鐵皮石斛新品種“仙斛3號(hào)”的選育及特征特性研究△

徐靖，王曉彤，胡凌娟，李明焱，邵清松，賈宸

(1.浙江壽仙谷醫(yī)藥股份有限公司，浙江 武義 321200；2.浙江省珍稀植物藥工程技術(shù)研究中心，浙江 武義 321200；3.金華壽仙谷藥業(yè)有限公司，浙江 武義 321200；4.浙江農(nóng)林大學(xué) 中藥學(xué)科，浙江 杭州 311300)

·專題·

鐵皮石斛新品種“仙斛3號(hào)”的選育及特征特性研究△

徐靖1，2*，王曉彤3，胡凌娟3，李明焱1，2，邵清松4，賈宸4

(1.浙江壽仙谷醫(yī)藥股份有限公司，浙江 武義 321200；2.浙江省珍稀植物藥工程技術(shù)研究中心，浙江 武義 321200；3.金華壽仙谷藥業(yè)有限公司，浙江 武義 321200；4.浙江農(nóng)林大學(xué) 中藥學(xué)科，浙江 杭州 311300)

目的：在以往研究工作基礎(chǔ)上，選育出鐵皮石斛優(yōu)良品種，促進(jìn)鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。方法：通過雜交、誘變、篩選等方法，選育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的鐵皮石斛新品種。結(jié)果：獲得了適應(yīng)性及抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高的鐵皮石斛新品種“仙斛3號(hào)”。與對(duì)照品種“新黑”、“仙斛1號(hào)”比較，“仙斛3號(hào)”新鮮莖葉、莖產(chǎn)量以及浸出物含量均顯著高于對(duì)照品種。SSR分子標(biāo)記分析表明“仙斛3號(hào)”與石斛屬其他品種(系)存在明顯遺傳差異。結(jié)論：“仙斛3號(hào)”是繼“仙斛2號(hào)”之后又一個(gè)鐵皮石斛新品種，為鐵皮石斛的合理開發(fā)利用與保護(hù)提供方向與依據(jù)。

鐵皮石斛；仙斛3號(hào)；SSR標(biāo)記；選育；特征特性

鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo 屬蘭科多年生附生草本植物，主要產(chǎn)于浙江、四川、云南、貴州等地[1]?！侗静菥V目》稱其具有“強(qiáng)陰益精，厚腸胃，補(bǔ)內(nèi)絕不足，長(zhǎng)肌肉，益智除驚，輕身延年”的作用[2]。但是鐵皮石斛自然繁殖率低，對(duì)環(huán)境要求較高，長(zhǎng)期以來(lái)遭受人類過度采集，其野生資源匱乏[3]。1987年國(guó)務(wù)院將鐵皮石斛列入野生藥材重點(diǎn)保護(hù)物種，禁止流通貿(mào)易，鐵皮石斛因此成為具極高附加值的非主要農(nóng)作物(中藥材)種類[4]。研究表明，鐵皮石斛中含有大量的多糖，具有較強(qiáng)的抗腫瘤和增強(qiáng)免疫力功能[5-7]。研究團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期以來(lái)從事鐵皮石斛種質(zhì)資源收集、評(píng)價(jià)、新品種選育工作，先后選育出“仙斛1號(hào)”、“仙斛2號(hào)”等鐵皮石斛新品種。本研究以“仙斛1號(hào)”(作父本)和“514”號(hào)”(作母本)雜交得到F1代蒴果進(jìn)行航天搭載，并對(duì)誘變蒴果進(jìn)行人工篩選，獲得了一個(gè)新的鐵皮石斛新品種“仙斛3號(hào)”，該品種于2016年1月通過了浙江省非主要農(nóng)作物審定，本文主要對(duì)該品種的特征特性進(jìn)行詳細(xì)的研究，以便為其更大范圍的推廣種植提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以“新黑”和本單位選育并通過認(rèn)定的“仙斛1號(hào)”為對(duì)照品種開展品比試驗(yàn)?！跋甚?號(hào)”為試驗(yàn)對(duì)象，其來(lái)源為2005～2008年以“仙斛1號(hào)”作為父本和“514號(hào)”為母本雜交得到的蒴果F1M514，經(jīng)航天搭載得到航天誘變蒴果H-F1M514，經(jīng)無(wú)菌播種、組織培養(yǎng)、篩選所得(見圖1)。

圖1 “仙斛3號(hào)”植株

1.2 試驗(yàn)材料擴(kuò)繁及栽培

參照李明焱等[2]研究報(bào)道，組織培養(yǎng)采用改良的MS培養(yǎng)基，以莖段和種子為組織培養(yǎng)外植體。4～6月份移栽組培苗，以食用菌廢料、木屑、石粉、菜餅等按一定比例混合、發(fā)酵為栽培基質(zhì)，采用叢栽方法，每叢3～4株苗，行距為20 cm×15 cm，移栽后加強(qiáng)濕度控制，促進(jìn)根部生長(zhǎng)，提高成活率。同時(shí)加強(qiáng)棚內(nèi)溫度、濕度、光照、空氣、基質(zhì)含水量及病蟲害的管理，促其正常生長(zhǎng)。

1.3 品比試驗(yàn)

以“新黑”和“仙斛1號(hào)”作為對(duì)照品種，在杭州(浙江中信藥用植物種業(yè)有限公司杭州基地)、建德(杭州小香生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司建德基地)、武義(金華壽仙谷藥業(yè)有限公司源口種植基地)各設(shè)一個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)重復(fù)3小區(qū)，每小區(qū)面積9 m2。移栽定植后，分別隔12個(gè)月、24個(gè)月、36個(gè)月，從每小區(qū)隨機(jī)取3叢鐵皮石斛用于測(cè)定產(chǎn)量、灰分、浸出物、峰面積比和石斛多糖、甘露糖含量。產(chǎn)量測(cè)定時(shí)，比較新鮮莖葉產(chǎn)量，同時(shí)去葉比較新鮮莖的產(chǎn)量。石斛多糖含量測(cè)定參照《中華人民共和國(guó)藥典》方法[8]，計(jì)算干品多糖百分率。

1.4 顯微結(jié)構(gòu)分析

以“仙斛3號(hào)”新鮮莖、葉為材料，采用石蠟切片技術(shù)制作植物組織切片；新鮮的葉鞘制備成水封片。采用固綠和番紅染色，中性樹膠封片，然后在高倍顯微鏡下進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)觀察并攝像。

1.5 SSR分子標(biāo)記

為鑒別“仙斛3號(hào)”與其他鐵皮石斛在DNA水平上的差異，采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行了分析。選用“仙斛3號(hào)”及其他13種石斛屬的新鮮嫩葉為實(shí)驗(yàn)材料，采用QIAGENE提取試劑盒從葉片中提取DNA。PCR結(jié)果應(yīng)用Quantity one軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 “仙斛3號(hào)”的植物學(xué)形態(tài)特征

“仙斛3 號(hào)”莖圓柱形，長(zhǎng)約8～21 cm，粗約2～6 mm，不分枝，具多節(jié)，節(jié)間長(zhǎng)約0.8～1.4 cm，常在中部以上互生6～12枚葉。質(zhì)地堅(jiān)脆，易折斷，斷面綠色，呈細(xì)顆粒黏質(zhì)狀物。葉片稍帶肉質(zhì)，長(zhǎng)圓狀披針形，長(zhǎng)約2～7 cm，寬約0.8～2.2 cm，先端鈍并且在葉尖部鉤轉(zhuǎn)，基部下延為抱莖的鞘，邊緣和中肋常帶紫色斑點(diǎn)。葉鞘初生時(shí)與莖包裹嚴(yán)密，老時(shí)其上緣與莖松離而張開，變?yōu)榛野咨べ|(zhì)，棱條更明顯，紫色斑點(diǎn)漸褪去。有時(shí)葉鞘頂部邊緣可超出上一莖節(jié)?？偁罨ㄐ蛏诼淞巳~的老莖上部，具3～5朵花，花序軸長(zhǎng)約4～6 cm，稍回折狀彎曲。唇瓣黃白色，基部具1個(gè)綠色或黃色的胼胝體，卵狀披針形，比萼片稍短，中部反折，先端急尖，不明顯3裂，中部以下兩側(cè)具紫紅色條紋；唇盤密布細(xì)乳突狀的毛，并且在中部以上具1個(gè)紫紅色斑點(diǎn)。

2.2 “仙斛3號(hào)”的產(chǎn)量及品質(zhì)表現(xiàn)

2011—2013年，在浙江杭州市、建德市、武義縣3地進(jìn)行了兩輪連續(xù)3年的品種比較試驗(yàn)，分別測(cè)定了移栽后12個(gè)月、24個(gè)月、36個(gè)月的新鮮莖葉產(chǎn)量。結(jié)果表明，“仙斛3號(hào)”12個(gè)月3地兩輪平均新鮮莖葉產(chǎn)量為0.659 kg·m-2，比對(duì)照品種“新黑”和“仙斛1號(hào)”分別增產(chǎn)52.10%和 20.91%；24個(gè)月3地兩輪平均新鮮莖葉生長(zhǎng)量為2.515 kg·m-2，比對(duì)照品種“新黑”和“仙斛1號(hào)”分別增產(chǎn)65.57%和17.74%；36個(gè)月3地兩輪平均新鮮莖葉生長(zhǎng)量為3.205 kg·m-2，比對(duì)照品種“新黑”和“仙斛1號(hào)”分別增產(chǎn)50.33%和26.80%，且均顯著高于對(duì)照品種“新黑”和“仙斛1號(hào)”，見表1。

在實(shí)驗(yàn)中通過匯總灰分、浸出物、多糖、甘露糖、峰面積比來(lái)比較“仙斛3號(hào)”與對(duì)照品種品質(zhì)的區(qū)別。結(jié)果表明，“仙斛3號(hào)”灰分和甘露醇均顯著高于對(duì)照品種“新黑”和“仙斛1號(hào)”；“仙斛3號(hào)”灰分兩輪平均為5.346%，較“新黑”和“仙斛1號(hào)”分別增加16.73%和26.84%。浸出物兩輪平均為13.845%，較“新黑”和“仙斛1號(hào)”分別增加58.43%和67.47%。多糖和甘露糖含量均顯著低于對(duì)照品種“新黑”和“仙斛1號(hào)”。多糖含量?jī)奢喥骄鶠?3.410%，較“新黑”和“仙斛1號(hào)”分別減少18.65%和10.4%。甘露醇含量?jī)奢喥骄鶠?1.753%，較“新黑”和“仙斛1號(hào)”分別減少29.54%和16.06%。兩輪三地試驗(yàn)結(jié)果表明，“仙斛3號(hào)”各項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)均符合《中華人民共和國(guó)藥典》要求，見表2。

表1 “仙斛3號(hào)”與“新黑”和“仙斛1號(hào)”鮮品產(chǎn)量比較 kg·m-2

注：相同小寫字母表示同列數(shù)據(jù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；不同小寫字母表示同列數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；下同。

表2 “仙斛3號(hào)”與對(duì)照品種品質(zhì)比較

2.3 “仙斛3號(hào)”的顯微結(jié)構(gòu)

莖切片結(jié)果顯示：1)表皮細(xì)胞由1列細(xì)胞組成，扁平，外被黃色角質(zhì)層，邊緣呈不規(guī)則波狀。每2個(gè)波狀中夾有一個(gè)深波狀彎曲，外層可見無(wú)色的薄壁細(xì)胞組成的葉鞘層。2)基本薄壁組織細(xì)胞呈多角形，大小不一，占據(jù)莖橫切面的絕大部分，薄壁細(xì)胞長(zhǎng)約23～85 μm，寬約7～47 μm，多數(shù)維管束散在其間。3)維管束為有限外韌型，維管束橫截面面積約為3850 μm2，略排成3～5圈，其中纖維細(xì)胞直徑約為4～6 μm。見圖2。

圖2 “仙斛3號(hào)”莖橫切面石蠟切片顯微結(jié)構(gòu)圖

葉鞘顯微鑒定結(jié)果：葉上表皮排列緊密，多角形，壁薄，增厚不明顯；上表皮細(xì)胞長(zhǎng)約為56～81 μm、寬約為45～48 μm。上表皮無(wú)氣孔(見圖3A、3B)。下表皮排列緊密，長(zhǎng)方形，呈行排列，壁增厚；下表皮細(xì)胞長(zhǎng)約為30～66 μm、寬約為12～29 μm；氣孔分布松散，呈腎形，在230～470 μm2面積內(nèi)分布3個(gè)氣孔，氣孔長(zhǎng)度約為24 μm、寬度約為16 μm，氣孔指數(shù)為16%(見圖3C、3D)。葉鞘細(xì)胞排列緊密不規(guī)則，形狀多種，增厚不明顯；可見紫色斑點(diǎn)，成群散列分布。葉鞘細(xì)胞長(zhǎng)度約為21～40 μm，寬約為19～30 μm(見圖3E、3F)。

注：A.葉上表皮(×100)；B.葉上表皮(×400)；C.葉下表皮(×100)；D.葉下表皮(×400)；E.葉鞘細(xì)胞(×100)；F.葉鞘細(xì)胞(×200)。圖3 “仙斛3號(hào)”葉及葉鞘水封片顯微結(jié)構(gòu)圖

2.4 “仙斛3號(hào)”與其他鐵皮石斛的SSR分子標(biāo)記分析

采用QIAGENE提取試劑盒從葉片中提取DNA，采用穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、共顯性的SSR分子標(biāo)記方法，從公開發(fā)表的鐵皮石斛基因組特異的SSR 分子標(biāo)記中進(jìn)行篩選。經(jīng)過篩選，獲得可以完全區(qū)分“仙斛3號(hào)”的3個(gè)多態(tài)性條帶豐富的SSR分子標(biāo)記：OA15、XML003和XML006(見表3)。結(jié)果表明，采用OA15和XML003兩個(gè)分子標(biāo)記能夠?qū)ⅰ跋甚? 號(hào)”(編號(hào)1)與其他樣品區(qū)分開，而其他樣品之間的差異可以從OA15、XML003、XML006 3個(gè)分子標(biāo)記中區(qū)分(見圖4)。從帶型分析，OA15基本上可以將“仙斛3號(hào)”與石斛屬的其他種區(qū)分開。因此，從這兩個(gè)SSR分子標(biāo)記的PCR結(jié)果可以看出“仙斛3號(hào)”在遺傳上具有特異性，區(qū)別于石斛屬的其他種。

表3 區(qū)分“仙斛3號(hào)”與其他13份石斛屬材料的SSR分子標(biāo)記

注：A.OA15；B.XML003；C.XML006；M.Marker。圖4 “仙斛 3 號(hào)”及其他13份石斛屬材料SSR分子標(biāo)記分析

3 討論

野生鐵皮石斛由于生長(zhǎng)條件苛刻，自然產(chǎn)量極為稀少，更因民間長(zhǎng)期過度采挖，致使野生資源瀕臨絕種。我國(guó)目前的石斛栽培生產(chǎn)仍然處于起步階段，產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景十分廣闊[2]?！跋甚?號(hào)”是繼“仙斛1號(hào)”后選育的第3個(gè)鐵皮石斛品種。從品種比較試驗(yàn)可以看出，“仙斛3號(hào)”具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)；綜合性狀與“新黑”和“仙斛1號(hào)”有明顯差異；在產(chǎn)量上，明顯優(yōu)于“仙斛1號(hào)”；其干品石斛多糖和甘露糖含量要低于“新黑”和“仙斛1號(hào)”。鐵皮石斛的品質(zhì)指標(biāo)目前主要按照《中華人民共和國(guó)藥典》的要求，比較多糖和甘露糖含量，“仙斛3號(hào)”多糖和甘露糖的含量均符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定[8]。顯微結(jié)構(gòu)鑒定是生物學(xué)鑒定的常用手段，本研究的顯微結(jié)構(gòu)鑒定與文獻(xiàn)描述一致，可以認(rèn)為“仙斛3號(hào)”具有鐵皮石斛典型結(jié)構(gòu)特征。PCR結(jié)果可以看出“仙斛3號(hào)”在遺傳上具有特異性，區(qū)別于石斛屬的其他種?！跋甚?號(hào)”的培育，對(duì)鐵皮石斛在健康產(chǎn)業(yè)方面的發(fā)展，具有重大的推動(dòng)意義，它為鐵皮石斛種植提供了更多的選擇，同時(shí)為石斛產(chǎn)業(yè)提供了品質(zhì)的保證。

[1] 謝偉杰，張永萍，徐劍，等.鐵皮石斛現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥，2016，36(4)：87-91.

[2] 李明焱，謝小波，朱惠照，等.鐵皮石斛新品種“仙斛1號(hào)”的選育及其特征特性研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2011，28(4)：281-284.

[3] 白音，包英華，金家興，等.我國(guó)藥用石斛資源調(diào)查研究[J].中草藥，2006，37(9)：4-5.

[4] 順慶生.中藥石斛的新資源——齒瓣石斛(紫皮)[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2011，13(11)：23-24.

[5] Chen X M，Wang C L，Wang A R，et al.Study on polysaccharides in Dendrobium officinale protocorm[J].Chinese Pharmaceutical Journal，2011，46(20)：1552-1556.

[6] 李明焱，王瑛，鄭化先，等.鐵皮石斛新品種“仙斛2號(hào)”的選育和特征特性研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2013，48(19)：1677-1680.

[7] 羅宇琴，肖蘇萍，趙潤(rùn)懷，等.霍山石斛與鐵皮石斛對(duì)比研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2016，18(8)：1067-1070.

[8] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：282-283.

BreedingofDendrobiumofficinalevar.“Xianhu3”andItsCharacteristics

XUJing1，2*，WANGXiaotong3，HULingjuan3，LIMingyan1，2，SHAOQingsong4，JIAChen4

(1.ZhejiangShouxianguPharmaceuticalCo.Ltd，Wuyi321200，China；2.ZhejiangEngineeringResearchCenterofRarePlantMedicine，Wuyi321200，China；3.JinhuaShouxianguPharmaceuticalCo.Ltd.，Wuyi321200，China；4.DepartmentofTraditionalChineseMedicine，ZhejiangA&FUniversity，Hangzhou311300，China)

Objective：To select and breed elite variety ofDendrobiumofficinaleon the basis of previous research work，thus to promote the healthy developing ofD.officinaleindustry.Methods：Hybridization，mutagenesis，screening etc.was employed for the breeding of high yeild and high quality，new variety developedD.officinale.Results：The adaptability and strong resistance，Dendrobiumnew varieties of high yield “Xianhu 3 ”.Compared with the control variety “Xinhei”，“Xianhu 1”，“Xianhu 3 ” fresh stem leaf，stem yield and extract content were significantly higher than that of CK.SSR molecular marker analysis showed that “Xianhu 3 ” and other species ofDendrobium(lines) have obvious genetic differences.Conclusion：“Xianhu 3 ” was a new elite variety ofDendrobiumvarieties with the following of “Xianhu 2 ”.Its breeding provided direction and basis forD.officinalereasonable development and utilization and protection.

Dendrobiumofficinale；Xianhu 3；SSR marker；breeding；characteristics

2017-01-16)

浙江省中藥材新品種選育重大科技專項(xiàng)(2016C02058)；浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017C02011)

*

徐靖，工程師，研究方向：藥用植物栽培與育種；Tel：(0579)87980003，E-mail：37117894@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.3.007