液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在植物蛋白及多肽研究中的應(yīng)用

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(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030;2.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心,黑龍江哈爾濱 150028)

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在植物蛋白及多肽研究中的應(yīng)用

許巖1,任皓威1,周廣運(yùn)1,劉寧1,2,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030;2.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心,黑龍江哈爾濱 150028)

近年來,隨著液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展,其在醫(yī)藥、環(huán)境和食品安全等領(lǐng)域中已得到廣泛應(yīng)用,目前也成為植物蛋白研究的重要手段。本文將從液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)發(fā)展及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在谷物蛋白、豆類蛋白及其他作物蛋白中的研究和應(yīng)用進(jìn)行歸納和總結(jié),并對(duì)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在植物蛋白研究中的發(fā)展方向和前景進(jìn)行展望,以期為植物蛋白的深入研究提供最新的基礎(chǔ)理論。

液質(zhì)聯(lián)用,蛋白與多肽,植物蛋白

植物蛋白是一種來源廣泛,由存在于植物體內(nèi)的各種氨基酸組成的具有特定空間結(jié)構(gòu)的高分子聚合物。不同于攝入動(dòng)物蛋白易導(dǎo)致人體肥胖、糖尿病、動(dòng)脈硬化和高膽固醇血癥等問題,植物蛋白因其氨基酸組成平衡,容易被人體消化吸收,同時(shí)具有降低膽固醇、抗腫瘤、改善心血管和抗氧化等功效[1-2],受到眾多研究者的青睞。隨著各種離子化技術(shù)的不斷出現(xiàn),液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS),也稱液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、環(huán)境和食品安全等領(lǐng)域中,特別在食品領(lǐng)域中,諸如食品鑒定[3]、農(nóng)獸藥殘留、添加劑、新產(chǎn)生成分分析[4]和食品過敏原[5]等。近年來,隨著基因組學(xué)(genomics)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)(transcriptomics)、蛋白組學(xué)(proteomics)、代謝組學(xué)(metabolomics)及生物信息學(xué)(bioinformatics)的發(fā)展,將蛋白與肽的研究與生物體的基因、轉(zhuǎn)錄和代謝等相關(guān)聯(lián),LC-MS技術(shù)也成為蛋白研究的重要手段,因此利用LC-MS對(duì)植物蛋白和肽的鑒定、定性定量分析及在組學(xué)中的更深入研究對(duì)植物蛋白研究及應(yīng)用有重要意義。

本文主要針對(duì)近年來LC-MS的發(fā)展、LC-MS對(duì)蛋白及多肽定性方法、定量方法進(jìn)行歸類總結(jié),然后系統(tǒng)敘述LC-MS在可食性果實(shí)或油料等作物包括谷物(水稻、小麥和玉米等)、豆類(大豆、雞豆、黑豆和豌豆等)及其他作物(馬鈴薯、紅薯、菜籽和核桃等)蛋白研究應(yīng)用,并對(duì)LC-MS在植物蛋白研究中的發(fā)展方向和前景進(jìn)行展望,以期為植物蛋白的深入研究提供最新的基礎(chǔ)理論。

1 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)

1.1液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)發(fā)展

LC-MS是一種將具有高效、快速分離的液相色譜的高分離能力與靈敏準(zhǔn)確的質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)鑒定功能相結(jié)合,能夠應(yīng)用于難揮發(fā)性化合物、極性化合物、熱不穩(wěn)定化合物和大分子化合物(包括蛋白質(zhì)、多肽、多糖和多聚物等)多種定性分析及定量分析的一門技術(shù)。

液相色譜的分離技術(shù)與質(zhì)譜儀的各種接口的出現(xiàn),及接口和電離源的融合使得LC-MS技術(shù)得到迅速發(fā)展。20世紀(jì)80年代初,陸續(xù)出現(xiàn)氣噴霧接口、熱噴霧(thermospray,TSP)接口被應(yīng)用于高的液體流速和分析熱不穩(wěn)定化合物,后來被大氣壓電離(atmospheric pressure ionization,API)技術(shù)所取代;1984年Willoughby和Brown提出以單分散氣溶膠為界面的色譜接口(也稱粒子束接口),可以使用電子電離(electron ionization,EI)源、化學(xué)電離(chemical ionization,CI)源和快原子轟擊(fast atom bom bardment,FAB)源,獲得液相色譜分離后樣品的EI質(zhì)譜圖,用于譜庫檢索,推動(dòng)了以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的肽段和蛋白質(zhì)分析的發(fā)展;隨后出現(xiàn)的電噴霧電離(electrospray ionisition,ESI)接口、大氣壓化學(xué)電離(atmospheric pressure chemical ionization,APCI)和大氣壓光電離(atmospheric pressure photoionization,APPI)都屬于大氣壓狀態(tài)下的接口,又被統(tǒng)稱為API源(接口),也廣泛應(yīng)用于LC-MS[6-8]。

基質(zhì)輔助激光解吸電離(matrix assisted laser desorption ionization,MALDI)技術(shù)的出現(xiàn),和ESI技術(shù)一起成為了目前應(yīng)用最廣泛的軟電離方式。電離源與四級(jí)桿(quadrupole,Q)、離子阱(ion trap,Trap)、飛行時(shí)間(time of flight,TOF)和傅里葉變換離子回旋共振(fourier-transform ion cyclotron resonance,FTICR)等質(zhì)譜質(zhì)量分析器相結(jié)合,同時(shí)多維液相及多級(jí)質(zhì)譜的串聯(lián),例如三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(triple stage quadrupole,TQ)、四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(quadrupole time of flight,Q-TOF),飛行時(shí)間-飛行時(shí)間(TOF-TOF)等使LC-MS能夠更廣泛的應(yīng)用于產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的定量、定性信息的分析。ESI離子化,根據(jù)電離物不同,可以得到單電荷和多電荷離子,一般與四級(jí)桿質(zhì)譜儀聯(lián)用,一般用來分析對(duì)熱不穩(wěn)定的極性化合物。ESI離子一般產(chǎn)生于液相,受到殘留的溶劑蒸發(fā)或者解吸的影響,而nano-ESI-MS的應(yīng)用則能夠減少樣品進(jìn)入質(zhì)量分析器允許的電離時(shí)間及流速。而MALDI離子化一般和TOF聯(lián)用,適合于具有高相對(duì)分子質(zhì)量的化合物及混合物分析,同時(shí)MALDI也可以同其他分析器例如Trap、Q等分析器聯(lián)用。MALDI和ESI兩種電離技術(shù)的商業(yè)化使LC-MS在測(cè)定生物大分子方面成為重要的工具之一。

液相的高分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性,以及串聯(lián)質(zhì)譜的應(yīng)用,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)提高了分析的專一性,改善信噪比,提高靈敏度等使得LC-MS已經(jīng)成為分離、鑒定各種化合物的重要手段之一。

1.2液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析蛋白及多肽的方法

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于蛋白及多肽的鑒定研究主要有兩種方法,即自上而下“Top-down”方法,蛋白水平上蛋白分析和研究,和自下而上“Bottom-up”方法,多肽水平蛋白分析與研究。圖1比較了兩種蛋白組學(xué)研究策略的方法[9]?！癟op-down”方法中,實(shí)現(xiàn)了對(duì)整個(gè)蛋白質(zhì)的直接分析,在質(zhì)譜中將蛋白質(zhì)片段化并檢測(cè)整個(gè)蛋白質(zhì)和各個(gè)片段的質(zhì)量。離子的分子量(MW)可以根據(jù)離子的電荷數(shù)(z)和質(zhì)荷比(m/z)計(jì)算得到,通過將整個(gè)蛋白質(zhì)和它的片段的質(zhì)量與數(shù)據(jù)庫中已知蛋白質(zhì)序列的質(zhì)量進(jìn)行匹配,實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的鑒定,這種方法提供了整個(gè)裂解蛋白質(zhì)的高精度質(zhì)量數(shù),更容易解釋蛋白的碎裂結(jié)果,可以采用碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)、電子捕獲裂解(ECD)或電子轉(zhuǎn)移裂解(ETD)等串聯(lián)質(zhì)譜方法對(duì)離子進(jìn)行裂解[10]。Top-down方法的優(yōu)點(diǎn)是,能夠?qū)ν暾牡鞍纂x子進(jìn)行MS/MS分析,能夠獲得完整的蛋白序列,因此能更好地分析蛋白質(zhì)鑒定及蛋白質(zhì)翻譯后修飾,但Top-down方法獲得的完整蛋白質(zhì)量分布比“Bottom-up”方法酶解產(chǎn)生的多肽更廣,因此由多電荷蛋白離子裂解產(chǎn)生的碎片離子圖譜解析更加復(fù)雜。而“Bottom-up”方法中,即鳥槍法,首先通過純化的蛋白質(zhì)或復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物蛋白酶水解成肽段,利用液相色譜進(jìn)行分離,最后通過質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行分析和碎裂,結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索技術(shù)對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定,蛋白質(zhì)的鑒定是通過實(shí)際產(chǎn)生的譜圖與從蛋白質(zhì)組或基因組數(shù)據(jù)庫中得到的理論譜圖進(jìn)行匹配而實(shí)現(xiàn)的[11]。目前液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在植物蛋白研究中,大多采用的是“Bottom-up”方法進(jìn)行蛋白研究,它優(yōu)勢(shì)在于將復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物酶解,將肽段進(jìn)行色譜分析,蛋白質(zhì)酶解后得到的肽段更容易分離,更容易分析?！癇ottom-up”方法分析植物蛋白肽,常用的酶解蛋白酶包括胰蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶等。

蛋白通過LC-MS的色譜分離及質(zhì)譜的碎裂分析,得到大量的肽段信息,而分析這些肽段的方法包括數(shù)據(jù)庫查詢,即肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fingerprinting,PMF)、肽段離子碎片圖譜(PFF)或者從頭測(cè)序法(de novo sequencing)從而對(duì)蛋白及多肽進(jìn)行鑒定及分析。

圖1 蛋白質(zhì)定性研究的“自下而上”和“自上而下”策略的比較[9]Fig.1 The comparatives of “Top-down” and “Bottom-up” strategy on the protein qualitative research[9]

1.3液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在蛋白的鑒定及分析中的定性分析

LC-MS對(duì)蛋白的定性分析,包括測(cè)定蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、一級(jí)結(jié)構(gòu)、二硫鍵位置以及蛋白質(zhì)翻譯后修飾(post-translational modifications,PTMs),而PTMs包括經(jīng)過后轉(zhuǎn)錄翻譯的蛋白側(cè)鏈的糖基化(glycosylation)、磷酸化(phosphorylation)、乙?；?acetylation)和甲基化(methylation)等取代基的結(jié)構(gòu)、位置和數(shù)量以及蛋白與蛋白間的交互作用等[12-13]。

Klapoetke等[14]利用UPLC-ESI-TOF/MS檢測(cè)人類IgA1糖基化蛋白和去糖基化蛋白N-糖苷和O-糖苷的數(shù)量及位置,在肽水平上分別確定及鑒定出2個(gè)N-糖苷和4個(gè)O-糖苷的位置。

Li等[15]建立了LC/MS技術(shù)分析二硫鍵的方法,將這種方法應(yīng)用于免疫球蛋白IgG1分子和溶菌酶的檢測(cè),在IgG1中檢測(cè)出4種二硫鍵,位置分別為Cys24-Cys146、Cys48-Cys134、Cys83-Cys99和Cys95-Cys113。Makepeace等[16]建立了通過非特異性蛋白消化酶K和CID裂解聯(lián)合技術(shù)通過軌道離子阱LC/ESI-MS/MS數(shù)據(jù)分析和鑒定二硫鍵的方法,結(jié)果表明CID-裂解交聯(lián)分析方法使非特異性蛋白水解消化,LC/ESI-MS/MS能夠全面識(shí)別蛋白質(zhì)中二硫鍵。

1.4液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在蛋白的鑒定及分析中的定量分析

目前液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)定量分析蛋白及多肽方法主要分為兩類:同位素標(biāo)記法(包括isotopic coded affinity tag,ICAT;isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ;stable isotope labeling with amino acid in cell culture,SILAC;H2O18labeling)和非標(biāo)記法(Label free)[17]。而其中iTRAQ和Label free技術(shù)目前使用的最熱。近年來發(fā)展的多反應(yīng)檢測(cè)即選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(selective reaction monitoring,SRM)技術(shù)或多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)技術(shù)[18-19],使得LC-MS的精確性定量方法在肉類摻假[20],藥物殘留[21]等監(jiān)測(cè)中得到廣泛應(yīng)用并取得良好的效果。

常見標(biāo)記定量技術(shù)的體內(nèi)標(biāo)記方法包括15N體內(nèi)代謝標(biāo)記和細(xì)胞培養(yǎng)中穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸(stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)方法,穩(wěn)定同位素體內(nèi)(invivo)或體外(invitro)標(biāo)記技術(shù)。靳文海等[22]利用了LC-MS/MS對(duì)胰酶消化酵母細(xì)胞裂解物產(chǎn)物進(jìn)行了分析,鑒定了10179條獨(dú)特肽段和1174種蛋白,并對(duì)一組含有五種已知蛋白以及部分重同位素標(biāo)記肽段的樣品進(jìn)行了分析定量,發(fā)現(xiàn)這五種蛋白質(zhì)都有很高的序列覆蓋率并且測(cè)試中得到肽段的平均質(zhì)量偏差僅為1.7 ppm。

而不依賴于同位素標(biāo)記的基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的非標(biāo)記定量技術(shù)的應(yīng)用也較為廣泛。劉永福等[23]通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)分析,建立了多肽標(biāo)準(zhǔn)品ESAT-6定量方法,通過液質(zhì)聯(lián)用MRM法成功地實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)多肽和蛋白質(zhì)定量測(cè)定,結(jié)果顯示液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜MRM法檢測(cè)血漿內(nèi)提取的多肽,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)為0.999,采用MRM法對(duì)膠內(nèi)分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)為0.995,說明該定量方法可以推廣應(yīng)用于復(fù)雜樣品中的多肽和蛋白質(zhì)的定量分析。隨著液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展,更低的檢測(cè)限、更高的色譜分離和全面的質(zhì)譜數(shù)據(jù)在蛋白鑒定的定量定性分析中顯得尤為重要。

2 液質(zhì)聯(lián)用在植物蛋白及多肽中的應(yīng)用

西方學(xué)術(shù)界把植物蛋白分為花、草、樹木和灌木等植物中所含的蛋白(plant protein)以及大豆、花生等可食性果實(shí)或油料中所含的蛋白質(zhì)(vegetable protein)兩類,而在我國文獻(xiàn)中將兩者統(tǒng)稱為植物蛋白[1]。而本文針對(duì)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在食品中的可食性果實(shí)或油料等作物蛋白包括谷物、豆類和其他作物蛋白中的研究應(yīng)用進(jìn)行綜述。

2.1液質(zhì)聯(lián)用在谷物蛋白及多肽研究中的應(yīng)用

谷物是指草木植物中的牧草科(Gramineae)或禾本科(Poaceae)的種子或籽粒。谷物是稻、麥、谷子、高粱、玉米等作物的統(tǒng)稱[24]。目前采用最廣泛的谷物蛋白分類方法是Osboren(1910)根據(jù)不同溶劑中溶解性的差異提出的分類方法,即將蛋白質(zhì)分為清蛋白(albumins,水溶性蛋白,主要溶于水中)、球蛋白(globulins,鹽溶蛋白,溶于NaCl溶液)、醇溶谷蛋白(prolamins,溶于70%的乙醇溶液中)和谷蛋白(glutelins,溶于稀酸和稀堿溶液)4種不同的組分[25]。研究發(fā)現(xiàn)一些谷物蛋白肽具有生物活性,而LC-MS能夠分離鑒定出這種具有生物活性的特定肽段,對(duì)研究生物活性蛋白研究有重要意義。在谷物蛋白研究中,LC-MS主要應(yīng)用于蛋白及多肽分子量、一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定及生物活性肽鑒定。

研究發(fā)現(xiàn)大米中的米糠蛋白和大米胚乳蛋白含有抗氧化肽。Wattanasiritham等[26]從脫脂米糠粉中提取米糠蛋白,分別提取出清蛋白(12.5%)、球蛋白(13.9%)、谷蛋白(70.8%)和醇溶谷蛋白(2.9%),在最適條件下利用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解天然的和變性的米糠蛋白3 h,發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶水解的變性的米糠清蛋白具有更高的抗氧化活性,利用RP-HPLC分離出3個(gè)具有高抗氧化活性的碎片,并利用LTQ-FTICR的ESI質(zhì)譜鑒定出肽的分子量范圍為800～2100 Da,包含6～21個(gè)氨基酸殘基。而Zhang等[27]利用堿性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶等酶解大米胚乳蛋白得到的大米胚乳蛋白肽,發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶酶解的大米胚乳蛋白肽抗氧化性強(qiáng),利用MALDI-TOF/TOF MS/MS鑒定其為FRDEHKK(959.5 Da)和KHNRGDEF(1002.5 Da)。

研究發(fā)現(xiàn)玉米蛋白肽具有抗高血壓作用,一般抗高血壓肽的特點(diǎn)是含有大量的疏水性殘基和在碳末端存在脯氨酸的短的氨基酸序列(2-12氨基酸殘基),而玉米蛋白的α-玉米醇溶蛋白(21～25 kDa),包含三個(gè)抗高血壓肽,最高半數(shù)抑制濃度(IC50),分別是LRP(0.29 μmol/L)、LSP(1.7 μmol/L)和LQP(2.0 μmol/L)。Puchalska等[28]研究一種利用HPLC-ESI-Q-TOF定量分析在6種玉米中的這三種抗高血壓肽(LRP、LSP和LQP)的方法,采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)玉米自交系的LRP、LQP和LSP肽進(jìn)行定量。結(jié)果表明,EZ11A的LSP肽、A632的LRP和LQP肽含量最高。Wang等[29]利用了HPLC發(fā)現(xiàn)了玉米肽中28個(gè)峰,建立了指紋圖譜,利用HPLC-ESI-MS/MS系統(tǒng),鑒定了48個(gè)肽段碎片,并發(fā)現(xiàn)這48個(gè)肽段,許多肽都包含谷氨酰胺、亮氨酸和丙氨酸,而這三種氨基酸是玉米肽體現(xiàn)生物活性的主要成分。Wang等[30]主要從玉米蛋白中分離和鑒定一種新型抗氧化和抗高血壓玉米肽(corn peptide,CP),通過RP-HPLC-MS/MS鑒定分離的CP-2-1,發(fā)現(xiàn)其為M-I/L-P-P(452.3 Da),而CP-2-1表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性和ACE抑制活性(IC50為220 μg/mL和70.32 μg/mL)。Ma等[31]研究玉米肽的促進(jìn)酒精代謝作用,將玉米蛋白通過堿性蛋白酶水解并分離,通過HPLC-MS/MS鑒定,發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列為QLLPF,利用固相肽合成法合成這種五肽,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)酒精代謝作用。Tang等[32]利用堿性蛋白酶水解玉米蛋白肽,得到了兩個(gè)主要的抗氧化肽,通過LC-PDA-ESI-MS鑒定分別為Y-A和L-M-C-H,并發(fā)現(xiàn),堿性蛋白酶水解的玉米肽自由基清除能力與肽的分子量和疏水性相關(guān)。

小麥中的麥谷蛋白(glutenin,溶于稀酸和稀堿溶液)在面團(tuán)質(zhì)量及焙烤中起到重要作用,Wang等[33]利用MALDI-TOF-MS鑒定出了小麥中的低分子量的麥谷蛋白等位基因,發(fā)現(xiàn)該方法可以鑒定出48個(gè)獨(dú)特的等位基因。而Lagrain等[34]研究小麥麥谷蛋白亞基1Dx2(染色體1D編碼的亞基的等位基因),通過蛋白組學(xué)的方式分析其亞基結(jié)構(gòu),結(jié)果利用HPLC-ESI-QTOF-MS精確測(cè)定其分子質(zhì)量Mr,發(fā)現(xiàn)獲得的Mr(87,105)與在NCBI數(shù)據(jù)庫的蛋白序列(87,007)不同,而亞基利用胰凝乳蛋白酶部分酶解后利用RP-HPLC分離,得到的1Dx2肽,利用HPLC-ESI-MS/MS分析,得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)1Dx2的Mr估算值與測(cè)量值的差別是由于數(shù)據(jù)庫中的1Dx2氨基酸序列的脯氨酸丟失,而不是蛋白的翻譯后修飾的糖基化。

大麥麥谷蛋白也具有抗氧化作用,Xia等[35]研究大麥谷蛋白,通過酶水解獲取抗氧化肽,利用LC-MS/MS鑒定出了4種肽,分別為十肽QKPFPQQPPF、七肽PQIPEQF、六肽LRTLPM和六肽SVNVPL。

研究還發(fā)現(xiàn),有一些乳糜瀉患者(celiac patient)不能食用小麥、大麥、黑麥和燕麥等含有醇溶谷蛋白的食物,由于醇溶谷蛋白會(huì)誘導(dǎo)患者的免疫炎癥,破壞小腸粘膜。因此利用LC-MS技術(shù)檢測(cè)無谷蛋白產(chǎn)品就更為重要。Manfredi等[36]利用多重液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)法檢測(cè)小麥、燕麥、大麥和黑麥醇溶谷蛋白對(duì)于無谷蛋白產(chǎn)品的安全性評(píng)估。利用LC-ESI-MS/MS技術(shù)檢測(cè)小麥、燕麥、大麥和黑麥原料及生產(chǎn)產(chǎn)品的乳糜瀉谷蛋白的存在,發(fā)現(xiàn)強(qiáng)化的大米粉顯示良好的分析性能的敏感性(檢測(cè)范圍2～18 mg/kg)。Martínez-Esteso等[37]利用蛋白組學(xué)的方法,研究小麥谷蛋白標(biāo)記物,利用RP-HPLC-MS的方法從多重酶解(胞內(nèi)蛋白酶,胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶)的小麥谷蛋白中鑒定了434個(gè)多肽序列,并且將其分為兩組,獨(dú)特的單個(gè)谷蛋白序列和在腹腔疾病中包含免疫和有毒性的序列。并利用LC-MS/MS方法,基于SRM反應(yīng)檢測(cè)目標(biāo)蛋白肽,SRM基于篩選法選擇能夠應(yīng)用到含有面筋蛋白的谷物中(小麥、大麥、黑麥、燕麥),不含面筋的面粉(玉米、大豆、大米),并且一個(gè)獨(dú)特的小麥面筋蛋白標(biāo)記肽被鑒定,并作為小麥特定的標(biāo)記。Colgrave等[38]研究通過LC-MS/MS鑒定大麥特異性肽標(biāo)記物,在26個(gè)樣品中,通過質(zhì)譜的MRM多重反應(yīng)檢測(cè)鑒定了9個(gè)大麥肽標(biāo)記物,并檢測(cè)一系列的早餐麥片和能夠檢測(cè)大麥的早餐麥片和牛奶什錦瑞士果蔬燕麥片,以及檢測(cè)允許添加谷物的傳統(tǒng)谷物和市售面粉,包括莧菜、蕎麥、小米、大米、玉米、燕麥、黑麥、斯佩爾特小麥和綠色小麥(0.01%～0.08%)。

2.2液質(zhì)聯(lián)用在豆類蛋白及多肽研究中的應(yīng)用

近年來,對(duì)豆類蛋白研究發(fā)現(xiàn)許多豆類蛋白水解后,水解的肽會(huì)呈現(xiàn)出特定的生物活性,包括抗菌性(antifungal activity)、抑制ACE(angiotensin converting enzyme inhibition)、抗高血壓性(antihypertensive activity)、金屬螯合能力(metal-chelating ability)、抗氧化性(antioxidant activity)、減少抗原性(reduction of antigenic activity)等,生物活性肽是一種加密的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu),但在蛋白水解作用下可以釋放,根據(jù)不同的氨基酸序列,可以在胃腸道、靶細(xì)胞、組織及血液中表現(xiàn)出不同的生物活性[39-40]。而為了研究豆類蛋白具體產(chǎn)生生物活性特異性蛋白肽的肽段,LC-MS被應(yīng)用于特征肽的分子量的測(cè)定以及一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,通過研究豆類蛋白在體外蛋白酶的消化作用,模擬人體的消化,分離鑒定出特征性肽,從而研究豆類蛋白對(duì)人體的生物功效。

LC-MS技術(shù)在大豆蛋白及多肽研究中應(yīng)用,使得大豆蛋白能夠更全面的被了解和開發(fā)利用。Li等[41]利用HPLC-MS研究大豆蛋白水解物中寡肽和氨基酸,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了質(zhì)荷比m/z 200～1500的186種寡肽,而其中99個(gè)寡肽,可以推測(cè)出其氨基酸組成。Castro-Rubio等[42]利用RP-HPLC-ESI-MS研究不同栽培品種大豆,分析完整的大豆蛋白的特性,研究黃豆和其他色素(綠、紅、黑)豆相似性及不同性,獲得主要的大豆蛋白球蛋白(11S和7S)。Puchalska等[43]研究使用HPLC-Q-TOF-MS鑒定基于嬰幼兒配方乳粉的商業(yè)大豆中的血管緊張抑制轉(zhuǎn)化酶I,鑒定其為RPSYT,這種肽被合成后,測(cè)定其抗高血壓性和抗氧化性,發(fā)現(xiàn)其具有較高的抗高血壓作用及抗氧化性。Ma等[44]從大豆分離蛋白中發(fā)現(xiàn)了一種新型抗氧化肽,利用LC-MS/MS鑒定其序列為FDPAL(561 Da)。Lv等[45]研究發(fā)現(xiàn)大豆蛋白在蛋白酶M和脫酰胺酶酶解后,具有螯合金屬能力,通過MALDI-TOF MS/MS鑒定出螯合鐵離子的肽LMNLAIRCRLGPMIG、CDLSSDD(11 kDa)和DNQSEQLEGKEKK(17 kDa)。Capriotti等[46]通過模擬胃腸道消化大豆種子和豆奶蛋白來鑒定潛在的生物活性肽,研究通過納升-液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定肽的序列,發(fā)現(xiàn)在大豆種子蛋白樣品、未處理的豆奶樣品及豆奶樣品中分別鑒定了1173、1364和1422種肽,鑒定出具有生物活性和抗菌作用的肽。

近年來,雞豆蛋白及其多肽研究也得到眾多研究者的關(guān)注,Kou等[47]利用LC-ESI-MS技術(shù)對(duì)從雞豆白蛋白的水解產(chǎn)物中分離純化出了抗氧化肽進(jìn)行鑒定,鑒定其為十肽化合物RQSHFANAQP(1.155 kDa)。而Torres-Fuente等[48]利用RP-LC-MS/MS從雞豆蛋白水解物中提取并鑒定了抗氧化肽,發(fā)現(xiàn)主要的種子蛋白是豆球蛋白(legumin),主要的序列為ALEPDHR、TETWNPNHPEL、FVPH和SAEHGSLH。而大部分肽包含體現(xiàn)主要的抗氧化活性的組氨酸,還包括色氨酸和苯丙氨酸,其中酚基也可以作為氫供體,說明豆球蛋白可以作為一種食品和制藥工業(yè)的良好的抗氧化肽源,能夠應(yīng)用與開發(fā)新的保健品和功能性食品。

Chang等[49]分別利用冷沉淀和等電點(diǎn)沉淀法從雞豆粉中提取雞豆分離蛋白,并利用PAGE、SDS-PAGE、RP-HPLC和ESI-MS分離鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),雞豆分離蛋白主要為11S球蛋白和7S球蛋白以及少量的2S清蛋白,對(duì)RP-HPLC分離出11S球蛋白和7S球蛋白,進(jìn)行ESI-MS鑒定分析,發(fā)現(xiàn)了屬于豌豆球蛋白亞基(vicilin subunits)的分子質(zhì)量為35366、35268、14648 Da的肽段,和屬于豆球蛋白的β-亞基(leguminβ-subunit)的分子質(zhì)量為24894 Da肽段。

研究發(fā)現(xiàn)黑豆具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和生物學(xué)活性,因此LC-MS技術(shù)也應(yīng)用在黑豆蛋白研究中。Mojica等[50]利用8種市售的蛋白酶水解黑豆蛋白,得到了抗糖尿病活性肽(anti-diabetic peptides),通過LC-ESI-MS/MS對(duì)其進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)序列為EGLELLLLLLAG、AKSPLF和FEELN的活性肽能夠有效抑制二肽基肽酶IV活性(dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV)。

He等[51]利用質(zhì)譜從黑龜豆中分離出31 kDa植物外源凝集素,并通過克隆和基因序列分析,鑒定了植物外源凝集素的DNA片段編碼。利用SDS-PAGE分離蛋白碎片,利用胰蛋白酶消化酶解,得到的肽片段利用LC-MS/MS分析,結(jié)果測(cè)定了52%序列,蛋白鑒定與植物血球凝集素(phytohemagglutinin,PHA)高度同源性。

一些研究利用LC-MS技術(shù)鑒定了豌豆蛋白中的抗高血壓肽。Jakubczyk等[52]通過研究發(fā)酵和體外消化對(duì)形成豌豆蛋白的ACE抑制肽的影響,分離出具有高ACE抑制活性水解物碎片,并利用LC-MS/MS鑒定其序列為KEDDEEEEQGEEE。Aluko等[53]在豌豆種子蛋白抗高血壓肽的結(jié)構(gòu)與功能特性研究中,利用反相色譜分離出10個(gè)肽段,并選擇抑制ACE和抑制腎素活性高的肽段碎片進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定,鑒定出5個(gè)肽段,其序列分別為LTFPG(534 Da)、IIPLEN(698 Da)、LSSGDVF(724 Da)、IFENLQN(877 Da)和FEGTVFENG(999 Da)。

植物鐵蛋白廣泛的存在于植物種子中,是一種新的選擇攝入鐵資源以及治療缺鐵性貧血癥的方法,但是研究發(fā)現(xiàn),豌豆種子鐵蛋白(pea seed ferritin,PSF)和大豆種子鐵蛋白(soybean seed ferritin,SSF)和由于含有大量的H-1亞基而不穩(wěn)定,Yun等[54]研究從蠶豆種子中分離和鑒定一種新的穩(wěn)定性高的植物鐵蛋白(BBSF),利用MALDI-TOF-MS及SDS-PAGE分析其N-末端序列,發(fā)現(xiàn)包含H-1和H-2亞基比例為1∶6,鑒定發(fā)現(xiàn)該植物鐵蛋白與PSF有很高的同源性,而PSF中的H-1/H-2為1∶2以及SSF中的亞基H-1/H-2為1∶1。

2.3液質(zhì)聯(lián)用在其他作物蛋白及多肽研究中的應(yīng)用

M?kinen等[55]通過高血壓模型大鼠研究馬鈴薯和油菜籽蛋白肽的ACE抑制作用和降壓作用,通過LC和MS/MS分析表明,馬鈴薯蛋白肽和油菜籽蛋白肽的組成不同,馬鈴薯源ACE抑制肽,由于MS/MS分析的信號(hào)的缺乏,因此只能鑒定出其富含谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、絲氨酸殘基,而油菜籽蛋白鑒定出兩個(gè)ACE抑制肽,分別為SLVSPSAAAAAAPGGS(1139 Da)和KKRSKKKSFG(1008 Da)。

Yang等[56]研究冷誘導(dǎo)馬鈴薯中的甜味的問題,利用等壓、穩(wěn)定同位素編碼標(biāo)記方法,比較馬鈴薯在5 ℃貯存0和5個(gè)月的蛋白組學(xué)的變化,并利用反向液相色譜和凝膠電泳法進(jìn)行第一維分餾方法,隨后利用nano LC-MS/MS,Q-TOF和Orbitrap,共鑒定了4463個(gè)馬鈴薯蛋白,其中有46個(gè)蛋白顯示在馬鈴薯冷貯藏時(shí)表現(xiàn)不同。

Zang等[57]研究堿性蛋白酶紅薯蛋白水解物的抗氧化活性,通過測(cè)定·OH自由基清除能力和Fe2+螯合能力,發(fā)現(xiàn)低分子量的碎片F(xiàn)-IV(<3 kDa)有高的·OH自由基清除能力和Fe2+螯合能力,通過SEC純化,然后用RP-HPLC分離出高抗氧化活性的兩個(gè)碎片,分別是IV-5c和IV-5i。利用LC-MS/MS從IV-5c和IV-5i中分離鑒定出5個(gè)肽段分別為匹配貯藏蛋白A序列的TYQTFSGQYFL和YMVSAIWG和匹配貯藏蛋白B序列YYIVS和YYDPL。

Chen等[58]研究核桃蛋白酶解物的制備及抗氧化活性,采用堿性蛋白酶對(duì)核桃蛋白進(jìn)行酶解,檢測(cè)了所得酶解物的抗氧化能力,利用Sephadex G-25凝膠層析柱和反相柱對(duì)核桃蛋白酶解物進(jìn)行分離純化,采用LC-ESI-Q-TOF測(cè)得抗氧化能力最強(qiáng)的多肽的序列為AGGA,其還原力和還原型谷胱甘肽相當(dāng)。

Gu等[59]研究胰酶酶解核桃蛋白酶解物的抗氧化性能力,除了通過DPPH自由基活性、ABTS自由基活性、金屬離子螯合能力和ORAC值評(píng)價(jià)核桃蛋白抗氧化肽的抗氧化能力,還測(cè)定了核桃蛋白抗氧化肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷的PC12(pheochromocytoma cell line)細(xì)胞的保護(hù)作用,研究發(fā)現(xiàn)0.1 mg/mL 的核桃蛋白抗氧化肽,能夠使PC12細(xì)胞存活率達(dá)到83%,并且對(duì)PC12細(xì)胞沒有毒性作用,證明了核桃蛋白抗氧化肽能夠清除大鼠PC12細(xì)胞系中活性氧。利用凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜法將具有抗氧化能力的核桃蛋白肽分離,通過ESI-MS/MS鑒定出6個(gè)肽(YS,YSVH,YK,YT,LPC,EM)和8個(gè)肽(CA,SQK,CR,CHC,GHC,YA,YG,NW)。

Zhang等[60]研究菜籽蛋白,分離并純化了自由基清除肽,利用GFC凝膠過濾色譜和RP-HPLC,純化的肽的半數(shù)有效量(median effective dose,ED50)對(duì)DPPH自由基清除量為0.063 mg/mL,并且通過ESI-MS鑒定其序列為PAGPF(487 Da)。而Xie等[61]研究菜籽蛋白,發(fā)現(xiàn)菜籽蛋白有螯合金屬鋅的能力,研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過堿性蛋白酶酶解,經(jīng)過UPLC-ESI-MS鑒定了四種肽,分別為AR、NSM、GKR和EPSH。

Wang等[62]利用LC-ESI-MS對(duì)用鋅離子固定金屬親和色譜法(immobilized metal affinity chromatography,IMAC)處理的芝麻蛋白胰蛋白酶酶解的產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定分析,結(jié)果得到6個(gè)容易與鋅離子螯合的多肽,確定分別為二肽SM(0.236 kDa)、三肽LAN(0.316 kDa)、三肽IAN(0.316 kDa)、三肽RKR(0.458 kDa)、三肽RQR(0.458 kDa)和三肽NCS(0.322 kDa)。

3 液質(zhì)聯(lián)用在蛋白及多肽研究中的發(fā)展方向

LC-MS應(yīng)用,使植物蛋白的研究更加深入,尤其是隨著系統(tǒng)生物學(xué)研究的發(fā)展,蛋白組學(xué)與基因組、蛋白組學(xué)與代謝組學(xué),及生物信息學(xué)(bioinformatics)的發(fā)展及結(jié)合,使得對(duì)于植物蛋白的研究,除了分析蛋白及多肽分子量、一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定及生物活性肽鑒定,也將蛋白分析上升到基因表達(dá)水平及代謝水平分析。

Maldonado-Cervantes等[63]利用LC/MS-MS技術(shù)手段,鑒定莧屬種子蛋白的特征,結(jié)果發(fā)現(xiàn),通過2-DE鑒定出約400個(gè)蛋白點(diǎn),利用LC/MS-MS技術(shù)鑒定出其中一個(gè)為胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryogenesis abundant protein,LEA),克隆其基因并鑒定,發(fā)現(xiàn)AcLEA cDNA包含418個(gè)開放的基因點(diǎn)(ORF)能夠編碼139個(gè)氨基酸的多肽。

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)與其他技術(shù),例如氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及毛細(xì)管電泳質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、核磁共振技術(shù)等組成了代謝組學(xué)主要研究工具[64],而對(duì)于植物蛋白,例如大米蛋白,可以利用上述手段,探尋包括水稻代謝物包括糖類、氨基酸和有機(jī)酸、芳香族化合物、激素檢測(cè)等,及未知代謝物的結(jié)構(gòu)研究。利用代謝組學(xué)方法也可以探索化學(xué)多樣性大米,以及通過氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用、毛細(xì)管電泳質(zhì)譜聯(lián)用等方法分析檢測(cè)水稻代謝物包括糖類、氨基酸和有機(jī)酸、芳香族化合物、激素檢測(cè),分析水稻生物屬性與極性和非極性代謝物的活動(dòng)[65]。

在傳統(tǒng)的發(fā)酵食品及微生物中,代謝組學(xué)研究方法比較普遍,例如Kang等[66]在黃豆餅發(fā)酵中的代謝組學(xué)研究中,利用了UPLC-Q-TOF MS法和PLS-DA分析法,分析了黃豆餅在發(fā)酵過程中的代謝物,如氨基酸、小分子肽以及尿素循環(huán)產(chǎn)物、有機(jī)酸等,而這些代謝物能夠產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味,具有豐富的營養(yǎng)成分及功能作用。Lee等[67]利用代謝組學(xué)的研究方法說明了韓國發(fā)酵辣椒醬中,氨基酸是小麥和大米辣椒醬的抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)者,并利用GC-TOF-MS和UPLC-QTOF-MS方法,以及主成分分析的方法(PCA)分析具有抗氧化活性作用的主要成分。

因此,隨著LC-MS研究植物蛋白的代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)等方面的深入研究,已經(jīng)使得液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)也將成為植物蛋白研究的重要手段之一。

4 結(jié)語

植物蛋白中富含多種氨基酸和多肽,具有多種生物活性功能,且資源豐富,因此利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析功能性植物蛋白、生物活性肽,對(duì)深入了解和應(yīng)用植物蛋白有重要意義。同時(shí)構(gòu)建肽庫,利用蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等方法研究植物蛋白已經(jīng)成為發(fā)展趨勢(shì),相信隨著各種離子化、質(zhì)量分析檢測(cè)及聯(lián)用等技術(shù)的不斷完善和發(fā)展,液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)必將成為植物蛋白及多肽分析的最有效研究工具。

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Applicationofliquidchromatography-massspectrometryinresearchofplantproteinsandpeptides

XUYan1,RENHao-wei1,ZHOUGuang-yun1,LIUNing1,2,*

(1.Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 2.National Research Center of Dairy Engineering and Technology,Northeast Agricultural University,Harbin 150028,China)

With liquid chromatography-mass spectrometry technology developing continuously,the liquid chromatography-mass spectrometry technology has been widely available in the field of medicine,environment,food security recently,and also play a key role in plant protein and peptide research. Recently advances on development of liquid chromatography-mass spectrometry and liquid chromatography-mass spectrometry application in the cereals,legumes and other crop proteins were reviewed. The development trend and prospects of plant protein research by liquid chromatography-mass spectrometry were used to provide the latest basic theory for the further study of plant proteins.

liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS);proteins and peptides;plant protein

2017-02-20

許巖(1991-)，女，博士，研究方向：食品營養(yǎng)及加工，E-mail:xuyan1991521@163.com。

*通訊作者:劉寧(1960-)，男，博士，教授，研究方向：食品營養(yǎng)及加工，E-mail:ningliuneau@outlook.com。

TS210.1

:A

:1002-0306(2017)17-0310-09

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.061