厚葉海帶巖藻聚糖硫酸酯分離純化及其體外腫瘤抑制活性研究

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(1.大連海洋大學食品科學與工程學院,遼寧大連 116023;2.國家海藻加工技術研發(fā)分中心,遼寧大連 116023;3.遼寧水產品加工及綜合利用重點實驗室,遼寧大連 116023)

厚葉海帶巖藻聚糖硫酸酯分離純化及其體外腫瘤抑制活性研究

彭雍博,宋悅凡,武龍,汪秋寬*,叢?；?劉舒

(1.大連海洋大學食品科學與工程學院,遼寧大連 116023;2.國家海藻加工技術研發(fā)分中心,遼寧大連 116023;3.遼寧水產品加工及綜合利用重點實驗室,遼寧大連 116023)

厚葉海帶,巖藻聚糖硫酸酯,分離純化,MTT實驗,抗腫瘤

綜上,本研究采用DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子交換柱層析對日本厚葉海帶巖藻聚糖硫酸酯粗品進行分離純化,得到不同的有效分離組分,并研究50、200、800 μg/mL的巖藻聚糖硫酸酯粗品及分離組分對肝癌細胞HepG2、肺癌細胞A549和結腸癌細胞HT-29的體外存活率影響,以期證明日本厚葉海帶巖藻聚糖硫酸酯是一種有效的天然抗腫瘤藥物,同時為巖藻聚糖硫酸酯保健產品開發(fā)和進一步的臨床研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

日本厚葉海帶巖藻聚糖硫酸酯粗品 大連海洋大學國家海藻加工技術研發(fā)分中心和遼寧省水產品加工及綜合利用重點實驗室提供;肝癌細胞HepG2、肺癌細胞A549、結腸癌細胞HT-29 中國科學院大連化學物理研究所提供;巖藻糖、半乳糖 美國Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、Mccoy’s 5A培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、二甲基亞砜(DMSO)、青霉素-鏈霉素(雙抗)、噻唑藍(MTT) 生工生物工程(上海)股份有限公司;氯化鈉、氯化鉀、氯化鋇、磷酸氫鉀、磷酸二氫納、磷酸氫二鈉、硫酸鉀、山梨醇、濃鹽酸、苯酚、濃硫酸、無水乙醇等 均為分析純。

354型酶標儀、991型超低溫冰箱 美國Thermo公司;TS-100型倒置顯微鏡 日本Nikon公司;SW-CJ-2F型潔凈工作臺 上海博迅實業(yè)有限公司;MCO-18AIC型CO2恒溫培養(yǎng)箱 北京瑞爾欣科技有限公司;LDZX-50KB型立式電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療機械廠。

1.2實驗方法

1.2.1 日本厚葉海帶巖藻聚糖硫酸酯分離純化 巖藻聚糖硫酸酯分離純化參考劉舒等[15],并略加修改。精確稱取300 mg粗品F,溶于20 mL磷酸鹽緩沖液(0.02 mol/L、pH7.4),溶液經DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子交換色譜柱(1.6 cm×30 cm)分離,經磷酸鹽緩沖液和0～2.0 mol/L的NaCl溶液梯度洗脫。設定流速為0.75 mL,自動收集器收集(每管3 mL)。以洗脫管數為橫坐標,多糖濃度(測定方法同多糖測定)和NaCl濃度為縱坐標,繪制巖藻聚糖硫酸酯梯度洗脫曲線。根據梯度洗脫曲線確定分離組分并分別收集,透析,冷凍干燥。

1.2.2 多糖測定 苯酚-硫酸法測定多糖含量[16]。24 mg標準糖(L-巖藻糖:D-半乳糖=3∶1),去離子水定容至500 mL。分別吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL于比色管,去離子水補至2 mL,依次加入1 mL 的6%苯酚溶液、5 mL濃硫酸,搖勻放置至室溫。取150 μL混勻液于96孔板,酶標儀490 nm檢測,以標準糖含量(μg/mL)為橫坐標,吸光度為縱坐標,去離子水組校零,繪制標準曲線。稱取10 mg粗品F及分離純化組分,定容至100 mL,吸取1.0 mL于比色管,按上述步驟,測定吸光度并計算多糖含量。

1.2.4 細胞抑制實驗 肝癌細胞HepG2、肺癌細胞A549和結腸癌HT-29體外培養(yǎng)及MTT實驗參考李亞嫻等[18],并略以修改。

1.2.4.1 細胞復蘇及原代培養(yǎng) 液氮罐中取凍存的肝癌細胞HepG2、肺癌細胞A549和結腸癌細胞HT-29,于37 ℃水浴中快速解凍,吸取細胞液,置于15 mL離心管中,加入適量細胞培養(yǎng)液,1000 r/min離心3 min,棄去上清液。加入完全培養(yǎng)液(含1%雙抗和10%胎牛血清)重懸細胞,計數,調整細胞密度,接種在培養(yǎng)瓶中,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.4.2 細胞的傳代培養(yǎng) 細胞密度鋪滿瓶底,加入胰蛋白酶消化液,覆蓋細胞表面,倒置顯微鏡觀察,細胞皺縮變圓,棄去消化液后加入完全培養(yǎng)液終止消化,彎頭吸管吹打細胞制成細胞懸液。將細胞懸液稀釋后接種于新培養(yǎng)瓶中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.4.3 MTT法檢測腫瘤細胞存活率 取對數生長期的細胞,胰蛋白酶消化、彎頭吸管吹打制成細胞懸液,并稀釋至1×105/mL密度接種于96孔板,每孔100 μL。孵育48 h后小心棄去培養(yǎng)液,加入含有不同濃度(50、200、800 μg/mL)的巖藻聚糖硫酸酯組分培養(yǎng)液150 μL,孵育24 h,設置平行組及空白對照組。培養(yǎng)結束后,棄去培養(yǎng)液,每孔加入150 μL經培養(yǎng)液稀釋的MTT溶液(0.5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去培養(yǎng)基,每孔加入150 μL DMSO以溶解藍紫色結晶物,使用平板振蕩器勻速振蕩10 min,待結晶物充分溶解后用酶標儀測定570 nm吸光值,根據下式計算細胞相對存活率。

細胞相對存活率(%空白對照組)=(OD3-OD2)/(OD1-OD2)×100

式中:OD1對照組吸光度值;OD2空白組吸光度值;OD3實驗劑量組吸光度值。

1.3數據處理

2 結果與分析

2.1日本厚葉海帶巖藻聚糖硫酸酯的分離純化

日本厚葉海帶巖藻聚糖硫酸酯經DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子交換色譜分離純化后,得到5個分離組分,依次標記為F-0、F-1、F-2、F-3和F-4,各分離組分峰形相對尖銳且對稱,無拖尾現象。結果表明DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子交換柱層析對粗品F的分離效果良好,且洗脫后的巖藻聚糖硫酸酯組分主要集中在鹽洗脫部分,僅F-0為流出峰。

表1 各組分多糖及硫酸根含量測定Table 1 The contents of total polysaccharide and sulfate of different fucoidan compodsition

2.2多糖含量及硫酸根含量測定分析

2.3巖藻聚糖硫酸酯粗品及各分離組分對腫瘤細胞存活率影響

圖1 日本厚葉海帶巖藻聚糖硫酸酯對HepG2細胞存活率影響Fig.1 The effect of HepG2 cell viability by fucoidan from Kjellmaniella crassifolia注:同劑量水平標有不同大寫字母表示組間差異極顯著(p<0.01);同劑量水平標有不同小寫字母表示組間差異顯著(p<0.05),圖2、圖3同。

圖2 日本厚葉海帶巖藻聚糖硫酸酯對A549細胞存活率影響Fig.2 The effect of A549 cell viability by fucoidan from Kjellmaniella crassifolia

2.3.3 巖藻聚糖硫酸酯對結腸癌細胞HT-29存活率影響 粗品F及各分離組分對結腸癌HT-29細胞的研究結果如圖3所示,不同濃度的各組分巖藻聚糖硫酸酯對HT-29細胞存活率均有極顯著統(tǒng)計學意義(p<0.01)。很顯然,同一組分的不同劑量呈現劑量相關,即高劑量條件下HT-29細胞呈現較低的存活率。同時,結果分析發(fā)現三種劑量水平下F和F-0、F-3、F-4組分能使HT-29細胞存活率極顯著下降(p<0.01);而且粗品F和流出峰F-0在高劑量時表現出優(yōu)于鹽洗脫組分(F-1、F-2、F-3、F-4)的體外細胞抑制效果(p<0.01)。通過比較四種鹽洗脫組分對HT-29細胞存活率影響發(fā)現,高Fucoidan含量的F-4組分在50、200 μg/mL對HT-29細胞的抑制活性極顯著優(yōu)于低Fucoidan含量的F-1組分(p<0.01);而在50、200 μg/mL濃度時具有較高Fucoidan含量的 F-2組分對HT29細胞的抑制活性與F-1組分間未展現出統(tǒng)計學意義。研究結果表明,Fucoidan含量可能是影響日本厚葉海帶巖藻聚糖硫酸酯對HT-29細胞的抑制活性的主要因素,但這種抑制活性可能是多重因素共同作用的結果,例如還與相對分子質量(F-1、F-2、F-3、F-4相對分子質量分別為:136、136、119、104 kDa[15])密切相關,即巖藻聚糖硫酸酯含量越高、相對分子質量越低,對HT-29細胞抑制效果越佳。此外,六個不同組分日本厚葉海帶巖藻聚糖硫酸酯及其分離組分在三種劑量水平下都能表現出較強的HT-29細胞抑制率(最低存活率分別為30.24%、27.56%、38.40%、50.94%、34.48%和35.85%),研究結果和Han等[29]研究墨角藻(Fucus vesiculous)巖藻聚糖硫酸酯對HT-29抑制作用一致,證明日本厚葉海帶巖藻聚糖硫酸酯適宜作為抗HT-29腫瘤細胞的藥物研究,有較大開發(fā)潛力。

圖3 日本厚葉海帶巖藻聚糖硫酸酯對HT-29細胞存活率影響Fig.3 The effect of HT-29 cell viability by fucoidan from Kjellmaniella crassifolia

3 結論

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StudyonseparationandpurificationoffucoidanfromKjellmaniellacrassifoliaandantitumoractivityinvitro

PENGYong-bo,SONGYue-fan,WULong,WANGQiu-kuan*,CONGHai-hua,LIUShu

(1.College of Food Science and Engineering,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China; 2.Nation R&D Branch Center For Seaweed Processing,Dalian 116023,China; 3.Key and Open Laboratory of Aquatic Product Processing and Utilization of Liaoning Province,Dalian 116023,China)

Kjellmaniellacrassifolia;fucoidan;separation and purification;MTT assay;antitumor

2017-03-03

彭雍博(1992-)，男，碩士，研究方向：農產品加工及貯藏工程，E-mail：pengyongbo2011@126.com。

*通訊作者:汪秋寬(1962-)，女，碩士，教授，研究方向：水產品加工及綜合利用，E-mail：wqk320@dlou.edu.cn。

國家自然基金(31471610)；遼寧省海洋與漁業(yè)廳漁業(yè)推廣項目(GCNT-LN-19)。

TS201.4

:A

:1002-0306(2017)17-0283-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.055