不同規(guī)格商品丹參質(zhì)量比較研究△

桑夢如，黃楚璇，吳啟南，樊修和，樂巍，吳達(dá)維，許一鳴

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023)

·中藥工業(yè)·

不同規(guī)格商品丹參質(zhì)量比較研究△

桑夢如，黃楚璇，吳啟南*，樊修和，樂巍，吳達(dá)維，許一鳴

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023)

目的：建立同時測定商品丹參中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮IIA含量的高效液相色譜方法，并對20批不同產(chǎn)地的商品丹參進(jìn)行質(zhì)量評價。方法：收集自浙江、山東、江蘇、河北、河南、四川等不同產(chǎn)區(qū)栽培及野生丹參20批。采用Waters xBridgeTMC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇(A)-0.03%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫；柱溫25 ℃；檢測波長280 nm。通過DPS統(tǒng)計軟件進(jìn)行聚類分析，對20批丹參有效成分含量進(jìn)行綜合評價。結(jié)果：上述9種有效成分在一定范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性的RSD值均小于3%，加樣回收率為95.13%～101.35%。從產(chǎn)地看，河南、山東產(chǎn)丹參質(zhì)量最優(yōu)，四川丹參品質(zhì)亦佳，河北、江蘇、浙江產(chǎn)者次之。直接購自丹參藥材產(chǎn)地者，有效成分含量高于購自藥房者。結(jié)論：不同規(guī)格商品丹參9種有效成分的含量差異較大，其中山東、河南丹參中丹參酮類和丹酚酸成分含量較高。HPLC法同時測定丹參中9種有效成分含量，可更加全面地評價商品丹參的質(zhì)量。

丹參；高效液相色譜法；多成分；含量測定；質(zhì)量評價

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖。氣微，味微苦澀，具有活血祛瘀等功能[1]。現(xiàn)代藥理研究證明，丹參具有抗氧化[2]、抗動脈粥樣硬化[3-4]、抗腫瘤[5]、預(yù)防中風(fēng)[6]、降低血糖[7]、延緩衰老[8]等作用，是目前治療心血管疾病的首選中藥，其臨床治療和用藥安全與原藥材品質(zhì)密切相關(guān)。由于商品丹參種質(zhì)資源復(fù)雜、分布廣、采收加工各異，導(dǎo)致其質(zhì)量差異大，因此，結(jié)合現(xiàn)代分析手段完善丹參的品質(zhì)評價體系具有重要價值。

丹參的主要有效成分分為脂溶性成分和水溶性成分。脂溶性成分主要為丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮等鄰醌型的丹參酮類二萜，此類化合物在丹參中含量較高，且具有較強(qiáng)的生理活性，能夠改善血液循環(huán)、抗菌和抗炎，是丹參的有效組分之一[9]。丹參的水溶性成分主要包括丹參素、丹酚酸A～J、原兒茶醛等酚酸類化合物[10]，其具有抗氧化、抗凝血、抗血栓形成、調(diào)血脂和細(xì)胞保護(hù)作用[11]?；诖?，《中華人民共和國藥典》2000年版、2005年版、2010年版、2015年版一部，丹參項下的規(guī)定分別是：丹參酮ⅡA不低于0.20%，丹參酮ⅡA不低于0.20%、丹酚酸B不低于3.0%，丹參酮類(丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ)的總量不低于0.25%、丹酚酸B不低于3.0%[1，12-14]。該修訂表明，多成分含量測定能有效地評價丹參的品質(zhì)。因此，建立高效液相色譜法同時測定丹參脂溶性成分和水溶性成分含量具有十分重要的意義，將有利于更加全面地評價丹參的質(zhì)量。

1 試藥和儀器

1.1 試藥

對照品：丹酚酸B(批號：YJ-141112)、丹酚酸A(批號：YJ-141204)、丹參素(批號：YJ-141018)、原兒茶醛(批號：YJ-140417)、原兒茶酸(批號：YJ-140320)、丹參酮IIA(批號：YJ-140703)、丹參酮I(批號：YJ-140318)、隱丹參酮(批號：YJ-140809)、二氫丹參酮I(批號：YJ-140810)(江蘇永建醫(yī)藥科技有限公司，規(guī)格為20 mg，純度為HPLC≥98%)。

試劑：甲醇(南京化學(xué)試劑有限公司，批號：14052811206，分析純)；甲醇(江蘇漢邦科技有限公司，批號：150415，色譜純)；乙腈(德國Merck公司，色譜純)；無水乙醇(無錫市亞盛化工有限公司，批號：20150120，分析純)；磷酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：T20100802)；超純水自制。

藥材和飲片：20批收集自浙江、山東、江蘇、河北、河南、四川等不同產(chǎn)區(qū)栽培及野生丹參，均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定，確認(rèn)為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，見表1；丹參對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號：0923-9403)。

表1 20批商品丹參信息表

1.2 儀器

DHG-9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；BT125型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市今城國勝實驗儀器廠)；KH300SP型超聲波提取設(shè)備(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；SAGA-10TY型實驗室級超純水器(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)；Waters 2695型高效液相色譜儀(高精度四元梯度泵，自動進(jìn)樣器)、Waters 2998 PDA檢測器、Waters Empower 色譜工作站、Waters xBridgeTMC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters xBridgeTMC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流動相：甲醇(A)-0.03%磷酸水溶液(B)；流速：1.0 mL·min-1；梯度洗脫：0～7 min：83%B～79%B，7～9 min：79%B～52%B，9～14 min：52%B～50%B，14～15 min：50%B～35%B，15～16 min：35%B～32%B，16～41 min：32%B～30%B，41～46 min：30%B～20%B，46～51 min：20%B～10%B，51～55 min：10%B；檢測器：Waters 2998 PDA檢測器；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：15 μL。

2.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮IIA對照品適量，用甲醇配置成265.0、10.47、24.61、294.1、45.63、46.17、491.3、186.3、248.8 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取樣品約0.2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入24 mL 85%甲醇溶液，70 ℃超聲提取85 min，濾過，濃縮，以甲醇定容至5 mL，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密吸取上述混合對照品溶液1 mL于2 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻。重復(fù)以上步驟，逐級稀釋10次，再將各濃度溶液過0.22 μm微孔濾膜于進(jìn)樣小瓶中。按2.1色譜條件測定各混合對照溶液中上述9種對照品含量，分別求標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

表2 5種酚酸類和4種丹參酮類成分標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 精密吸取上述混合對照品溶液，按2.2項下方法，按2.1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，考察溶液中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮IIA含量，重復(fù)測定6次，并分別計算RSD值，結(jié)果見表3。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 取上述供試品溶液，按2.3供試品溶液項下方法，按2.1色譜條件分別于0、1、3、6、12、24 h測定樣品中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮IIA含量，并計算RSD值，結(jié)果見表3。

2.5.3 重復(fù)性試驗 取同批樣品約0.2 g，共6份，精密稱定，按2.3項下方法，平行制備供試品溶液6份，并按2.1色譜條件”測定樣品中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮IIA含量，并計算RSD值，結(jié)果見表3。

2.5.4 加樣回收率 精密稱取已知含量樣品0.2 g，共6份，按2.3供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，分別加入樣品中已知含量的80%、100%、120% 3個水平的對照品溶液，測定峰面積，計算回收率及RSD值。結(jié)果見表3。

表3 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率試驗結(jié)果

2.6 樣品測定

精密吸取上述混合對照品溶液，按2.2混合對照品溶液的制備方法制備成對照品溶液，按2.1

色譜條件進(jìn)樣，見圖1。取20批樣品粉末各約0.2 g，精密稱定，按2.3供試品溶液的制備方法制備成供試液，按2.1色譜條件進(jìn)樣，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算各批供試品中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A、丹參酮IIA、二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮的含量，色譜圖見圖1，含量結(jié)果見表4。

注：A.混合對照品；B.供試品；1.丹參素；2.原兒茶酸；3.原兒茶醛；4.丹酚酸B；5.丹酚酸A；6.二氫丹參酮I；7.丹參酮I；8.隱丹參酮；9.丹參酮IIA。圖1 丹參高效液相色譜圖

表4 丹參中9種有效成分含量測定結(jié)果(n=3) %

表4表明，商品丹參樣品1、9的丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮IIA總量不符2015版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，分別為0.146%和0.193%，商品丹參樣品3、4、14的丹酚酸B含量未達(dá)到2015版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，分別為1.847%、0.988%和1.307%。樣品1雖為野生商品丹參，但貯存時間過久，部分有效成分含量明顯降低；樣品1、16～20為丹參藥材，而樣品2～15均為丹參飲片，丹參藥材的有效成分含量相對較飲片高。結(jié)合藥材性狀可知，藥材外皮較紅，粉末也較紅，所含丹參酮含量較高；藥材外皮棕紅，粉末棕黃色，所含丹酚酸含量較高。

根據(jù)丹酚酸類和丹參酮類有效成分含量，利用DPS統(tǒng)計軟件對20批商品丹參樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖2。20批丹參樣品可聚為三類，第一類包括8份樣品，此類樣品所含丹酚酸類和丹參酮類有效成分較少；第二類包括6份樣品，此類樣品有效成分含量屬中等；第三類包括6份樣品，此類樣品有效成分含量均較高。由丹酚酸類和丹參酮類的聚類樹狀圖可知，以山東和河南產(chǎn)者為最優(yōu)，四川丹參質(zhì)量亦佳；江蘇、浙江、河北所產(chǎn)丹參的丹參酮類和丹酚酸類成分含量相比之下較低，部分山東產(chǎn)丹參飲片有效成分含量也低，反映中藥產(chǎn)地加工及飲片加工對中藥品質(zhì)產(chǎn)生影響。

圖2 商品丹參丹酚酸類和丹參酮類有效成分含量的聚類樹狀圖

3 分析討論

3.1 提取條件的選擇

在實驗前期通過均勻設(shè)計法對丹參的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，考察了甲醇、乙醇兩種溶劑濃度(50%～100%)、固液比(1∶120～1∶270)、提取時間(15～90 min)、提取溫度(20～70 ℃)，回流和超聲兩種提取方式對提取效率的影響，從最佳的4個提取工藝方案中根據(jù)加權(quán)評分選擇最優(yōu)者，即120倍量85%甲醇溶液，70 ℃超聲提取85 min。

3.2 結(jié)果分析

含量測定結(jié)果顯示，外表較紅的丹參商品丹參酮類成分含量較高，而粉末偏深棕的商品丹酚酸類成分含量較高。可見，傳統(tǒng)鑒別手段可以一定程度的判斷丹參商品的質(zhì)量優(yōu)劣。由本實驗結(jié)果可知，產(chǎn)地采購藥材的9種有效成分含量均高于飲片，原因可能一是丹參飲片的炮制加工造成有效成分的流失；二是包裝儲藏不當(dāng)，在儲藏過程中有效成分降低。因儲藏受潮會導(dǎo)致丹參中水溶性成分的溶解，儲存時間的延長會導(dǎo)致有效成分含量降低。張卓能等[15]發(fā)現(xiàn)，隨著丹參藥材儲存時間的增加，其中的丹酚酸B和丹參酮ⅡA含量均呈下降趨勢，儲存時間為9個月時基本達(dá)到最小值。

從含量測定和聚類分析結(jié)果也可看出，市面上流通的丹參藥材及飲片質(zhì)量參差不齊。呂文海等[16]也在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，相當(dāng)多市面上銷售的丹參藥材中丹參酮IIA含量不符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。潘英妮等[17]用高效液相色譜法考察30批國產(chǎn)丹參質(zhì)量，以丹酚酸B含量為指標(biāo)，6批樣品達(dá)不到2005版《中華人民共和國藥典》要求，占總樣品數(shù)的20%；以丹參酮IIA含量為指標(biāo)，20批樣品達(dá)不到2005版《中華人民共和國藥典》要求，占總樣品數(shù)的67%。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，供試品溶液存放一段時間后(48 h以上)，丹酚酸B明顯下降，丹參素含量增高，有文獻(xiàn)報道丹酚酸B遇熱可能發(fā)生酯水解或苯并呋喃開環(huán)，丹參素、原兒茶醛等含量升高[18-19]，故規(guī)范實驗操作十分重要。

3.3 展望

丹參作為大宗藥材，目前雖已形成商品規(guī)格，但其產(chǎn)區(qū)廣泛、栽培年限與產(chǎn)地采收加工與炮制方法參差不齊，導(dǎo)致商品質(zhì)量的差異很大，這將嚴(yán)重影響丹參臨床用藥的有效性和安全性。因此，制定好丹參藥材全國適宜生產(chǎn)區(qū)劃，開展丹參產(chǎn)地加工與飲片生產(chǎn)一體化研究，同時對其包裝、貯藏運(yùn)輸適宜條件開展研究，確定丹參藥材、飲片的有效期十分重要。

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QualityComparationofVariousCommercialProductsofSalviaeMiltiorrhizaeRadixetRhizoma

SANGMengru，HUANGChuxuan，WUQinan*，F(xiàn)ANXiuhe，YUEWei，WUDawei，XUYiming

(Collegeofpharmacy，NanjingUniversityofChineseMedicine，CollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，NationalandLocalCollaborativeEngineeringCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationandFormulaeInnovativeMedicine，Nanjing210023，China)

Objective：The study is aimed to establish an HPLC method for simultaneous determination of tanshinol，protocatechuic acid，protocatechualdehyde，salvianolic acid B，salvianolic acid A，dihydrotanshinone I，tanshinone I，cryptotanshinone and tanshinone IIAin commercial products of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma (CPSMR)，and evaluate the qualities of 20 samples from different specifications of CPSMR.Methods：20 batches ofS.miltiorrhizawere collected from Zhejiang，Shandong，Jiangsu，Hebei，Henan，Sichuan and other habitats.The determination was performed on a Waters xBridgeTMC18column(250 mm×4.6 mm，5 μm)with a gradient mobile phase consisting of methanol(A)-0.03% phosphoric acid solution(B)at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The column temperature was 25 ℃ and the detection wavelength was 270 nm.Cluster analysis was conducted with DPS software for comprehensive quality evaluation of 20 batches of CPSMR.Results：All the 9 effective constituents showed good linearity.The RSD of the precision，repeatability and stability tests were less than 3%.The average recoveries were in the range of 95.13%-101.35%.In view of habitats，CPSMR from Sichuan province were better than those from Hebei，Jiangsu and Zhejiang province.CPSMR from Henan and Shandong have the samples purchased from pharmacies.Conclusion：The contents of 9 effective constituents are different among Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma of differet specifications in markets from various habitats.SMRR products from Shandong and Henan have higher contents of tanshinones and salvianolic acids.HPLC can be used for the simultaneous determination of 9 effective constituents in SMRR products，which could be applied for the comprehensive quality evaluation of SMRR products.

Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma；HPLC；multicomponent；content determination；quality evaluation

2016-03-31)

江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目(2014)；國家公益性行業(yè)專項(201407002)；國家公共衛(wèi)生行業(yè)專項(2014002)

*

吳啟南，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥資源生產(chǎn)與品質(zhì)評價；Tel：(025)85811507，E-mail：qnwyjs@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.3.025