微波輔助雙水相提取綠茶中茶多酚的研究

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(浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江杭州 310015)

微波輔助雙水相提取綠茶中茶多酚的研究

徐方祥,鄭博文,蘇袁寧,孟利欣,徐紹強(qiáng),雷超*

(浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江杭州 310015)

采用微波輔助乙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系提取綠茶中的茶多酚,對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、磷酸氫二鉀用量、提取時(shí)間、液料比和微波功率等影響因素作了詳細(xì)研究與優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,最佳工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,磷酸氫二鉀用量7.0 g,液料比50 mL·g-1,微波功率370 W,提取時(shí)間30 s,在此條件下,茶多酚得率可達(dá)38.98%。研究結(jié)果可應(yīng)用于綠茶中茶多酚的提取和綠茶品質(zhì)分析。

雙水相體系,茶多酚,響應(yīng)面法

茶多酚(Tea Polyphenols,簡(jiǎn)寫(xiě)TP),又名茶鞣質(zhì)、茶單寧,是茶葉中多羥基酚類化合物的混合物,占茶葉干重的15%～30%[1]。茶多酚是一種理想的天然食品抗氧化劑,它還具有抗衰老、抗輻射、清除人體自由基、降低血糖血脂等一系列重要功能[2]。綠茶、紅茶、烏龍茶等不同品種的茶葉中茶多酚含量差別較大。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,中檔綠茶中茶多酚含量約為22%,比中檔紅茶約高出144%,比中檔烏龍茶約高出59%[3]。

目前,國(guó)內(nèi)外常用的茶多酚的提取的方法主要有:溶劑提取法、樹(shù)脂吸附分離法、離子沉淀法、超臨界流體萃取法、微波浸提法、超聲波浸提法等[4]。溶劑提取法提取率較低,且存在有機(jī)溶劑殘留、對(duì)環(huán)境造成污染等問(wèn)題;離子沉淀法易造成某些金屬鹽的殘留而影響茶多酚產(chǎn)品的安全性;而樹(shù)脂吸附分離法存在樹(shù)脂使用壽命短,且目前尚無(wú)大規(guī)模生產(chǎn)的設(shè)備等缺點(diǎn);超臨界流體萃取法雖具有提取過(guò)程茶多酚氧化損失少、提取效率較高、提取的產(chǎn)品質(zhì)量較好等優(yōu)點(diǎn),但其設(shè)備投資大而導(dǎo)致提取成本較高。相對(duì)而言,雙水相萃取是根據(jù)組分在兩相間的選擇性分配而達(dá)到目標(biāo)成分分離的目的,因其萃取分離過(guò)程可調(diào)節(jié)因素多、操作條件較溫和、易于工業(yè)放大和操作、尤其適用于具有一定活性的生物物質(zhì)的分離和提純等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。以乙醇、異丙醇等有機(jī)試劑與磷酸氫二鉀等無(wú)機(jī)鹽配成適當(dāng)濃度的水溶液能形成雙水相體系[7-8],可應(yīng)用于蛋白質(zhì)、酶、抗生素等活性成分的提取,但迄今未見(jiàn)微波輔助乙醇-磷酸氫二鉀雙水相提取綠茶中茶多酚的報(bào)道。因此,本文對(duì)微波輔助乙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系提取綠茶中的茶多酚作一研究與探索。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

綠茶 浙江遂昌;茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品 陜西藤邁生物科技有限公司,茶多酚含量≥98%;無(wú)水乙醇、三水合磷酸氫二鉀、七水合硫酸亞鐵、四水合酒石酸鉀鈉、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;AB204-N型分析天平 上海壘固儀器有限公司;7220型分光光度計(jì) 北京北分瑞利分析儀器公司;APEX型微波合成萃取系統(tǒng) 上海屹堯儀器科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料的預(yù)處理與試液配制

1.2.1.1 原料預(yù)處理 用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)將綠茶粉碎后過(guò)80目篩,在60 ℃下干燥兩小時(shí),后置于500 mL燒杯中備用。

1.2.1.2 酒石酸亞鐵溶液配制 稱取1.00 g硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)和5.00 g酒石酸鉀鈉(C4H4O6NaK·4H2O)置于1 L容量瓶中,用去離子水溶解后定容(以低溫保存有效期10 d)。

1.2.1.3 磷酸緩沖溶液(pH7.5)配制 0.067 mol·L-1磷酸氫二鈉:稱取23.90 g十二水磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O),置于1 L容量瓶中,用去離子水溶解后定容。

0.067 mol·L-1磷酸二氫鉀:稱取磷酸二氫鉀(KH2PO4)9.08 g,置于1 L容量瓶中,用去離子水溶解后定容。

取上述0.067 mol·L-1的磷酸氫二鈉溶液85 mL和0.067 mol·L-1的磷酸二氫鉀溶液15 mL混合均勻。

1.2.2 茶多酚標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制與測(cè)定 稱取茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品0.2500 g于100 mL燒杯中,用少量去離子水溶解后轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中定容(濃度為1 mg·mL-1的茶多酚標(biāo)準(zhǔn)溶液)。精確移取1 mg·mL-1的茶多酚標(biāo)準(zhǔn)液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL分別置于25 mL比色管中,分別加入5.00、4.00、3.00、2.00、1.00、0.00 mL蒸餾水與各5.00 mL酒石酸亞鐵溶液,再用pH為7.5的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度,其得到的茶多酚標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的濃度分別為0.00、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg·mL-1。在波長(zhǎng)540 nm處用1 cm的比色皿測(cè)其吸光度。

1.2.3 綠茶中茶多酚的提取與測(cè)定 采用酒石酸亞鐵法[9],稱取1.0000 g綠茶粉末樣品于500 mL錐形瓶中,加入30 mL乙醇,20 mL水和7.0 g磷酸氫二鉀。在370 W微波功率條件下進(jìn)行微波處理45 s,趁熱抽濾得濾液。靜置5 min,待其分層,后用吸量管精確吸取分層的茶多酚上相清液0.40 mL(多酚主要集中在乙醇上相,其他成分分配于鹽水下相)于25 mL比色管中,加入去離子水4.60 mL和5.00 mL酒石酸亞鐵溶液,混勻后用pH7.5的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度,搖勻。在波長(zhǎng)540 nm處用1 cm的比色皿測(cè)其吸光度,由茶多酚標(biāo)準(zhǔn)系列溶液工作曲線方程A=4.035C+0.0003求得綠茶樣品中的茶多酚含量,計(jì)算茶多酚得率,公式如下:

式中:c-茶多酚的含量(mg·mL-1);v-濾液的體積(mL);m-萃取時(shí)所用的茶葉總量(mg);n-樣品的稀釋倍數(shù)。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)茶多酚得率的影響 稱取1.0000 g綠茶粉末樣品于500 mL錐形瓶中,保持液料比為50 mL·g-1,加入乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為(40%、50%、60%、70%、80%)的溶液,加入7.0 g的磷酸氫二鉀,搖勻待其溶解,后用320 W功率的微波反應(yīng)處理30 s,按照1.2.3中的測(cè)定步驟計(jì)算茶多酚得率。

1.2.4.2 磷酸氫二鉀用量對(duì)茶多酚得率的影響 稱取1.0000 g綠茶粉末樣品于500 mL錐形瓶中,保持液料比為50 mL·g-1,加入乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為60%的溶液,分別加入(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 g)的磷酸氫二鉀,搖勻待其溶解,后用320 W功率的微波反應(yīng)處理30 s,按照1.2.3中的測(cè)定步驟計(jì)算茶多酚得率。

1.2.4.3 提取時(shí)間對(duì)茶多酚得率的影響 稱取1.0000 g綠茶粉末樣品于500 mL錐形瓶中,保持液料比為50 mL·g-1,加入乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為60%的溶液,加入7.0 g的磷酸氫二鉀,搖勻待其溶解,后用320 W功率的微波反應(yīng)分別處理(15、30、45、60、75 s),按照1.2.3中的測(cè)定步驟計(jì)算茶多酚得率。

1.2.4.4 液料比對(duì)茶多酚得率的影響 稱取1.0000 g綠茶粉末樣品于500 mL錐形瓶中,在液料比分別為(30、40、50、60、70、80 mL·g-1)條件下,加入乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為60%的溶液,加入7.0 g的磷酸氫二鉀,搖勻待其溶解,后用320 W功率的微波反應(yīng)處理45 s,按照1.2.3中的測(cè)定步驟計(jì)算茶多酚得率。

1.2.4.5 微波功率對(duì)茶多酚得率的影響 稱取1.0000 g綠茶粉末樣品于500 mL錐形瓶中,保持液料比為60 mL·g-1,加入乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為60%的溶液,加入7.0 g的磷酸氫二鉀,搖勻待其溶解,后分別用(160、320、480、640、800 W)功率的微波反應(yīng)處理45 s,按照1.2.3中的測(cè)定步驟計(jì)算茶多酚得率。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化茶多酚提取工藝 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,固定磷酸二氫鉀用量為7.0 g,選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、微波功率、提取時(shí)間四個(gè)因素為自變量,以茶多酚得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用4因素3水平的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平和編碼Table 1 Independent variables and their levels used in the response surface design

2 結(jié)果與討論

2.1茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示,茶多酚的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的線性回歸方程為A=4.035C+0.0003,R2=0.9995,表明0～0.20 mg·mL-1濃度范圍內(nèi),茶多酚濃度C與吸光度A之間有著良好的線性相關(guān)性。

圖1 茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of tea polyphenols

2.2乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)茶多酚得率的影響

由圖2可知,在乙醇體積分?jǐn)?shù)小于60%時(shí),隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高,茶多酚得率呈現(xiàn)上升趨勢(shì),在60%時(shí)茶多酚得率達(dá)到最高值;而在乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%時(shí),茶多酚得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì),這是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)會(huì)引起茶葉中的大分子物質(zhì)如茶多糖、蛋白質(zhì)等沉淀,間接導(dǎo)致茶多酚沉淀,從而使茶多酚得率降低,這與陳鋼等[10]報(bào)道一致。因此,乙醇最佳體積分?jǐn)?shù)為60%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)茶多酚得率的影響Fig.2 Effect of the alcohol amount on the yield of tea polyphenols

2.3磷酸氫二鉀用量對(duì)茶多酚得率的影響

由圖3可知,當(dāng)磷酸氫二鉀用量為7.0 g時(shí),茶多酚得率達(dá)到最高值。后隨著磷酸氫二鉀用量的增加,茶多酚得率逐漸下降,原因是析相鹽濃度太高會(huì)抑制茶多酚在上相中的萃取,這與林維晟等[11]報(bào)道一致。因此,磷酸氫二鉀最佳用量為7.0 g。

圖3 磷酸氫二鉀用量對(duì)茶多酚得率的影響Fig.3 Effect of dipotassium hydrogen phosphate on the yield of tea polyphenols

圖4 提取時(shí)間對(duì)茶多酚得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of tea polyphenols

2.4提取時(shí)間對(duì)茶多酚得率的影響

由圖4可知,在45 s時(shí)間內(nèi),隨著提取時(shí)間的增加,茶多酚得率不斷增加。當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)45 s時(shí),茶多酚得率不再增加,反而出現(xiàn)下降的情況,這主要是由于茶多酚中的多酚羥基容易被氧化,隨著茶多酚暴露在空氣中的時(shí)間延長(zhǎng),導(dǎo)致了茶多酚的氧化分解,使得茶多酚得率下降,這與宋建紅等[12]報(bào)道一致。因此,選取最佳提取時(shí)間為45 s。

2.5液料比對(duì)茶多酚得率的影響

由圖5可知,液料比在30～60 mL·g-1范圍內(nèi),因?yàn)樘崛┯昧康脑黾?茶多酚得率隨之提高。而當(dāng)液料比高于60 mL·g-1時(shí),茶多酚得率反而下降,可能是因?yàn)榉磻?yīng)液體過(guò)大,微波輔助的效率有所降低,從而導(dǎo)致茶多酚得率的下降。并且,反應(yīng)液體太多,對(duì)成本的投入也會(huì)增大,不利于資源的節(jié)約。因此,選取最佳液料比為60 mL·g-1。

圖5 液料比對(duì)茶多酚得率的影響Fig.5 Effect of the ratio of solvent and materia on the yield of tea polyphenols

2.6微波功率對(duì)茶多酚得率的影響

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and the results of response surface analysis

表3 回歸方程模型方差分析Table 3 ANOVA for the response surface quadratic regression model

圖6 微波功率對(duì)茶多酚得率的影響Fig.6 Effect of the microwave power on the yield of tea polyphenols

注:**表示極顯著(p<0.01),*表示顯著(p<0.05)。

由圖6可知,在微波功率為160～800 W范圍內(nèi),隨著微波功率的增加,茶多酚得率先增加后減少,在480 W時(shí)達(dá)到最大值。其主要原因可能是功率超過(guò)480 W后,微波功率過(guò)大造成體系升溫過(guò)高,加速了茶多酚的氧化,使得茶多酚得率下降。因此,選取最佳微波功率為480 W。

2.7響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化茶多酚提取工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,采用4因素3水平的響應(yīng)面分析方法,對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。運(yùn)用Design-Expert.V8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,得到方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

2.7.1 方差分析及回歸方程擬合 對(duì)各因素回歸擬合所得的回歸方程如下:

圖7 兩因素的交互作用對(duì)茶多酚得率的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plots of variable parameters on the extraction of tea polyphenols

茶多酚得率(%)=+30.66-3.71A-0.84B-2.86C-3.17D+4.04AB+6.41AC+3.41AD-1.09BC+0.55BD-4.73CD-6.44A2-0.21B2-2.46C2-0.88D2

由表3可知,模型p<0.0001(極顯著),失擬項(xiàng)不顯著,說(shuō)明回歸方程具有高度的顯著性,此外,R2=92.74%,表明響應(yīng)值茶多酚得率實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度,該實(shí)驗(yàn)方案可行性較高,表明該方程是提取綠茶中茶多酚工藝參數(shù)的合適數(shù)學(xué)模型。同時(shí),A、C、D、AB、AC、CD、A2對(duì)響應(yīng)值茶多酚得率的影響極顯著(p<0.01),AD、C2對(duì)響應(yīng)值茶多酚得率顯著(p<0.05)。各因素對(duì)茶多酚得率影響程度大小依次為提取時(shí)間(D)>乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)>微波功率(C)>液料比(B)。

2.7.2 各因素交互作用影響 由Design-Expert.V8.0軟件處理可得到如圖7所示,在乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、微波功率以及提取時(shí)間的四個(gè)因素中任取兩個(gè)作為X和Y,以茶多酚得率作為Z,作出相應(yīng)的各因素交互作用的響應(yīng)面圖。表現(xiàn)為曲線越陡,說(shuō)明交互作用對(duì)茶多酚得率的影響越顯著。因此,從圖7中可以較直觀地看出,茶多酚得率隨任意兩個(gè)變量的增加都呈現(xiàn)上升趨勢(shì),達(dá)到某一極大值后,曲面下降或趨向于平緩,且A(乙醇體積分?jǐn)?shù))與C(微波功率)的交互作用對(duì)茶多酚得率影響最顯著。

2.7.3 最佳工藝的確定 利用軟件預(yù)測(cè)模型的極大值,并得出提取茶多酚的最優(yōu)條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)50.00%、液料比50 mL·g-1、微波功率368.50 W、提取時(shí)間30 s,在此優(yōu)化條件下預(yù)測(cè)茶多酚得率最大值為39.18%。為了方便實(shí)際操作,在對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證時(shí),將最佳工藝條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、微波功率370 W,保持液料比50 mL·g-1、提取時(shí)間30 s。在上述最優(yōu)下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),茶多酚得率均值達(dá)到38.98%,RSD=0.15%,為與預(yù)測(cè)值基本相符,驗(yàn)證了模型的有效性。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用微波輔助乙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系提取綠茶中的茶多酚。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇提取時(shí)間、液料比、微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)4個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,得出最佳的茶多酚提取條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、液料比50 mL·g-1、提取時(shí)間30 s、微波功率370 W。在此條件下,茶多酚得率可達(dá)到38.98%,與軟件預(yù)測(cè)值39.18%基本相符,驗(yàn)證了響應(yīng)面優(yōu)化的微波輔助乙醇—磷酸氫二鉀雙水相體系提取茶多酚的工藝切實(shí)可行。該工藝便捷、提取率較高,易保留茶多酚的活性成分,可應(yīng)用于茶葉中茶多酚的提取和綠茶品質(zhì)分析。

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Studyonextractingteapolyphenolsfromgreentea
bymicrowaveassistedaqueoustwo-phasesystems

XUFang-xiang,ZHENGBo-wen,SUYuan-ning,MENGLi-xin,XUShao-qiang,LEIChao*

(College of Biology and Environment,Zhejiang Shuren University,Hangzhou 310015,China)

Tea polyphenols were extracted from green tea by the method of microwave assisted ethanol-dipotassium hydrogen phosphate aqueous two-phase system. The effects of factors such as the alcohol amount,the amount of dipotassium hydrogen phosphate,the extraction time,the ratio of solvent and material,and the microwave power on extraction of tea polyphenols were investigated and optimized. The results showed that the optimum conditions were as follows:volume fraction of ethanol 50%,the ratio of solvent and material 50 mL·g-1,the microwave power 370 W,the extraction time 30 s. Under the optimized conditions,the yield of tea polyphenols was 38.98%. The research result can be applied to the extraction of tea polyphenols in green tea and green tea quality analysis.

aqueous two-phase systems;tea polyphenols;response surface

2016年國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201611842008)。

2017-04-14

徐方祥(1995-)，男，本科，研究方向：天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)，E-mail:497655763@qq.com。

*通訊作者:雷超(1984-)，女，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向：分析檢測(cè)，E-mail:chaolei_212@163.com。

TS201.1

:B

:1002-0306(2017)17-0188-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.036