海參體壁蛋白ACE抑制肽酶解工藝及產(chǎn)物分子量分布研究

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(寧德師范學(xué)院生物系,福建寧德 352100)

海參體壁蛋白ACE抑制肽酶解工藝及產(chǎn)物分子量分布研究

周逢芳,蔡彬新,巫鑫睿,羅芬

(寧德師范學(xué)院生物系,福建寧德 352100)

以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制率和水解度為指標(biāo),篩選出適合海參體壁蛋白水解的酶。采用單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化最優(yōu)酶的水解條件,確定其最佳水解工藝,進(jìn)而采用HPLC法探討酶解產(chǎn)物的分子量分布。結(jié)果表明:中性蛋白酶在50 ℃、pH7.5、酶量3000 U/g、酶解5 h條件下,所得酶解產(chǎn)物的ACE抑制率最高,達(dá)到56.5%。此條件下酶解產(chǎn)物經(jīng)HPLC分析,200～1000 Da(2～10肽)的海參多肽占44.1%。

海參,水解度,ACE抑制肽,分子量分布

高血壓是一種常見(jiàn)的心血管疾病,預(yù)計(jì)到2025年全世界高血壓患者將超過(guò)15.6億[1]。導(dǎo)致高血壓的原因很復(fù)雜,一些研究證明,ACE是腎素-激肽系統(tǒng)(ARS)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(KKS)的關(guān)鍵酶,通過(guò)ARS和KKS兩個(gè)途徑,ACE參與體內(nèi)血壓調(diào)節(jié),造成血壓的升高,引發(fā)高血壓[2-3],因此通過(guò)抑制ACE的活性來(lái)抑制血壓升高是可行的。

目前有許多治療高血壓的合成藥物,由于高血壓患者往往需要終身治療,因此長(zhǎng)期服用產(chǎn)生了一定的副作用,如咳嗽、皮疹等[4]。相反,食物蛋白源ACE抑制活性肽沒(méi)有表現(xiàn)出這些副作用,因此尋找新的食物來(lái)源的ACE抑制活性肽已成為重要的研究領(lǐng)域。隨著海洋生物被人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注,藻類[5-6]、蝦[7]、魚(yú)[8-10]、海參[11]、鮑魚(yú)加工副產(chǎn)品[12]等,已陸續(xù)分離出ACE抑制肽。

海參(Ludwigothureagrisea),屬海參綱,無(wú)脊椎棘皮動(dòng)物[13],具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥理活性[14]。目前海參主要的加工和保鮮技術(shù)是鹽漬,嚴(yán)重制約了海參資源的利用。因此,開(kāi)發(fā)精加工技術(shù)和高價(jià)值的產(chǎn)品,充分利用豐富的海參資源具有重要意義。海參富含蛋白質(zhì),其序列沒(méi)有生物活性[15],但酶水解釋放出的海參多肽,具備一定的生理功能[16]。蛋白酶具有高度專一性,不同酶酶切得到的肽段不同,且ACE抑制肽沒(méi)有一個(gè)固定的結(jié)構(gòu),因此酶法生產(chǎn)ACE抑制肽存在一定的盲目性,無(wú)法控制目標(biāo)肽段。只能根據(jù)酶切產(chǎn)物的活性進(jìn)行篩選目標(biāo)酶。趙元暉等[17]利用菠蘿蛋白酶從營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較低的海地瓜酶解制備ACE抑制肽;Raheleh Ghanbari[18]利用海參制備ACE抑制和抗氧化活性的雙功能蛋白水解物。本研究不同之處在于以北參南養(yǎng)的“霞浦海參”為原料,不同產(chǎn)地的海參其蛋白含量及成分應(yīng)不盡相同,酶切的肽段存在較大區(qū)別;探討不同的酶切產(chǎn)物ACE抑制活性與其分子量分布的關(guān)系。本研究的目的以ACE抑制率為指標(biāo),篩選蛋白酶,制備ACE抑制活性肽,優(yōu)化最適酶的酶解工藝,并考察所得酶解產(chǎn)物分子量分布。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮海參 福建霞浦;木瓜蛋白酶(60萬(wàn)U/g)、中性蛋白酶(6萬(wàn)U/g)、風(fēng)味蛋白酶(20萬(wàn)U/g)、胰蛋白酶(6000 U/g)、胃蛋白酶(1萬(wàn)U/g)、堿性蛋白酶(20萬(wàn)U/g)、Sephadex G-25 北京索萊寶科技有限公司(Solarbio);血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL) Sigma公司;溶菌酶、牛胰島素、桿菌肽、色氨酸、乙腈 阿拉丁公司;福林-酚等其他試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

MC電子天平 奧豪斯儀器公司;UV2550紫外光分光光度計(jì) 日本島津;PB-10PH計(jì) 上海般特儀器公司;3-16pk高速冷凍離心機(jī) sigma公司;1200高效液相色譜儀 安捷倫公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海參體壁ACE抑制肽制備工藝 將海參體壁洗凈,絞碎,取一定量勻漿液,按料水比1∶2,每克底物添加3000 U的酶,在酶的適宜條件(表1)下水解海參勻漿液。分別于1、2、3、4、5、6、7、8 h取樣,沸水浴滅酶10 min后,于4 ℃,12000 r/min離心15 min得上清液。分別測(cè)定它們的水解度和ACE活性抑制率,探討水解度與ACE抑制率的關(guān)系,確定最優(yōu)酶。

1.2.2 酶解工藝條件的優(yōu)化

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 固定料水比1∶2、時(shí)間5 h、pH7.0、加酶量3000 U·g-1,考察不同酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)對(duì)ACE抑制率的影響。固定料水比1∶2、溫度50 ℃、pH7.0、加酶量3000 U·g-1,考察不同時(shí)間(4、5、6、7、8 h)對(duì)ACE抑制率的影響。固定料水比1∶2、時(shí)間5 h、溫度50 ℃、加酶量3000 U·g-1,考察不同pH(6、6.5、7、7.5、8)對(duì)ACE抑制率的影響。固定料水比1∶2、時(shí)間5 h、溫度50 ℃、pH7.5,考察不同加酶量(1000、2000、3000、4000、5000 U/g)對(duì)ACE抑制率的影響。

表1 酶解條件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions

1.2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝 根據(jù)Box-Behnkcn的中心組合設(shè)計(jì)原理,結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇時(shí)間、溫度和酶量三個(gè)因素為自變量,以ACE抑制率為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),如表2。

表2 實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of the experiment

1.2.3 測(cè)定指標(biāo)

1.2.3.1 水解度的測(cè)定 采用甲醛滴定法測(cè)水解度[19]:DH(%)=水解液中的α-氨基氮量/原料中總氮量×100

其中采用凱氏定氮法(GB/T5009.5.2010)測(cè)定總氮含量,甲醛滴定法測(cè)定氮量。

1.2.3.2 ACE抑制肽活性的測(cè)定 根據(jù)Cushman方法[20]改進(jìn),取2.0 mg/mL海參酶解液40 μL,加入20 μL ACE溶液(25 mU/mL),在37 ℃下保溫5 min后加入50 μL HHL溶液開(kāi)始反應(yīng),反應(yīng)60 min后加入200 μL 1.0 mol/L HCl中止反應(yīng),得到反應(yīng)液,利用HPLC進(jìn)行分析測(cè)定。同時(shí)用40 μL pH8.3的硼酸緩沖液替代海參酶解液來(lái)制備反應(yīng)液,作為空白對(duì)照組。色譜檢測(cè)條件:色譜柱Zorbax SB-C18分析柱(4.6 mm×250 mm,填料粒徑5 μm);柱溫:25 ℃;流動(dòng)相：乙腈-水(25∶75,V/V,各含0.1%三氟乙酸);流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):228 nm;進(jìn)樣量:10 μL。

ACE活性抑制率(I，%)=(M-N)/M×100

式中:M-空白對(duì)照組中馬尿酸的峰面積;N-樣品組中馬尿酸的峰面積。

1.2.3.3 相對(duì)分分子量測(cè)定 分別選用分子質(zhì)量:細(xì)胞色素C(Mw 12500 Da)、抑肽酶(Mw 6500 Da)、桿菌酶(Mw 1450 Da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(Mw 451 Da)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(Mw 189 Da)標(biāo)品,配成0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液,經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾后,分析其分子量分布范圍。

色譜條件如下:SRT SEC-100 300 mm×7.8 cm;流動(dòng)相:0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0);檢測(cè):UV214 nm;流速:1 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣體積:20 μL。由分子量對(duì)數(shù)與出峰時(shí)間關(guān)系,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按上述方法分析海參酶解液的分子量分布。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Design-Expert8.0.6程序進(jìn)行分析,以p<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。采用Excel2007軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1蛋白酶初步篩選

2.1.1 六種蛋白酶對(duì)海參體壁水解度的影響 由于酶具有特異性,不同酶的酶切位點(diǎn)不同,產(chǎn)生的肽段不一樣,這決定了酶解產(chǎn)物的組成、結(jié)構(gòu)和功能。實(shí)驗(yàn)選取了六種蛋白酶,分別在各種蛋白酶的理論適宜條件下進(jìn)行水解,水解進(jìn)程曲線如圖1所示。雖然不同酶水解海參蛋白的能力存在差異,但總體來(lái)說(shuō),酶解過(guò)程中水解度的變化趨勢(shì)基本相同,DH隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大,前期水解度快速上升,后期水解度升高緩慢,這可能是因?yàn)殡S著水解反應(yīng)的進(jìn)行,可供蛋白酶水解的肽鍵數(shù)不斷減少,或者體系中的酶活力下降或喪失。

圖1 蛋白酶水解產(chǎn)物酶解進(jìn)程曲線Fig.1 Hydrolysis curves of hydrolysates

在六種酶中,堿性蛋白酶水解海參體壁蛋白的能力最強(qiáng),2 h內(nèi)DH就達(dá)到24.5%。這是由于堿性蛋白酶是一種非特異性肽鍵內(nèi)切酶,有較多的切割位點(diǎn),從肽鏈內(nèi)部水解底物,產(chǎn)生大量小片段多肽,從而表現(xiàn)出了高水解度的特點(diǎn)。中性蛋白酶對(duì)海參蛋白的水解作用稍低于堿性蛋白酶。風(fēng)味蛋白酶所含酶的種類復(fù)雜,作用范圍較廣,能夠進(jìn)行比較徹底的酶解。胰蛋白酶和木瓜蛋白底物位點(diǎn)的專一性較高。胃蛋白只能促進(jìn)各種水溶性蛋白質(zhì)水解成為多肽,所以其水解能力相對(duì)較弱。

2.1.2 六種酶對(duì)海參體壁ACE抑制活性的影響 測(cè)定六種蛋白酶不同酶解時(shí)間的ACE抑制活性,探討DH對(duì)ACE抑制活性的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2。在水解反應(yīng)的初期,ACE抑制率隨水解度的升高而不斷上升,在反應(yīng)后期,水解液的ACE抑制率均有不同程度的下降,可能是因?yàn)樗馇捌诰哂蠥CE抑制活性的肽段就被迅速釋放出來(lái)了,后期ACE抑制肽被降解為無(wú)活性的肽或氨基酸,導(dǎo)致酶解產(chǎn)物的抑制活性降低。這說(shuō)明高水解度不一定具有高ACE抑制活性,即水解度與ACE抑制率之間不存在漸減或漸增的對(duì)應(yīng)關(guān)系。由于實(shí)驗(yàn)的主要目的是制備ACE 抑制活性強(qiáng)的多肽,ACE抑制活性被作為考察選酶的關(guān)鍵因素,因此選用中性蛋白酶作為制備海參體壁ACE抑制肽的酶。

圖2 蛋白酶水解產(chǎn)物ACE活性進(jìn)程曲線Fig.2 ACE inhibitory activity curves of hydrolysates

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶解時(shí)間對(duì)ACE抑制活性的影響 由圖3可知,酶解5 h時(shí),其ACE抑制率最強(qiáng)。當(dāng)酶解時(shí)間在4～5 h,隨時(shí)間的延長(zhǎng),ACE抑制率增加明顯,可能是活性肽量增多。在5～8 h時(shí),ACE抑制率逐漸變小,可能是過(guò)度水解生成了ACE抑制活性較低的小分子多肽或游離氨基酸。

圖3 時(shí)間對(duì)海參ACE抑制活性的影響Fig.3 Effect of time on ACE inhibitory activity

2.2.2 酶解溫度對(duì)ACE抑制活性的影響 由圖4可知,海參多肽ACE抑制率呈先上升后下降的趨勢(shì),溫度為50 ℃時(shí),ACE抑制率最高,達(dá)到54.3%,溫度為60 ℃時(shí),ACE抑制率最低,達(dá)到27.6%,可以看出溫度對(duì)酶的作用影響較大?？赡茉蚴菧囟容^低時(shí),沒(méi)達(dá)到中性蛋白酶的最適溫度,酶未充分發(fā)揮功效。當(dāng)溫度過(guò)高時(shí),酶結(jié)構(gòu)破壞,酶活力降低。

圖4 溫度對(duì)海參ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of temperature on ACE inhibitory activity

2.2.3 酶解pH對(duì)ACE抑制活性的影響 由圖5可知,pH7.5時(shí)ACE抑制率最強(qiáng),為51.2%,但隨pH變化ACE抑制率變化不顯著(p>0.05),可能是由于中性蛋白酶適應(yīng)的pH較廣。由于pH對(duì)抑制率影響不明顯,因此不作為響應(yīng)面研究因素,選擇抑制率最強(qiáng)點(diǎn)pH7.5作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的pH。

圖5 pH對(duì)海參ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of pH value on ACE inhibitory activity

2.2.4 酶量對(duì)ACE抑制活性的影響 由圖6可知,ACE抑制率隨著酶量的增加而升高,酶量3000 U/g時(shí)到達(dá)最大值,而后減小,4000 U/g后活性基本保持不變?？赡苁敲噶康脑黾?促進(jìn)蛋白水解出活性多肽。當(dāng)酶到一定量時(shí),部分活性多肽被水解成無(wú)活性的小分子肽或游離氨基酸,而后趨于穩(wěn)定。

表4 回歸系數(shù)模型及方差分析表Table 4 Coefficient of regression model and variance analysis

圖6 酶量對(duì)海參ACE抑制率的影響Fig.6 Effect of enzyme amount on ACE inhibitory

2.3響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 回歸方程的建立與方差分析 以時(shí)間(X1)、溫度(X2)、酶量(X3)為響應(yīng)變量,以ACE抑制率(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表3。經(jīng)過(guò)Design Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件處理,得到3個(gè)因素與響應(yīng)值的回歸方程為:

Y=54.86+2.63X1-2.56X2+2.89X3+0.2X1X2+0.65X1X3-3.42X2X3-6.72X12-5.59X22-7.24X32

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiment

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照最佳提取條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,重復(fù)三次,同時(shí)考慮到實(shí)際操作的便利,將ACE抑制肽的最佳酶解條件修正為:酶解溫度50 ℃、pH7.5、加酶量3000 U/g、酶解5 h。實(shí)際測(cè)得的ACE抑制率為56.5%。

2.4酶解液的相對(duì)分子量分布

混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜,如圖8,以Rt-lgMw 作對(duì)數(shù)曲線如圖9,得到方程:lgMw=-0.4423Rt+7.9916(R2=0.9978)。圖10為中性蛋白酶最佳條件下酶解產(chǎn)物HPLC圖。根據(jù)方程式,海參酶解液的相對(duì)分子量2000 Da以上占13.25%,1000～2000 Da占28.21%,1000～200 Da占了44.1%,200～1000Da組分占的比例較大,這現(xiàn)象與具有ACE抑制活性的多肽主要集中在的2～10肽相符合[21]。

表5 中性蛋白酶酶解液相對(duì)分子量分布Table 5 Molecular weight distribution (percent of the total area)of protein hydrolysate

圖7 酶量和時(shí)間對(duì)酶解液ACE抑制率影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.7 Response surface plot and contour plot revealing effects of amount of enzyme and time on ACE inhibitory rate of hydrolysates

圖8 混合標(biāo)樣色譜圖像Fig.8 Chromatogram image of mixed standard sample

圖9 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Standard curve of relative molecular weight

圖10 中性酶酶解液的分子量分布色譜圖Fig.10 The molecular weight distribution of the protein hydrolysates

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)通過(guò)初步分析水解度與ACE抑制活性的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)水解度與ACE抑制率之間不存在著對(duì)應(yīng)關(guān)系。六種海參體壁蛋白酶解物中,中性蛋白酶解物的ACE抑制率最好。通過(guò)采用單因素和響應(yīng)面法,中性蛋白酶其最佳水解工藝條件為50 ℃、pH7.5、酶量3000 U、酶解5 h條件下,所得酶解產(chǎn)物的ACE抑制率最高,達(dá)到56.5%,抑制肽濃度為21.5 mg/mL,此條件下酶解產(chǎn)物經(jīng)HPLC分析,海參多肽在200～1000 Da(2～10肽)間占了44.1%。

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StudyonhydrolysisconditionandmolecularweightdistributionofACEinhibitorypeptidederivedfromseacucumberprotein

ZHOUFeng-fang,CAIBin-xin,WUXin-rui,LUOFen

(Department of Biology,Ningde Normal University,Ningde 352100,China)

With the hydrolysis degree and ACE inhibitory rate the index,the optimum enzyme was selected for hydrolyzing sea cucumber protein. The optimal condition for enzymatic hydrolysis was investigated through single factor experiment and orthogonal. HPLC was used to determine the molecular distribution of the hydrolysate. The results showed that the optimum enzyme was neutral protease. The optimized parameters were temperature 50 ℃,time 5h,pH7.5 and amount of enzyme 3000U/g . Under this condition,ACE inhibition rate was up to 56.5% and the relative molecular weight of 200～1000 Da(2～10 peptides)reached 44.1% .

sea cucumber;the degree of hydrolysis(DH);ACE inhibitory peptide;molecular weight distribution

2017-02-20

周逢芳(1978-),男,碩士，講師，研究方向：活性物質(zhì)提取和功能研究，E-mail:zhoufengfang123@163.com。

福建省科技重點(diǎn)項(xiàng)目(2014N0016);寧德科技局項(xiàng)目(20130139);校級(jí)項(xiàng)目(2015T10)。

TS201.2

:B

:1002-0306(2017)17-0163-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.031