鈍裂銀蓮花居群遺傳多樣性及其與生態(tài)因子相關性

,,,

(蘭州理工大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730050)

鈍裂銀蓮花居群遺傳多樣性及其與生態(tài)因子相關性

劉志鵬,劉左軍*,楊利云,徐文

(蘭州理工大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730050)

采用RAPD技術分析了4個地區(qū)(合作、碌曲、瑪曲、阿孜)不同花色(黃、淺、白)11個鈍裂銀蓮花居群的遺傳結構。結果表明:鈍裂銀蓮花居群遺傳多樣性較高,Shannon多樣性指數(shù)(I)為0.6025,Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)為0.4166,Nei’s基因分化系數(shù)(Gst)和AMOVA分析表明鈍裂銀蓮花居群間分化程度較低,大部分變異存在于居群內(nèi)(67%),居群間占一小部分(33%)。對不同居群進行UPGMA聚類分析,結果顯示11個亞居群可以歸為3大支。相關性分析表明遺傳多樣性與地理分布和土壤營養(yǎng)狀況有相關性。

RAPD,鈍裂銀蓮花,遺傳多樣性,生態(tài)因子

鈍裂銀蓮花(Anemoneobtusiloba)為毛茛科(Ranunculaceae)毛茛亞科銀蓮花屬(AnemoneL.)的一種,是多年生蟲媒兩性花的自交親和植物,其花部結構泛化,一般由蜜蜂和蠅類進行傳粉,偶見螞蟻訪花[1],常見花色有黃、淺和白三種,也有處于三種花色之間的過渡色[2]。鈍裂銀蓮花主要分布于喜馬拉雅山區(qū)和青藏高原東緣地區(qū),在我國則生長于西藏南部和東部、甘肅南部和四川西北部[3]。鈍裂銀蓮花是高寒草甸一種常見的毒雜草,不能被牛羊所食用,是造成高寒草場退化的物種之一[4]。目前,對鈍裂銀蓮花的研究主要集中在化學成分[5]、藥用價值[6]、傳粉[7]、化感[8]、性分配和繁殖分配[9-10]等方面,未見有從DNA分子水平來探究鈍裂銀蓮花如何在特定生態(tài)環(huán)境中與其他復雜的環(huán)境因子相互作用而形成現(xiàn)有的生物學特性和分布格局的報道。本文以RAPD技術從DNA分子水平分析鈍裂銀蓮花居群遺傳多樣性特征,豐富鈍裂銀蓮花分子生態(tài)學研究,并與其宏觀生態(tài)學特征相聯(lián)系,為進一步了解鈍裂銀蓮花花色維持、進化機制和防治高寒草場退化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

鈍裂銀蓮花 2015年6月于甘肅省甘南藏族自治州合作、碌曲、瑪曲和阿孜4個地區(qū)采集不同花色居群的11個鈍裂銀蓮花材料,每種花色居群選25株鈍裂銀蓮花干凈健康無病蟲害的葉片,將葉子放入信封中,帶回實驗室干燥處理后將其封裝于裝有硅膠干燥劑的密封袋中,然后于-20 ℃冰箱中冷凍保存,供提取基因組DNA;RAPD隨機引物 購自Sangong公司。

Cary5000紫外可見分光光度計 Varian;TGL-16B高速離心機 上海安亭科學儀器廠;ModelMG96+DNA擴增儀 杭州郎基科學儀器有限公司;DYCP-31DN電泳儀 北京六一儀器廠;10,100,200,1000 μL 上海大龍;BCD-206Y冰箱 青島海爾有限公司;YX-24LD蒸汽滅菌鍋 科創(chuàng)化玻儀器中心;HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠;AB104-N 分析天平 梅特勒儀器有限公司。

表1 鈍裂銀蓮花居群生態(tài)特征變量Table 1 Ecological variables in A. obtusiloba population

注:同行不同字母表示顯著性差異(p<0.05)。

1.2實驗方法

1.2.1 樣地生態(tài)因子測定 實驗樣地位于甘肅省甘南藏族自治州(101～103°E,34～35°70′N),年均降水量450～780 mm,降雨主要分布7～9月;年平均氣溫為1.8 ℃,七月份平均溫度11.7 ℃,生長季最高氣溫23.6～28.9 ℃年平均霜期不少于270 d。草地類型主要以高寒草甸為主,其高寒草甸有地勢開闊、多風,氣候寒冷等特點。主要的伴生種有:小嵩草(Kobresiapygmaea)、垂穗披堿草(Elymusnutans)、早熟禾(Poaannua)、異針茅(Stipaaliena)、短穗兔耳草(Lagotisbrachystachya)、美麗鳳毛菊(Saussureasuperba)、三裂葉堿毛茛(Halerpestestricuspis)等主要牧草[11]。

取地表0～10 cm土樣,按照《土壤農(nóng)化分析手冊》[12]對土壤水分、pH、有機質(zhì)、速效磷、速效氮、速效鉀和全磷進行測定,結果見表1。

1.2.2 DNA提取 采用改進的CTAB方法(即用氯仿-異戊醇抽提之前加用苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提一次)提取基因組DNA,通過測定紫外吸收值確定DNA樣品的濃度和純度,通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的完整性,合格的DNA樣品在-20 ℃的低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物篩選與PCR擴增 隨機選取2個樣品基因組DNA作為擴增模板,從100個RAPD隨機引物中篩選出擴增條帶清晰、多態(tài)性較高和重復性較好的14條引物(表2)。RAPD-PCR反應是在Model MG96+PCR擴增儀上進行的,最優(yōu)擴增條件為:總體系為20 μL,10×buffer 2 μL,模板DNA 30 ng,引物0.4 mmol·L-1,Taq DNA酶0.5 U,dNTPs 0.4 mmol·L-1,Mg2+2.5 mmol·L-1,補滅菌ddH2O至20 μL;擴增程序為:96 ℃預變性5 min 30 s,94 ℃變性1 min 10 s,37 ℃退火1 min 40 s,72 ℃延伸1 min 10 s,共40個循環(huán),最后72 ℃續(xù)補6 min 30 s。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離,4S Red核酸染液染色后拍照記錄。

1.3數(shù)據(jù)分析

1.3.1 條帶計數(shù) 根據(jù)各分子標記的遷移率及其有無統(tǒng)計得出所有位點的二元數(shù)據(jù):能重復出現(xiàn)且穩(wěn)定清晰的RAPD條帶(陽性)記為1,不出現(xiàn)的條帶(陰性)記為0,強帶、弱帶的均賦值為1,統(tǒng)計得到所有位點的二元數(shù)據(jù),由此形成的RAPD表型數(shù)據(jù)矩陣用于進一步分析。

1.3.2 鈍裂銀蓮花居群遺傳特征分析 用POPGENE 1.32軟件在假定居群處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)[13]下,計算多態(tài)位點百分率(PPL)、Nei’ s基因多樣性指數(shù)(He)、Shannon 信息指數(shù)(I)、居群間的遺傳分化系數(shù)(Gst)、Nei’ s遺傳距離(GD)和遺傳一致度(GI)[14]。用AMOVA(Analysis of molecular variation)分析居群遺傳變異[15]。用NTsys 2.10e軟件基于Nei’ s遺傳一致度(GI),采用UPGMA(Unweighted pair group method using arithmetic averages,非加權配對算術平均法)對11個鈍裂銀蓮花居群聚類分析,得到遺傳相似系數(shù)聚類圖[16]。

1.3.3 鈍裂銀蓮花居群遺傳特征與生態(tài)因子相關性測定 采用SPSS 20對鈍裂銀蓮花居群遺傳多樣性和遺傳距離與各生態(tài)因子進行相關性分析,并做主成分分析(Principal component analysis,PCA)。

2 結果與分析

2.1引物序列及擴增結果

對4個地域11個不同顏色居群共220個個體進行擴增,共得到792條帶,只有一個位點不具備多態(tài)性,總多態(tài)性比率為98.61%;每條引物的多態(tài)位點數(shù)2～7不等,其多態(tài)位點比率在0.667～0.989之間,其中引物S5對碌曲淺色居群(LQS)20個個體擴增結果見圖1。

表2 實驗所用RAPD引物及其序列Table 2 RAPD primers used in the analysis

圖1 引物S5對碌曲淺色居群擴增結果Fig.1 RAPD-PCR results of population LQS with Primer S5

2.2鈍裂銀蓮花的遺傳多樣性

鈍裂銀蓮花居群內(nèi)的多態(tài)位點率從77.78%到98.73%不等,平均為95.44%,每個位點平均有效等位基因為1.7435。Nei’s基因多樣性在居群水平上處于0.3153～0.3799之間,在物種水平上是0.4166;Shannon信息指數(shù)在居群水平處于0.4611～0.5568之間,在物種水平上是0.6025。在各居群之間,瑪曲淺色(MQS)居群的多態(tài)位點比率(PPL)最高,瑪曲白色(MQW)居群的最低,各居群的多態(tài)性比率順序為:MQS>HZS>MQY>AZY>AZS>LQY>LQW>LQS>HZW>HZY>MQW(見表3)。

表3 鈍裂銀蓮花居群遺傳多樣性分析統(tǒng)計Table 3 Summary of genetic variation statistics of populations of A.obtusiloba

注：HZY:合作黃色;HZS:合作淺色;HZW:合作白色;LQY:碌曲黃色;LQS:碌曲淺色;LQW:碌曲白色;MQY:瑪曲黃色;MQS:瑪曲淺色;MQW:瑪曲白色;AZY:阿孜黃色;AZS:阿孜淺色;表6同。

2.3鈍裂銀蓮花的遺傳結構分析

根據(jù)popgene1.32軟件計算得知,11個鈍裂銀蓮花居群間的遺傳分化指數(shù)(Gst)為0.1795,總居群基因多樣度(Ht)為0.4166,居群內(nèi)基因多樣度(Hs)為0.34184,基因流(Nm)每代居群間平均為2.2863(見表4)。由此可以得出:居群間遺傳變異占總變異的17.95%,居群內(nèi)的個體間遺傳變異占82.08%。進一步用Genalex中AMOVA分析得出,居群間變異百分率為33%,居群內(nèi)變異百分率為67%。結果基本與POPGNEN 1.32軟件分析結果一致(見表5)。

遺傳距離和一致度是從不同角度表征居群(或個體)間的遺傳變異水平。經(jīng)分析得知,鈍裂銀蓮花居群間遺傳一致度的變化范圍為0.6154～0.9583,平均遺傳一致度為0.7339;居群間遺傳距離(GD)從0.0417～0.3549不等,平均遺傳距離為0.2661。合作淺色(HZS)亞居群與阿孜黃色(AZY)亞居群間的遺傳距離最大,為0.3549;合作黃色(HZY)亞居群與合作淺色(HZS)亞居群間的遺傳距離最小,為0.0417(見表6)。

基于Nei’s無偏距離分析的鈍裂銀蓮花各居群的遺傳一致度,利用NTsys(ver. 2.10e)中UPGMA模塊對11個亞居群間遺傳關系進行聚類分析(如圖2),以遺傳一致度0.78為基準,11個亞居群可以歸為3大支,第一支是合作鈍裂銀蓮花;第二支是碌曲黃、淺和白色居群,瑪曲黃色和淺色居群;第三支是阿孜黃、淺色居群和瑪曲白色居群。

表4 鈍裂銀蓮花居群遺傳分化Table 4 Genetic differentiation of populations of A.obtusiloba

表5 鈍裂銀蓮花居群AMOVA分析Table 5 Analysis of molecular variance for populations of A.obtusiloba

表6 鈍裂銀蓮花亞居群間遺傳一致度(對角線下方)和遺傳距離(對角線上方)Table 6 Nei’s unbiased measures of genetic identity and genetic distance

圖2 鈍裂銀蓮花居群聚類圖Fig.2 Dendrogram of 11 subpopulations of A.obtusiloba

2.4鈍裂銀蓮花居群遺傳特征與生態(tài)因子的相關性

2.4.1 主成分分析(PCA) 在圖3中,X軸代表第一主分量,反映的是鈍裂銀蓮花居群遺傳變異隨經(jīng)度變化特征;Y軸表示第二分量,反映的鈍裂銀蓮花居群遺傳變異隨緯度變化特征;Z軸是第三分量,反映的鈍裂銀蓮花居群遺傳變異隨海拔變化特征。以上均表明鈍裂銀蓮花居群遺傳變異都與距離相關。圖中表明,合作黃色(HZY)、淺黃色(HZS)居群構成一個分布區(qū);合作白色(HZW)、碌曲黃色(LQY)和碌曲淺色(LQS)居群構成一個分布區(qū);碌曲白色(LQW)、瑪曲黃色(MQY)和瑪曲淺色(MQS)居群構成一個分布區(qū);阿孜黃色(AZY)、阿孜淺色(AZS)和瑪曲白色(MQW)居群構成一個分布區(qū)。這與UPGMA計算結果和實際地理分布都比較符合。

2.4.2 遺傳多樣性、遺傳距離與生態(tài)因子相關性 將鈍裂銀蓮花居群遺傳多樣性、遺傳距離與生態(tài)因子進行相關性分析,結果表明(見表7):鈍裂銀蓮花的多態(tài)位點比率(PPL)、Shannon信息指數(shù)(I)與海拔、土壤有機質(zhì)和速效氮(AN)含量呈極顯著負相關(p<0.01),與速效磷(AP)和全磷(P)呈顯著負相關(p<0.05);Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)與土壤有機質(zhì)和速效氮(AN)含量呈極顯著負相關,與海拔、全磷(P)呈顯著負相關(p<0.05),與緯度呈顯著正相關(p<0.05)。這說明海拔越低,土壤營養(yǎng)成分含量越低,鈍裂銀蓮花居群遺傳多樣性越高。遺傳距離(GD)與海拔呈極顯著正相關(p<0.01),與土壤含水量、速效氮(AN)呈顯著正相關(p<0.05)。

表7 遺傳多樣性、遺傳距離與生態(tài)因子相關系數(shù)Table 7 The correlation coefficients among genetic diversity, distance and ecological factors

注:*:p<0.05;**:p<0.01。

3 結論與討論

植物的遺傳多樣性是生物本身的遺傳信息與特定生態(tài)環(huán)境中生物、非生物的環(huán)境因子相互作用的結果,是生物基因組與復雜的生態(tài)環(huán)境相互作用的綜合表現(xiàn)[17]。本研究表明:裂銀蓮花居群內(nèi)的多態(tài)位點率從77.78%到98.73%不等,平均為95.44%,與其他植物相比具有較高的遺傳多樣性。如陽翠等[18]利用RAPD技術分析了野生苦豆子(Sophoraalopecuroides)22個居群的遺傳多樣性,得出多態(tài)性比率為90.76%;付薇等[19]對馬蹄金(Dichondrarepens)種子資源遺傳多樣性的研究得出多態(tài)性比率為91.45%。11個居群多態(tài)性比率與Shannon信息指數(shù)和Nei’s基因多樣性指數(shù)分析結果基本一致。

遺傳變異主要是由選擇、突變和基因流等因素產(chǎn)生,空間距離在一定程度上也能夠使居群間產(chǎn)生遺傳變異和分化[20]。POPGENE1.32和AMVOA計算結果都表明鈍裂銀蓮花的遺傳變異主要發(fā)生在居群內(nèi),居群間的遺傳變異占一小部分,這與孫濤等[21]利用ISSR技術分析鈍裂銀蓮花遺傳變異結果相符合,也與鈍裂銀蓮花屬于自交親和植物這一事實相符。由于存在地理隔離,鈍裂銀蓮花居群間已經(jīng)發(fā)生了較高的遺傳分化。UPGMA聚類分析和主成分分析的結果說明了這一點。植物遺傳變異不一定大部分發(fā)生在居群內(nèi),如司慶文等[23]用RAPD技術對青藏高原入侵雜草黃帚橐吾(Ligulariavirgaurea)的遺傳變異的研究結果表明67.64%的遺傳變異發(fā)生在黃帚橐吾種群間,31.74%遺傳變異存在種群內(nèi)。

鈍裂銀蓮花居群間遺傳多樣性和遺傳變異與環(huán)境因素相關。海拔越低,土壤營養(yǎng)成分含量越低,鈍裂銀蓮花居群遺傳多樣性越高;土壤含水量、速效氮(AN)含量在鈍裂銀蓮花的地理分布中可能起著一定的作用,鈍裂銀蓮花居群遺傳距離與地理隔離有很大關系。這可能是鈍裂銀蓮花適應復雜殘酷青藏高原環(huán)境的結果。

[1]趙志剛.青藏高原高寒草甸常見毛茛科植物繁殖對策研究[D].蘭州:蘭州大學,2006.

[2]中國科學院中國植物志編輯委員會中國植物志[M].北京:科學出版社,2007:28.

[3]藍雯琳,劉左軍,劉志鵬.響應面法優(yōu)化鈍裂銀蓮花花色素提取工藝[J].草業(yè)科學,2017,34(1):186-193.

[4]薛德艷,劉左軍,高望,等.鈍裂銀蓮花花色素成分及其穩(wěn)定性[J]. 草業(yè)科學 2015,32(10):1569-1575.

[5]Tiwari K P,Singh R B. Rivularinin,a new saponin from Anemone rivularis[J]. Phytochemistry,1978,17(11):1991-1994.

[6]曹沛,吳鳳鍔,丁立生.銀蓮花屬植物的化學及藥理研究概況[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2004,16(6):581-584.

[7]高望.鈍裂銀蓮花傳粉生態(tài)學研究[D].蘭州:蘭州理工大學,2015.

[8]藍雯琳.鈍裂銀蓮花化感作用研究[D].蘭州:蘭州理工大學,2016.

[9]胡春,劉左軍,伍國強,等.鈍裂銀蓮花花部綜合特征及其繁育系統(tǒng)[J].草地學報,2013(4):783-788.

[10]李冰,劉左軍,趙志剛,等.海拔對鈍裂銀蓮花不同花色居群間繁殖特征及繁殖分配的影響[J].草地學報,2013,22(1):10-19.

[11]魏盼盼,張榮,王璠,等.青藏高原東緣高寒草甸群落物種間相互作用[J]. 蘭州大學學報:自然科學版,2011(5):79-89.

[12]勞家檉.土壤農(nóng)化分析手冊[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社,1988:2-15.

[13]Chevillon C,Pasteur N,Marquine M. Population Structure and Dynamics of Selected Genes in the Mosquito Culex pipiens[J]. Evolution,1995,49(5):997-1007.

[14]Wang Y,Bi R,Yan G,et al. Genetic diversity and environmental adaptability of Petrosimonia sibirica in oasis-desert transitional area of Fukang,Xinjiang[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica,2006.

[15]Bachmann K. Molecular markers in plant ecology[J]. New Phytologist,1994,126(3):403-418.

[16]Higgins D G,Sharp P M. CLUSTAL:a package for performing multiple sequence alignment on a microcomputer[J]. Gene,1988,73(1):237-44.

[17]李丹,彭少麟.三個不同海拔梯度馬尾松種群的遺傳多樣性及其與生態(tài)因子的相關性[J]. 生態(tài)學報,2001,21(3):415-421.

[18]陽翠,張曉崗,楊玉蓉,等.苦豆子種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析[J].草業(yè)科學 2012,29(11):1692-1697.

[19]付薇,周玉鋒,干友民,等.20份馬蹄金種質(zhì)資源遺傳多樣性RAPD和SRAP分析[J]. 草業(yè)科學2012,29(6):943-949.

[20]Si Qing-wen,Wu Gui-li,Yang Hui-ling,et al. Genetic variation within and among populations of Ligularia virgaurea(Asteraceae),an invasive weed in the grassland ecosystem of the Qinghai-Tibetan Plateau[J]. Pratacultural Science,2010,27(203):77-87

[21]孫濤,劉左軍,劉鳳梅,等.鈍裂銀蓮花不同居群遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 草業(yè)學報 2013,22(3):259-265.

GeneticdiversityinAnemoneobtusilobapopulationsanditsrelationshipwithecologicalfactors

LIUZhi-peng,LIUZuo-jun*,YANGLi-yun,XUWen

(School of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China)

The genetic structure of 11 different populations of floral-colorAnemoneobtusilobain 4 different areas of Gannan were evaluated using random amplified polymorphism DNA(RAPD). The results showed that the genetic diversity inAnemoneobtusilobapopulations was quite high:The Shannon index(I)was 0.6025 and Nei’s gene diversity(H)was 0.4166. Moreover,the differentiation level among populations was low based on Nei’s Gst value and analysis of molecular variance(AMOVA). Less than 33% of genetic diversity was attributed to the differentiation among populations while more than 67% resided within the different populations. According to unweighted pair group method using arithmetic averages(UPGMA)result,11 populations ofA.obtusilobawere clustered into 3 groups. Further correlation analysis showed that genetic diversity and distance correlated with geographical distribution and soil nutrition.

RAPD;Anemoneobtusiloba;genetic diversity;ecological factors

2017-04-14

劉志鵬(1991-)，男，在讀碩士研究生，主要從事分子生態(tài)學研究，E-mail:liuzhipengzmj@foxmail.com。

*通訊作者:劉左軍(1957-)，男，博士，教授，主要從事植物種群生態(tài)學研究，E-mail:zuojunl@lut.cn。

國家自然科學基金(30960066)。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)17-0141-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.028