，10 ng 氘代氯霉素，振搖10 min后6 000 r/min離心10 min，取上清液，加入乙腈10 mL提取第2次，合并2次上清液，轉移至氮吹管，45 ℃氮吹干，超純水定容至1.0 mL，過0.22 μm濾膜后，進行UPLC—MS/MS 測定。

1.3.2 UPLC—MS/MS測定色譜條件 色譜柱：Hypersil Gold C18液相色譜柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相：A相為水，B相為乙腈，C相為10 mmol/L乙酸銨，按表1進行梯度洗脫。

表1 流動相梯度洗脫表

1.3.3 UPLC—MS/MS測定質譜條件 離子源：電噴霧離子化(ESI)負離子模式；氣簾氣： 172.3 kPa，鞘氣275.8 kPa，輔助氣275.8 kPa，碰撞氣中等，離子化電壓-4 500 V，霧化溫度550 ℃；多反應監(jiān)測掃描(MRM)采集參數(shù)見表 2。

1.3.4 數(shù)學模型的建立 氯霉素殘留量按式(1)計算：

X=C×V/m，

(1)

式中：

X——樣品中待測組分殘留量，μg/kg；

C——待測組分校準工作液的濃度，ng/mL；

V——樣品溶液最終定容體積，mL；

表2 液質采集參數(shù)表

M——樣品稱樣量，g。

2 結果與分析

2.1 試驗結果

2.1.1 校準曲線的測定 測得校準曲線方程為y=0.201 62x+0.008 63，相關系數(shù)r=0.999 9。

2.1.2 樣品重復性試驗 平行處理6份供試樣，結果分別為0.831 3，0.826 7，0.816 8，0.808 9，0.800 9，0.840 3 μg/kg，平均值為0.820 8 μg/kg，標準偏差為0.017 9 μg/kg。

2.1.3 樣品回收率試驗 取約2 g蝦肉空白基質2份，添加與樣品濃度相當氯霉素標準溶液，同試樣處理方法，進行UPLC—MS/MS測定，得到蝦肉中氯霉素的回收率分別98.2%和99.1%。

2.2 不確定度來源分析

根據(jù)前處理及測定，對樣品中氯霉素殘留量測定結果有影響的各種不確定的分量來源進行分析，不確定度因素引入見圖1。由圖1可知，樣品稱量、樣品溶液制備定容、標準系列溶液配制、測量重復性、回收率都會給檢驗結果引入不確定度。

圖1 氯霉素測定不確定度來源圖

2.3 不確定度分析與評定

2.3.3 待測組分濃度不確定度urel(C)urel(C)的不確定度包括校準溶液配制和校準曲線擬合不確定度。校準曲線配制引入的不確定度有校準物質純度、儲備液配制、校準溶液的配制和溫度變化；校準曲線擬合引入不確定包括校準溶液濃度、儀器波動和溫度變化。

(1) 校準儲備液配制引入的不確定度urel(C1)。

(4) 校準曲線擬合引入的不確定度urel(C4)：校準系列溶液進行UPLC—MS/MS測定，通過Excel擬合為校準曲線，校準曲線為y=0.201 62x+0.008 63，校準曲線擬合不確定度計算程序僅與響應值有關，與校準溶液的不確定度無關[17]。氯霉素校準曲線測定結果見表4。

校準曲線擬合引入不確定度：

(2)

(3)

urel(C4)=u(C4)/c0=0.065 5/0.82=0.079 9，

(4)

式中:

sA——校準曲線的校準差；

p——樣品溶液的測定次數(shù)，p= 6；

N——校準溶液(含空白溶液) 的測定次數(shù)，N= 6；

b——校準曲線的斜率；

a——校準曲線的截距；

c0——由校準曲線方程求得的樣品溶液中待測物的濃度，μg/L；

表3 校準系列溶液稀釋步驟引入的不確定度

表4 氯霉素校準溶液測定結果?

?p=5，N=6，c均=5.0 μg/mL，c0=0.82 μg/L，b=0.201 62。

c均——各校準溶液濃度配制值的平均值，μg/L；

ci——各校準校準溶液的濃度點的配制值；

cj——由校準曲線方程得出的校準溶液的測定值，μg/L。

2.3.6 合成的相對不確定度 相對不確定度分量見表5，將各相對不確定分量進行合成。

表5 相對不確定度分量匯總表

2.3.7 擴展不確定度及結果表述 依據(jù)JJF 1135—2005，對于大多數(shù)測量采用包含因子k=2，則UPLC—MS/MS法測定蝦肉中氯霉素殘留量的擴展不確定度U=2×urel(X)=2×0.073 1=0.146 2，結果表述為蝦肉中氯霉素殘留量為(0.820 8±0.146 2) μg/kg，k=2。

3 結論

本次試驗蝦肉中氯霉素殘留量測定為2016年11月Fapas國際能力比對項目，共110家單位參加，氯霉素殘留量指定值0.857 μg/kg，檢驗結果氯霉素殘留量0.821 μg/kg，CCβ為0.1，z-score為-0.2，表明本次試驗結果數(shù)據(jù)可靠。

UPLC—MS/MS法測定蝦肉中氯霉素試驗過程中，樣品稱量、樣品提取、校準曲線的配制、質譜測定、校準曲線的擬合等過程都會引入不確定度。本試驗通過對試驗過程中的玻璃器皿、溫度變化、溶液稀釋配制、重復測定、回收率等因素帶來的不確定度進行評定，由于樣品中氯霉素殘留量低，標準品需經(jīng)過多次稀釋，標準系列溶液配制和標準曲線的擬合引入的不確定度最大。前處理過程及標準溶液中添加了內標物質，重復率和回收率的結果均比較好，引入的不確定度較小。UPLC—MS/MS靈敏度高，選擇性強，但測試穩(wěn)定性不強，因此測試過程會帶來較大的不確定度。在試驗操作過程中，嚴格規(guī)范操作，提高操作熟練度，增加混合標準系列溶液的測定次數(shù)，保持儀器的靈敏度，可保證結果的準確性。

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Uncertainty analysis of determination of chloramphenicol residue in shrimp by UPLC-MS/MS method

LITao1

ZHOUYan-hua2

YANGTao1

SUNGui-fang1

(1.HunanProvincialFoodQualitySupervisionandInspectionInstitute,Changsha,Hunan410011,China; 2.ChangshaEnvironmentalProtectionVoctionalCollege,Changsha,Hunan410004,China)

In this paper, the Fapas ability was used to verify the chloramphenicol residues in shrimp meat by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS), and the uncertainty was evaluated. Uncertainty was given. First, a mathematical model for determining the uncertainty of chloramphenicol residues in shrimp was established, and then the source of uncertainty was analyzed. The uncertainty of the uncertainty was 0.146 2 μg/kg (k= 2) when the chloramphenicol residues in the shrimp were 0.820 8 μg/ kg, and the results were in accordance with the Fapas ability test. Specify the scope. The results showed that the UPLC-MS / MS method was used to determine the uncertainty of the process of determination of chloramphenicol in shrimp，sample weighing, sample extraction, calibration curve, mass spectrometry and calibration curve etc were the major infact for uncertainty. The standard series solution formulation and the fitting of the standard curve were introduced with the greatest uncertainty.

ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); prawn; chloramphenicol; uncertainty; Fapas

湖南省自然科學基金項目(編號：2017JJ5062)

李濤，男，湖南省食品質量監(jiān)督檢驗研究院助理研究員，碩士。

周艷華(1982—)，女，長沙環(huán)境保護職業(yè)技術學院工程師，碩士。E-mail: boylitao@163.com

2017—05—27

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.013