珠子參藥材中皂苷類成分的薄層色譜及HPLC特征圖譜研究△

張海元，夏偉軍，謝佳穎，唐夢(mèng)云，張英杰，崔蓉，梅雙喜，楊立國(guó)

(云南省藥物研究所 云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心 云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111)

·中藥基礎(chǔ)·

珠子參藥材中皂苷類成分的薄層色譜及HPLC特征圖譜研究△

張海元，夏偉軍，謝佳穎，唐夢(mèng)云，張英杰，崔蓉，梅雙喜，楊立國(guó)*

(云南省藥物研究所 云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心 云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111)

目的：建立和完善珠子參藥材的薄層色譜及HPLC特征圖譜鑒別方法。方法：采用薄層色譜法鑒別珠子參藥材中皂苷類成分；采用HPLC法對(duì)同一產(chǎn)地不同地塊的10批次珠子參藥材皂苷類成分進(jìn)行指紋圖譜分析，選用Waters XTerra MS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脫，分析時(shí)間為55 min，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。結(jié)果：珠子參藥材的薄層色譜中皂苷類成分分離度好，斑點(diǎn)清晰，專屬性強(qiáng)，同時(shí)建立了珠子參皂苷類成分的HPLC特征圖譜方法。結(jié)論：薄層色譜及HPLC特征圖譜方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，為珠子參藥材的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

珠子參，皂苷成分，薄層色譜，HPLC特征圖譜

五加科植物珠子參PanaxjaponicusC.A.Mey.var.major(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng主產(chǎn)于四川、云南、貴州、陜西、甘肅、西藏等地，其干燥根莖入藥，又名扣子七、紐子七、珠兒參。珠子參具有補(bǔ)肺、養(yǎng)陰、活絡(luò)、止血功效，主要用于氣陰兩虛、煩熱口渴、虛勞咳嗽、跌撲損傷、關(guān)節(jié)疼痛、咳血、外傷出血等癥的治療[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，珠子參化學(xué)成分為皂苷、多糖、氨基酸和多種微量元素[3-7]，其中皂苷類成分為珠子參主要活性成分，藥理實(shí)驗(yàn)表明皂苷類成分具有鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、提高免疫力、抗腫瘤等活性[8-11]，珠子參的質(zhì)量控制大多用薄層法鑒別竹節(jié)參皂苷Ⅳa和人參皂苷Ro[12]、高效液相色譜法測(cè)定竹節(jié)參皂苷Ⅳa和人參皂苷Ro[13-15]，而對(duì)珠子參其他皂苷類成分的文獻(xiàn)報(bào)道較少，因此，本研究室對(duì)珠子參中皂苷成分開(kāi)展了進(jìn)一步的研究。

珠子參作為“金品”系列產(chǎn)品痛舒膠囊、痛舒片的重要原料之一[16]，藥材需求量逐年增加，為此，本研究所開(kāi)展了珠子參野生資源調(diào)查并實(shí)施規(guī)范化移植繁育試驗(yàn)，最終形成了珠子參規(guī)?；N植基地，但由于藥材受氣候等生態(tài)環(huán)境的影響，不同批次藥材所含化學(xué)成分較難控制[17]，所以我們運(yùn)用薄層色譜鑒別及HPLC特征圖譜對(duì)同一產(chǎn)地不同地塊的10批次珠子參藥材進(jìn)行考察，為珠子參藥材質(zhì)量的有效控制奠定了方法基礎(chǔ)。

1 儀器及材料

1.1 材料

人參皂苷Ro(批號(hào)：111903-201302)，竹節(jié)參皂苷Ⅳa(批號(hào)：111861-201102)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，虎刺蔥木皂苷Ⅵ[18]、竹節(jié)參皂苷Ⅳ[19]、竹節(jié)參皂苷Ⅰb[19]為本研究室自制。珠子參PanaxjaponicusC.A.Mey.var.major(Burk.) C.Y.Wu et K.M.Feng采自云南麗江種植基地，經(jīng)云南省藥物研究所邱斌高級(jí)工程師鑒定為正品，標(biāo)本保存于云南省藥物研究所標(biāo)本室，共采集了10批珠子參藥材，編號(hào)為S1～S10。

1.2 試劑

乙腈(色譜級(jí)，Merck公司)，去離子水(色譜級(jí)Milli-Q純化)，其他試劑均為分析純。

1.3 儀器

UltiMate 3000高效液相色譜儀(LC-20AT四元泵、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣儀、CTO-20A柱溫箱、SPD-M20A紫外檢測(cè)器)；超聲波清洗器SK8200 HP(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；METTLER-TOLEDO AG-285型電子分析天平[METTLER-TOLEDO(上海)有限公司]；硅膠G[薄層層析用，Meck化工技術(shù)(上海)有限公司]。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜研究

2.1.1 藥材供試品及對(duì)照品溶液的制備 取珠子參藥材粉末1.0 g，加甲醇10 mL，超聲處理(53 kHZ，400 W)40 min，放冷，過(guò)濾，濾液回收溶劑至干，殘?jiān)铀?0 mL加熱使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，回收至干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。精密稱取竹節(jié)參皂苷Ⅳa、人參皂苷Ro、虎刺蔥木皂苷Ⅵ、竹節(jié)參皂苷Ⅳ、竹節(jié)參皂苷Ⅰb對(duì)照品4.0 mg，分別加入甲醇4 mL超聲溶解制成1.0 mg·mL-1對(duì)照品溶液。

2.1.2 薄層色譜鑒別 分別吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各2 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層色譜板上，以正丁醇-乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(5∶10∶1.2∶1.1∶4.5)上層液為展開(kāi)劑，預(yù)飽和15 min展開(kāi)，展距10 cm，取出晾干，以10%硫酸乙醇溶液噴霧顯色，105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰，置365 nm紫外燈下觀察，見(jiàn)圖1。

注：1.竹節(jié)參皂苷Ⅳa；2.竹節(jié)參皂苷Ⅳ；3.竹節(jié)參皂苷Ⅰb；4.珠子參藥材；5.人參皂苷Ro；6.虎刺蔥木皂苷Ⅵ。圖1 珠子參及對(duì)照品TLC圖

分別從不同薄層板、不同展距、不同飽和時(shí)間、不同溫度、不同濕度方面驗(yàn)證珠子參藥材的薄層鑒別條件，1)薄層色譜板分別選取青島海洋硅膠G板、默克硅膠G板、鼎康硅膠G板；2)不同展距：8、10、12 cm；3)不同預(yù)飽和時(shí)間：0、15、30 min；4)不同溫度：4、25、32 ℃；5)不同濕度：18%、58%、72%。以上各條件下的展開(kāi)效果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，除不同硅膠色譜板與不同飽和時(shí)間對(duì)珠子參中皂苷類成分的分離度有較明顯的影響外，其他條件下影響較小，確定珠子參藥材薄層色譜鑒別條件為：吸取珠子參供試品溶液及各對(duì)照品溶液2 μL(接觸點(diǎn)樣)點(diǎn)于默克硅膠G薄層色譜板上，以正丁醇-乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(5∶10∶1.2∶1.1∶4.5)上層為展開(kāi)劑(15 mL)，預(yù)飽和薄層色譜板15 min，上行展開(kāi)，展距10 cm，溫度25 ℃，濕度58%，取出，晾干，以10%硫酸乙醇溶液噴霧顯色后，105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰，在365 nm紫外燈下檢視，10批不同批次的珠子參皂苷類成分與混合對(duì)照品溶液的薄層色譜見(jiàn)圖2。

圖2 不同批次珠子參藥材及混合對(duì)照品TLC圖

2.2 HPLC特征圖譜研究

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters XTerra MS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(B)-0.2%磷酸水(A)；梯度洗脫：0～10 min，25%～30% B；10～20 min，30% B；20～30 min，30%～33% B；30～42 min，33% B；42～45 min，33%～25% B；45～50 min，25% B；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：25 ℃；體積流量：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱取珠子參粉末(過(guò)五號(hào)篩)約0.1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入65%乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(53 kHZ，400 W)40 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用65%乙醇水溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)。濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取各對(duì)照品適量，分別置于25 mL棕色量瓶中，用適量65%乙醇水溶液溶解并稀釋至刻度，分別制成含竹節(jié)參皂苷Ⅳa 280.0 μg·mL-1、人參皂苷RO280.5 μg·mL-1、虎刺蔥木皂苷Ⅵ 281.1 μg·mL-1、竹節(jié)參皂苷Ⅰb 280.7 μg·mL-1、竹節(jié)參皂苷Ⅳ 280.6 μg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)即得。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，檢測(cè)指紋圖譜，計(jì)算主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果表明各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.2%，相對(duì)峰面積的RSD<0.5%，表明本儀器的精密度良好。

2.2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品6份，按2.2.2項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣后進(jìn)行分析，檢測(cè)指紋圖譜，計(jì)算主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果表明各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.2%，相對(duì)峰面積的RSD<1.0%，表明該分析方法重復(fù)性良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，檢測(cè)指紋圖譜，計(jì)算主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果表明各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.2%，相對(duì)峰面積的RSD<2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 HPLC特征圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

2.2.5.1 共有峰指認(rèn) 將10批同一產(chǎn)地不同地塊收集的珠子參藥材分別按照2.2.2項(xiàng)制成供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，得到各樣品的HPLC特征圖譜。同時(shí)精密吸取對(duì)照品溶液適量，按2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣10 μL，參照5個(gè)對(duì)照品的色譜行為及其DAD檢測(cè)紫外光譜圖，在樣品色譜圖上對(duì)其峰進(jìn)行指認(rèn)，確認(rèn)了5個(gè)成分，其中1號(hào)峰為虎刺蔥木皂苷Ⅵ，2號(hào)峰為人參皂苷Ro，3號(hào)峰為竹節(jié)參皂苷Ⅰb，4號(hào)峰為竹節(jié)參皂苷Ⅳ，5號(hào)峰為竹節(jié)參皂苷Ⅳa，見(jiàn)圖3。

注：1.虎刺蔥木皂苷Ⅵ；2.人參皂苷Ro；3.竹節(jié)參皂苷Ⅰb；4.竹節(jié)參皂苷Ⅳ；5.竹節(jié)參皂苷Ⅳa。圖3 珠子參HPLC圖

2.2.5.2 相似度計(jì)算 將所得指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A)”，計(jì)算各樣品指紋圖譜(見(jiàn)圖4)與生成的對(duì)照?qǐng)D譜的相似性系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。從各批藥材的HPLC 特征圖譜與相似性系數(shù)都可以看出，不同批次珠子參藥材特征圖譜相似度均大于0.95，表明同一產(chǎn)地不同地塊的珠子參藥材的化學(xué)組成十分相似。

注：R.對(duì)照；S1～S10.批次。圖4 不同批次珠子參藥材HPLC特征圖譜

表1 10批珠子參藥材的相似度結(jié)果

3 討論

3.1 薄層色譜

該法與《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部珠子參項(xiàng)下的薄層色譜鑒別方法相比較，能更加客觀、準(zhǔn)確、全面地反映珠子參藥材的質(zhì)量。先前相關(guān)文獻(xiàn)主要通過(guò)人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa對(duì)珠子參藥材進(jìn)行鑒別，忽略了其余3個(gè)主要皂苷成分，不能全面地評(píng)價(jià)珠子參藥材的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)珠子參藥材的薄層鑒別方法進(jìn)行了完善，對(duì)進(jìn)一步評(píng)價(jià)珠子參藥材的質(zhì)量具有一定指導(dǎo)意義。

3.2 HPLC特征圖譜色譜條件的優(yōu)化

嘗試多種流動(dòng)相體系，甲醇-水，乙腈-水，乙腈-磷酸水體系，結(jié)果表明，乙腈-0.2%磷酸水體系分離的效果較好，分析時(shí)采用梯度洗脫，分析條件如2.2.1項(xiàng)下所示，峰分離度較好，保留時(shí)間適中。

本實(shí)驗(yàn)建立了珠子參藥材的HPLC指紋圖譜，相對(duì)于已有的圖譜分離度更好、指紋性更強(qiáng)，且對(duì)5個(gè)共有性指標(biāo)成分進(jìn)行了指認(rèn)，該方法簡(jiǎn)便、快速，可用于珠子參藥材的質(zhì)量控制，為實(shí)現(xiàn)珠子參藥材規(guī)范化種植及質(zhì)量的均一、穩(wěn)定奠定了方法基礎(chǔ)。

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StudyonTLCandHPLCFingerprintsofSaponinConstituentsfromtheRootsofPanaxjaponicusvar.major

ZHANGHaiyuan，XIAWeijun，XIEJiaying，TANGMengyun，ZHANGYingjie，CUIRong，MEIShuangxi，YANGLiguo*

(YunnanInstituteofMateriaMedica，YunnanBaiYaoGroupInnovationandR&DCenter，YunnanProvinceCompanyKeyLaboratoryforTCMandEthnicDrugofNewDrugCreation，Kunming650111，China)

Objective：To establish and improve the TLC and HPLC fingerprint methods for identification of the roots ofPanaxjaponicusvar.major.Methods：The TLC method was adopted to distinguish saponin constituents of the roots ofP.japonicusvar.major.A separation was performed on a Waters XTerra MS C18chromatographic column(250 mm×4.6 mm，5 μm)with gradient elution.The mobile phase consisted of acetonitrile-phosphoric acid water solution(0.2%).The analysis time was 55 min and the detection wavelength was 203 nm.Results：The TLC separation degree was good，the separated spots were clear with specific attribute，and the HPLC fingerprints of saponin constituents of the roots ofP.japonicusvar.majorwas set up.Conclusion：The TLC and HPLC fingerprint methods are stable，accurate，reliable，and can provide a scientific basis for the quality control of the roots ofP.japonicusvar.major.

The roots ofPanaxjaponicusvar.major；saponins；TLC；HPLC fingerprints

2016-06-16)

云南省科技領(lǐng)軍人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(2014HA001)

*

楊立國(guó)，工程師，博士，研究方向：天然藥物化學(xué)；E-mail：yangliguo5366@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.3.011