L-茶氨酸對(duì)α-淀粉酶和胰蛋白酶的抑制作用

袁冬寅

龍 軍2

龔志華1

林 玲1

周 陽(yáng)1

彭影琦1

肖文軍1,3

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 常德市柳葉湖旅游度假區(qū)七里橋街道辦事處，湖南 常德 415000；3. 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

L-茶氨酸對(duì)α-淀粉酶和胰蛋白酶的抑制作用

袁冬寅1

龍 軍2

龔志華1

林 玲1

周 陽(yáng)1

彭影琦1

肖文軍1,3

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 常德市柳葉湖旅游度假區(qū)七里橋街道辦事處，湖南 常德 415000；3. 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

以L-茶氨酸為原料，通過(guò)建立最佳酶促反應(yīng)體系，采用非連續(xù)測(cè)定和作圖法研究了L-茶氨酸對(duì)α-淀粉酶、胰蛋白酶的抑制作用及其動(dòng)力學(xué)特征，為L(zhǎng)-茶氨酸的深層開(kāi)發(fā)利用提供參考。結(jié)果表明，L-茶氨酸對(duì)α-淀粉酶和胰蛋白酶的抑制效果均與其質(zhì)量濃度呈正比，在底物質(zhì)量濃度1%、體系添加順序?yàn)槊概c抑制劑在37 ℃預(yù)熱5 min后加入底物的條件下，L-茶氨酸抑制α-淀粉酶的最優(yōu)條件為α-淀粉酶質(zhì)量濃度0.018 mg/mL、反應(yīng)時(shí)間3 min，IC50為26.078 mg/mL，當(dāng)酶量為18 518.52 U時(shí)，α-淀粉酶的Km為2.247 mg/mL；在底物質(zhì)量濃度1%、體系添加順序?yàn)橐鹊鞍酌概c抑制劑在40 ℃預(yù)熱5 min后加入底物的條件下，L-茶氨酸抑制胰蛋白酶的最優(yōu)條件為胰蛋白酶質(zhì)量濃度0.252 mg/mL、反應(yīng)時(shí)間15 min，IC50為196.299 mg/mL，當(dāng)酶量為1 055 931 U時(shí)，胰蛋白酶的Km為5.189 mg/mL。說(shuō)明L-茶氨酸對(duì)α-淀粉酶和胰蛋白酶均有一定的抑制作用，且抑制α-淀粉酶的效果較好。

L-茶氨酸；α-淀粉酶；胰蛋白酶；抑制作用；糖脂代謝

L-茶氨酸(N-乙基-γ-L-谷氨酰胺)是茶葉中特有的一種非蛋白質(zhì)氨基酸，屬酰胺類(lèi)化合物[1]，具有降血壓[2]、提高記憶力[3-4]、安神鎮(zhèn)靜[5]、保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞[6]、調(diào)節(jié)免疫[7]、輔助抗腫瘤[8]、減肥降脂[9]等多種生物活性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健、食品等領(lǐng)域[10]。α-淀粉酶、胰蛋白酶是與機(jī)體糖脂代謝密切相關(guān)的兩種酶[11-12]，其中，α-淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶類(lèi)總稱(chēng)，是一種淀粉內(nèi)切酶，其作用方式是在淀粉分子內(nèi)部隨機(jī)切開(kāi)α-1,4糖苷鍵，并生成糊精和還原糖[13-14]；胰蛋白酶是動(dòng)物胰臟的主要蛋白質(zhì)水解酶[15]，能將蛋白質(zhì)分解成氨基酸，供人體吸收利用[16]。然而，目前尚未見(jiàn)L-茶氨酸抑制α-淀粉酶、胰蛋白酶生物活性研究的相關(guān)報(bào)道。為探索L-茶氨酸體外調(diào)節(jié)糖脂代謝的生物活性，本研究以L-茶氨酸為原料，通過(guò)建立最佳酶促反應(yīng)體系，采用非連續(xù)測(cè)定和作圖法研究L-茶氨酸對(duì)α-淀粉酶、胰蛋白酶的抑制作用及其動(dòng)力學(xué)特征，以期為L(zhǎng)-茶氨酸的深層開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-茶氨酸：純度≥98%，德國(guó)Sigma試劑公司；

α-淀粉酶(Lot.RM3018Y359)：4 U/mg，上海瑞永生物科技有限公司；

胰蛋白酶(批號(hào)20160216)：50 U/mg，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

可溶性淀粉、干酪素、碳酸鈉、四水酒石酸鉀鈉、三氯乙酸、福林酚：國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

精密電子天平：Mettler AE240型，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；

pH計(jì)：PHS22C型，上海雷磁儀器廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

紫外分光光度計(jì)：UV-2550型，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 配制2 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，分別吸取0.00，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mL置于10 mL容量瓶中，在37 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min后，各加入0.5 mL DNS溶液混合，沸水浴5 min，冷卻，加水定容至10 mL，用分光光度計(jì)于540 nm測(cè)吸光值。以不加葡萄糖溶液為空白對(duì)照組。求得葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=12.046x+0.022 7 (R2=0.999) 。

1.3.2α-淀粉酶最適酶促反應(yīng)條件篩選

(1) 酶質(zhì)量濃度確定：配制質(zhì)量濃度分別為0.006，0.010，0.014，0.018，0.022，0.026，0.030 mg/mL的α-淀粉酶溶液,分別置于7支試管中，在37 ℃條件下與底物溶液混勻進(jìn)行反應(yīng)，于540 nm處測(cè)吸光值，選擇最佳酶質(zhì)量濃度。

(2) 反應(yīng)時(shí)間及酶量確定：采用最佳酶質(zhì)量濃度，按表1順序添加試劑，測(cè)定反應(yīng)初始速率。由于建立動(dòng)力學(xué)方程最重要的是確定酶量與反應(yīng)時(shí)間，以確保酶初始速率達(dá)到最大，即當(dāng)?shù)孜餄舛茸銐虼髸r(shí)，反應(yīng)速率趨于極限值，幾乎不再隨底物濃度的增加而改變，符合零級(jí)反應(yīng)特征；酶量過(guò)高或過(guò)低都不適宜建立酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程。因此，選擇的酶量須保證每分鐘反應(yīng)體系在540 nm處的吸光值變化為0.03～0.25[17]。酶反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，立即計(jì)時(shí)，每隔1 min，加入DNS溶液終止反應(yīng)，于540 nm處測(cè)吸光值，篩選最佳反應(yīng)時(shí)間和最佳酶量。

表1 酶量確定

(3) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程的建立：采用最佳反應(yīng)時(shí)間和最佳酶量，保持酶質(zhì)量濃度不變，分別在0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，1.4%，1.6%的底物濃度下，于540 nm處測(cè)吸光值，并計(jì)算出酶促反應(yīng)的初始速率，按雙倒數(shù)法作圖(Vmax=1/縱截距，Km=斜率×Vmax)與米氏方程(1/V=Km/Vmax×1/[S]+1/Vmax)，求出Km和Vmax。

(4) 底物、酶、抑制劑添加順序確定：采用最佳反應(yīng)時(shí)間，將可溶性淀粉、α-淀粉酶、L-茶氨酸按如下3種順序添加：① 3種物質(zhì)先各自在37 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，再同時(shí)加入試管中反應(yīng)；② 先將可溶性淀粉與L-茶氨酸置于試管中，在37 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，再加入α-淀粉酶反應(yīng)；③ 先將α-淀粉酶與L-茶氨酸置于試管中，在37 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，再加入可溶性淀粉反應(yīng)。比較3種方式的抑制率，選擇最佳添加順序。

1.3.3 最優(yōu)酶促反應(yīng)條件下L-茶氨酸對(duì)α-淀粉酶的抑制效果 采用最佳添加順序，在9支試管中分別加入α-淀粉酶與質(zhì)量濃度為2，10，15，20，25，30，35，40，45 mg/mL的L-氨基酸，搖勻，在37 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，加底物反應(yīng)3 min后，立即加入DNS溶液，沸水浴5 min，冷卻，稀釋。背景對(duì)照為底物溶液與抑制劑，空白對(duì)照為煮沸的酶液，在540 nm處測(cè)吸光值。抑制活性按式(1)計(jì)算，其中A值均為540 nm處的吸光值。

1.3.4 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的酪氨酸，用時(shí)再稀釋10倍得0.1 mg/mL的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。按表2順序添加試劑，混合，放入40 ℃水浴保溫20 min后，冷卻至室溫，于660 nm比色。1號(hào)試管為空白對(duì)照組。求得酪氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.063 8x+0.020 7 (R2=0.998 1)。

表2 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線試劑加入順序

1.3.5 胰蛋白酶最適酶促反應(yīng)條件篩選

(1) 酶質(zhì)量濃度確定：配制質(zhì)量濃度分別為0.042，0.084，0.126，0.168，0.210，0.252，0.294 mg/mL的胰蛋白酶溶液置于7支試管中，在40 ℃條件下與底物混勻進(jìn)行反應(yīng)，于660 nm處測(cè)定吸光值，選擇合適的酶質(zhì)量濃度。

(2) 反應(yīng)時(shí)間確定：在40 ℃的水浴條件下，于6支試管中分別加入最佳質(zhì)量濃度的胰蛋白酶溶液與底物反應(yīng)，于660 nm處測(cè)不同反應(yīng)時(shí)間(5，10，15，20，25，30 min)下的吸光值，并計(jì)算出酪氨酸的生成量，選擇最適酶促反應(yīng)時(shí)間。

(3) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程的建立：經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，確定進(jìn)行酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定的酶量為1 055 931 U，反應(yīng)時(shí)間為3 min，保持酶質(zhì)量濃度不變，在不同的底物濃度(0.4%，0.6%，0.8%，1%，1.2%，1.4%)下，于660 nm處測(cè)吸光值，并計(jì)算出酶促反應(yīng)的初始速率，按雙倒數(shù)法作圖(Vmax=1/縱截距，Km=斜率×Vmax)與米氏方程(1/V=Km/Vmax×1/[S]+1/Vmax)，求出Km和Vmax。

(4) 底物、酶、抑制劑添加順序確定：采用最佳反應(yīng)時(shí)間，將干酪素、胰蛋白酶、L-茶氨酸按如下3種順序添加：① 3種物質(zhì)先各自在40 ℃的水浴中預(yù)熱5 min，再同時(shí)加入試管中反應(yīng)；② 先將干酪素與L-茶氨酸置于試管中，在40 ℃的水浴中預(yù)熱5 min，再加入胰蛋白酶反應(yīng)；③ 先將胰蛋白酶與L-茶氨酸置于試管中，在40 ℃的水浴中預(yù)熱5 min，再加入干酪素反應(yīng)。比較3種方式的抑制率，選擇最佳添加順序。

1.3.6 最優(yōu)酶促反應(yīng)條件下L-茶氨酸對(duì)胰蛋白酶的抑制效果 采用最佳添加順序，在5支試管中分別加入胰蛋白酶與質(zhì)量濃度分別為2，50，100，150，200 mg/mL的L-氨基酸，混勻，在40 ℃水浴中預(yù)熱5 min，再加入底物反應(yīng)15 min后，立即加入TCA溶液終止反應(yīng)，3 500 r/min離心10 min，取上清液，加碳酸鈉和福林酚，40 ℃水浴保溫20 min，冷卻，于660 nm處測(cè)定吸光值。背景對(duì)照為底物溶液與抑制劑，空白組為失活的酶液。抑制率按式(1)計(jì)算，其中A值均為660 nm處的吸光值。

1.3.7 色度測(cè)定

(1) 不同濃度的葡萄糖色度：采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定，用吸光值A(chǔ)540來(lái)表示。

(2) 不同濃度的酪氨酸色度：采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定，用吸光值A(chǔ)660來(lái)表示。

1.3.8 檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)方法

(1) 抑制率：按式(1)計(jì)算抑制率。

(1)

式中：

I——抑制率，%；

A1、A2、A3、A4——分別為無(wú)抑制組、空白組、加抑制組和背景對(duì)照組的吸光值。

(2)α-淀粉酶活力測(cè)定：采用Berndeld法[18]。

(3) 胰蛋白酶活力測(cè)定：采用Lowry蛋白質(zhì)測(cè)定法[19]。

(4) 統(tǒng)計(jì)方法：數(shù)據(jù)利用Excel 2013處理，IC50利用SPSS軟件中的Profit分析方法計(jì)算得出。

2 結(jié)果與分析

2.1α-淀粉酶最適酶促反應(yīng)條件篩選

2.1.1 酶質(zhì)量濃度確定 由圖1可知，在一定范圍內(nèi)，隨著酶質(zhì)量濃度的增加，吸光值增大。α-淀粉酶質(zhì)量濃度在0.01～0.018 mg/mL時(shí)，有較好的線性關(guān)系，吸光值與酶質(zhì)量濃度呈正比。α-淀粉酶質(zhì)量濃度在0.01～0.022 mg/mL時(shí)，反應(yīng)速率隨酶質(zhì)量濃度的增加而逐漸減慢，最終將達(dá)到平衡。為使酶促反應(yīng)速率保持最大，α-淀粉酶質(zhì)量濃度宜選擇0.018 mg/mL。

圖1 α-淀粉酶質(zhì)量濃度對(duì)酶活性的影響

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間與酶量確定 由圖2可知，反應(yīng)時(shí)間在3 min內(nèi)，線性反應(yīng)速度隨著酶量的增加而增大。比較不同酶量的反應(yīng)時(shí)間，發(fā)現(xiàn)所有的酶反應(yīng)進(jìn)程曲線在3 min內(nèi)，均有較好的線性關(guān)系，因此選擇3 min內(nèi)測(cè)得的速度為反應(yīng)初始速率。參照劉睿等[17]的研究方法，比較反應(yīng)初速率，確定以酶量18 518.52 U、反應(yīng)時(shí)間3 min進(jìn)行酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究。

圖2 α-淀粉酶不同酶量的反應(yīng)進(jìn)程曲線

2.1.3 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程的建立 由圖3可知，擬合曲線方程為y=12.304x+5.474 8，R2=0.993 4，求得Vmax=0.183 mg/(mL·min)，Km=2.247 mg/mL。

2.1.4 底物、酶、L-茶氨酸添加順序確定 由圖4可知，添加順序?yàn)棰?、②、③的抑制率分別為18.6%，16.8%，20.6%，但3種添加順序的差異不顯著(P>0.05)，其中順序③的抑制率相對(duì)最高，比順序②的抑制率高出3.8%，因此選順序③作為酶促反應(yīng)體系的添加順序，與劉雯等[20]建立的抑制劑添加順序一致。

2.2 最優(yōu)酶促反應(yīng)條件下L-茶氨酸對(duì)α-淀粉酶的抑制效果

由圖5可知，L-茶氨酸對(duì)α-淀粉酶的抑制效果隨L-茶氨酸質(zhì)量濃度的增大而增加；當(dāng)L-茶氨酸質(zhì)量濃度高于25 mg/mL時(shí)，抑制率的增長(zhǎng)速度加快。當(dāng)L-茶氨酸質(zhì)量濃度到達(dá)45 mg/mL時(shí)，抑制率為97.9%。經(jīng)計(jì)算，L-茶氨酸對(duì)α-淀粉酶的IC50為26.078 mg/mL。

圖3 α-淀粉酶的米氏方程曲線

圖4 不同添加順序?qū)Ζ?淀粉酶抑制作用的影響

圖5 不同質(zhì)量濃度L-茶氨酸對(duì)α-淀粉酶的抑制效果

2.3 胰蛋白酶最適酶促反應(yīng)條件篩選

2.3.1 酶質(zhì)量濃度確定 由圖6可知，吸光值隨胰蛋白酶質(zhì)量濃度的增加而增大且最終趨于平穩(wěn)，當(dāng)酶質(zhì)量濃度達(dá)到0.252 mg/mL時(shí)，吸光值已達(dá)最大值，說(shuō)明胰蛋白酶與底物基本反應(yīng)完全。因此選擇酶質(zhì)量濃度0.252 mg/mL較為合適。

2.3.2 酶促反應(yīng)時(shí)間確定 由圖7可知，酶促反應(yīng)時(shí)間在0～15 min時(shí)，產(chǎn)物的含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增多。在反應(yīng)15 min后，吸光值趨于穩(wěn)定，產(chǎn)物含量的增長(zhǎng)速率變慢，說(shuō)明胰蛋白酶與底物基本完全反應(yīng)。因此，反應(yīng)時(shí)間選擇15 min較為合適。

圖6 胰蛋白酶質(zhì)量濃度對(duì)酶活性的影響

圖7 最佳反應(yīng)時(shí)間的篩選

2.3.3 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程的建立 由圖8可知，擬合曲線方程為y=49.783x+9.593 1，R2=0.994 0，求得Vmax=0.104 mg/(mL·min)，Km=5.189 mg/mL。

圖8 胰蛋白酶的米氏方程曲線

2.3.4 底物、酶、L-茶氨酸添加順序確定 由圖9可知，添加順序?yàn)棰佟ⅱ?、③的抑制率分別為14.24%，13.57%，13.90%，抑制率結(jié)果與秦昱等[12]抑制劑添加順序結(jié)果一致，且3種添加順序的差異不顯著(P>0.05)，為了避免底物的干擾并降低試驗(yàn)操作的難度，故選擇順序③作為酶促反應(yīng)體系的添加順序。

2.4 最優(yōu)酶促反應(yīng)條件下L-茶氨酸對(duì)胰蛋白酶的抑制效果

由圖10可知，在試驗(yàn)設(shè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，L-茶氨酸對(duì)胰蛋白酶活性的抑制呈量效關(guān)系，抑制效果隨質(zhì)量濃度的增大而增加。經(jīng)計(jì)算，L-茶氨酸對(duì)胰蛋白酶的IC50為196.299 mg/mL。

圖9 反應(yīng)體系添加順序?qū)σ鹊鞍酌敢种菩Ч挠绊?/p>

圖10 不同質(zhì)量濃度L-茶氨酸對(duì)胰蛋白酶抑制作用

Figure 10 Inhibitory effect ofL-theanine at various concentrations on the activity of trypsin

3 結(jié)論

研究表明，L-茶氨酸對(duì)α-淀粉酶、胰蛋白酶均有一定的抑制作用，其半抑制濃度分別為26.078，196.299 mg/mL。α-淀粉酶在酶量為18 518.52 U、反應(yīng)時(shí)間為3 min時(shí)得Km為2.247 mg/mL。胰蛋白酶在酶量為1 055 931 U，反應(yīng)時(shí)間為3 min時(shí)得Km為5.189 mg/mL。本試驗(yàn)對(duì)L-茶氨酸體外抑制這兩種酶的作用進(jìn)行了初步研究，為進(jìn)一步探討L-茶氨酸對(duì)α-淀粉酶、胰蛋白酶的抑制類(lèi)型及其調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用機(jī)制提供依據(jù)，為其功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用提供了參考。

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Inhibitory effects of L-theanine on α-amylase and trypsin

YUANDong-yin1

LONGJun2

GONGZhi-hua1

LINLing1

ZHOUYang1

PENGYing-qi1

XIAOWen-jun1,3

(1.KeyLaboratoryofTeaScienceofEducationalMinistration,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China; 2.QiliBridgeSubdistrictOffice,WillowLakeResort,ChangdeCity,Changde,Hunan415000,China; 3.HunanCollaborativeInnovationCenterforUtilizationofFunctionalIngredientsfromBotanicals,Changsha,Hunan410128,China)

The inhibitory effects ofL-theanine on the activities ofα-amylase and trypsin were studied by establishing the best reaction system and adopting research method on graph in order to provide reference for the deep development ofL-theanine. The results showed that the inhibitory effects ofL-theanine on both enzyme activities were positively associated with its concentration.IC50(26.078 mg/mL) ofL-theanine on the activities ofα-amylase was achieved by prewarming enzyme at a concentration of 0.018 mg/mL in the presence ofL-theanine at 37 ℃ for 5 min before addition of 1% starch and allowing reaction to proceed for 3 min.Kmofα-amylase was 2.247 mg/mL on the premise that the enzyme amount was 18 518.52 U.L-theanine exhibited the half inhibition on trypsin (196.299 mg/mL) by prewarming their mixture at 40 ℃ for 5 min followed by addition of 1% casein as the substrate and permitting the reaction for 15 min. When the amount of enzyme was 1 055 931 U,Kmof trypsin was 5.189 mg/mL. Statistics results showed that the inhibitory effect ofL-theanine on the activity ofα-amylase was superior than that of trypsin.

L-theanine;α-amylase; trypsin; inhibitory effect; glucose and lipid metabolism

湖南省科技廳重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(編號(hào)：2016NK2102)

袁冬寅，女，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。

肖文軍(1969—)，男，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，博導(dǎo)。 E-mail：xiaowenjun88@sina.com

2017—05—04

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.001