轉(zhuǎn)基因作物代謝組差異的協(xié)同性分析

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(1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 100029;2.廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,廣西南寧 530021;3.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,海南海口 570311)

轉(zhuǎn)基因作物代謝組差異的協(xié)同性分析

許文杰1,杜智欣2,張亮亮3,付偉1,*

(1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 100029;2.廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,廣西南寧 530021;3.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,海南海口 570311)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用十分廣泛,尤其是用于獲得具備優(yōu)良性狀的農(nóng)作物新品種。但在轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化推廣的同時,農(nóng)產(chǎn)品的安全問題一直備受關(guān)注。組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,為轉(zhuǎn)基因作物的安全評價提供了新方法。鑒于代謝組數(shù)據(jù)具有即時性和可獲得性的特點(diǎn),本文基于之前的研究,通過收集轉(zhuǎn)基因作物代謝組方面文章的數(shù)據(jù),對6種作物的野生型和轉(zhuǎn)基因型樣本的比較結(jié)果進(jìn)行整合分析,通過顯著性檢驗(yàn)得到了8種代表性差異代謝物。代謝通路富集分析結(jié)果顯示與這8種差異代謝物關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)主要參與能量代謝過程,與已報(bào)道的單一物種轉(zhuǎn)基因非預(yù)期效應(yīng)的研究結(jié)果相同。該研究從代謝物和蛋白質(zhì)兩個方面說明轉(zhuǎn)基因事件影響了這6種作物的能量代謝過程,并且該現(xiàn)象很可能普遍存在于多種轉(zhuǎn)基因作物中。希望本研究結(jié)果可以為轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的安全評價提供參考。

轉(zhuǎn)基因作物,安全評價,代謝組學(xué),差異代謝物,能量代謝

轉(zhuǎn)基因是指利用基因工程原理,將決定優(yōu)良性狀的外源片段導(dǎo)入目標(biāo)動植物體內(nèi),DNA進(jìn)行重組,從而獲得抗病、耐寒、耐旱、高產(chǎn)和高營養(yǎng)價值等優(yōu)質(zhì)品種的過程。在轉(zhuǎn)基因應(yīng)用中以轉(zhuǎn)基因植物最為普遍,自從美國1996年將轉(zhuǎn)基因延熟番茄批準(zhǔn)進(jìn)入市場,并成為第一個將轉(zhuǎn)基因作物商品化進(jìn)入市場的國家后,多種轉(zhuǎn)基因作物相繼培育成功并獲得批準(zhǔn)進(jìn)入市場[1]。2016年是轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化21周年,全球轉(zhuǎn)基因作物累計(jì)種植面積達(dá)到空前的21億公頃,轉(zhuǎn)基因作物由玉米、大豆、棉花和油菜擴(kuò)展到甜菜、木瓜、茄子和馬鈴薯。種植轉(zhuǎn)基因作物的國家已達(dá)到26個,包括19個發(fā)展中國家和7個發(fā)達(dá)國家,中國作為發(fā)展中國家不僅在轉(zhuǎn)基因作物種植面積排名前10[2],而且是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)口大國。轉(zhuǎn)基因作物在解決溫飽問題的同時,也為農(nóng)民乃至為全社會帶來了巨大的農(nóng)業(yè)、環(huán)境、經(jīng)濟(jì)、健康和社會效益。

轉(zhuǎn)基因作物是通過人為操作獲得的,并不是自然進(jìn)化而來。由于外源基因的插入具有隨機(jī)性,轉(zhuǎn)基因樣本與親本在表型、反應(yīng)和組成上會存在一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[3],可能包括一些非預(yù)期效應(yīng),所以在大力推廣轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的同時,其安全性問題也一直是爭議的焦點(diǎn)。世界上不同的國家對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品有不同的管理和標(biāo)識,并且國際上公認(rèn)的識別轉(zhuǎn)基因非預(yù)期變化的技術(shù)都是基于實(shí)質(zhì)等同(substantial equivalence)原則[4]。近年來,由于生物技術(shù)的不斷創(chuàng)新,轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組等組學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展,應(yīng)用組學(xué)數(shù)據(jù)從多水平分析轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性問題也日益成為熱點(diǎn)。但大量的組學(xué)數(shù)據(jù)研究結(jié)果表明,在實(shí)驗(yàn)同質(zhì)性較差的情況下,許多研究并沒有呈現(xiàn)出相同的結(jié)果。除外源基因的插入外,環(huán)境、遺傳背景和實(shí)驗(yàn)技術(shù)等因素都會對植物的生長產(chǎn)生影響[5]。截止到目前,通過單一組學(xué)研究也未能找出一條完整的與表型變化相關(guān)的受調(diào)控通路[6-7],所以綜合多方面了解轉(zhuǎn)基因作物的整體變化情況是十分必要的。

三種組學(xué)技術(shù)都具有各自的優(yōu)勢:轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以測定生物體、組織或細(xì)胞在特定條件下的表達(dá)基因,并且對其進(jìn)行定量;蛋白質(zhì)組學(xué)是從整體水平來研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能,包括蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾和相互作用等;代謝組學(xué)能夠定量描述生物內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體及其對內(nèi)因和外因變化的應(yīng)答規(guī)律[8],數(shù)據(jù)具有即時性,更能直接反映出轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對食用對象的影響,相對于已有的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組研究,代謝組數(shù)據(jù)的可獲得性更強(qiáng)。許多轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性評價都是通過代謝物數(shù)據(jù)分析完成的,其測定技術(shù)也在逐漸完善,主要包括核磁共振法(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)[9]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)[10]等。但絕大多數(shù)未公布代謝物的原始測定數(shù)據(jù),只是列出了差異分析的結(jié)果。為了能夠充分利用現(xiàn)有數(shù)據(jù),并避免單一組學(xué)研究的局限性[11],是通過檢索大量的轉(zhuǎn)基因代謝物文章,對多種轉(zhuǎn)基因作物的差異代謝物進(jìn)行綜合分析,挖掘出比較具有代表性的差異代謝物,并通過追溯到其蛋白質(zhì)水平,從兩方面揭示了轉(zhuǎn)基因事件對這6種作物的影響,希望為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性評價提供參考。

1 材料與方法

1.1文獻(xiàn)檢索及篩選

本文的目的是通過代謝組數(shù)據(jù)分析來研究轉(zhuǎn)基因事件對農(nóng)作物的生理影響,僅以“transgene(轉(zhuǎn)基因)”、“metabolite(代謝物)”、“plant(植物)”或者“crop(農(nóng)作物)”為關(guān)鍵詞對PubMed、Science Direct和Elsevier等數(shù)據(jù)庫對已發(fā)表文章進(jìn)行檢索,時間范圍為2004～2016年。

根據(jù)關(guān)鍵詞檢索的文獻(xiàn)涉及到多個物種,并且轉(zhuǎn)基因體系和數(shù)據(jù)格式也不完全相同。選取其中具有完整的差異代謝物列表,或者是轉(zhuǎn)基因與親本代謝物中間數(shù)據(jù)的文獻(xiàn)作為后續(xù)分析使用。

1.2數(shù)據(jù)收集及處理

文獻(xiàn)檢索及篩選完成后,提取其中的代謝物數(shù)據(jù),由于數(shù)據(jù)來源于多項(xiàng)研究,需要統(tǒng)一代謝物名稱,并忽略了構(gòu)型信息。數(shù)據(jù)共包括差異代謝物、樣本代謝物的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差兩種類型。前者可以直接使用,后者因?yàn)橹挥兄虚g數(shù)據(jù),無法直接獲得差異代謝物,需要編寫SAS腳本計(jì)算代謝物的差異顯著性。首先對轉(zhuǎn)基因樣本和親本的代謝物進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)-F檢驗(yàn)(公式1),如果兩樣本的方差相等,按照公式2進(jìn)行t檢驗(yàn),反之,按照公式3進(jìn)行t檢驗(yàn),得到差異代謝物。

式(1)

式(2)

式(3)

式中S1和S2分別為轉(zhuǎn)基因品系和親本的代謝物標(biāo)準(zhǔn)差;x1和x2分別為轉(zhuǎn)基因品系和親本的代謝物測定平均值;n1和n2分別為轉(zhuǎn)基因品系和親本的樣本數(shù)。

在符合分析要求的文獻(xiàn)中,一部分?jǐn)?shù)據(jù)包含了多個轉(zhuǎn)基因品系與親本之間的比較,將其按照轉(zhuǎn)基因品系拆分為多個數(shù)據(jù)集,最后排除差異代謝物少于3個的樣本數(shù)據(jù),按照平行數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3差異代謝物分析

將得到的差異代謝物數(shù)據(jù)集按照所有品種、玉米和水稻三類分別進(jìn)行合并,并進(jìn)行二分類標(biāo)記:如果在數(shù)據(jù)集A中包含代謝物a,則標(biāo)記為1,反之標(biāo)記為0(表1)。得到數(shù)據(jù)集后,使用SAS9.2的ttest程序進(jìn)行單樣本單邊t檢驗(yàn)。因?yàn)榫C合數(shù)據(jù)集涉及多個物種,所以降低了顯著性檢驗(yàn)的條件,假設(shè)h0=0.5,按照p>0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異代謝物作為較具有代表性的差異代謝物,即在所有數(shù)據(jù)集中平均出現(xiàn)次數(shù)不顯著小于0.5次的差異代謝物。而玉米和水稻物種則假設(shè)h0=1,以p>0.01為標(biāo)準(zhǔn)提取具有代表性的差異代謝物。

表1 差異代謝物的部分合并結(jié)果Table 1 The partial merged result of differential metabolites

首先,使用MBROLE 2.0[12]網(wǎng)站對所有物種篩選得到的代表性差異代謝物進(jìn)行KEGG通路富集分析,得到其參與的主要代謝過程。然后又通過STITCH 5.0[13]網(wǎng)站分別對所有物種、玉米和水稻的代表性差異代謝物進(jìn)行代謝物和蛋白質(zhì)的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)及蛋白質(zhì)的代謝通路富集分析,從代謝物和蛋白質(zhì)兩個方面揭示整個轉(zhuǎn)基因事件對農(nóng)產(chǎn)品影響的同時,檢測物種偏好性是否會對結(jié)果產(chǎn)生影響。其中第二層節(jié)點(diǎn)設(shè)置為最多不超過10個,其余參數(shù)均為默認(rèn)值。

2 結(jié)果與分析

2.1文獻(xiàn)檢索及篩選結(jié)果

根據(jù)文獻(xiàn)檢索策略,從多個數(shù)據(jù)庫中共得到56篇相關(guān)文獻(xiàn),篩選其中具有完整的差異代謝物列表,或者是轉(zhuǎn)基因與親本代謝物中間數(shù)據(jù)的文獻(xiàn),最后得到符合條件的文獻(xiàn)共20篇,包括玉米、水稻、大豆、馬鈴薯、番茄、小麥和油菜7個物種,且各物種的樣本數(shù)均不相同,其中玉米和水稻數(shù)據(jù)較多(表2)。

2.2數(shù)據(jù)收集及處理結(jié)果

從符合篩選條件的文獻(xiàn)中提取不同轉(zhuǎn)基因品系的代謝數(shù)據(jù),根據(jù)公式對少數(shù)的中間數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)計(jì)算差異代謝物,統(tǒng)一數(shù)據(jù)格式。排除差異代謝物少于3個的數(shù)據(jù)集,最后分別減少了一個小麥和大豆樣本,即從玉米[6,14-17]、水稻[18-22]、大豆[23-25]、馬鈴薯[26]、番茄[27,28]和油菜[29]的6個物種的18篇文章中提取出了26個數(shù)據(jù)集(表2)。

表2 文獻(xiàn)檢索及數(shù)據(jù)收集匯總Table 2 Summary of the literature screening and data collection

注:每個物種的文章數(shù)目表示為a+b,其中a為最終被納入分析的文章數(shù)目,b為差異代謝物少于3 個的文章數(shù)目;數(shù)據(jù)集是指每個物種用于后續(xù)分析的樣本數(shù)據(jù)數(shù)目,“-”代表無可納入數(shù)據(jù)集。

2.3多物種的差異代謝物分析結(jié)果

合并所有數(shù)據(jù),得到一個綜合數(shù)據(jù)集,整理并去冗余后得到129個差異代謝物,使用SAS9.2軟件對其進(jìn)行單樣本單邊t檢驗(yàn)分析。因?yàn)閿?shù)據(jù)來自于多項(xiàng)不同的研究,存在一定程度的異質(zhì)性,按照材料與方法中的統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)篩選代表性差異代謝物,最后得到了8種代表性差異代謝物(表3)。結(jié)果說明代謝物的表達(dá)具有不穩(wěn)定性,這可能是由于外界因素的變化或是異質(zhì)性條件所造成的。同時這也從側(cè)面證明,得到的8種差異代謝物確實(shí)具有一定的代表性。

表3 差異代謝物分析結(jié)果Table 3 The ttest analysis result of differences in metabolites

注:“√”指該差異代謝物在該數(shù)據(jù)集中是代表性的差異代謝物。

通過MBROLE 2.0網(wǎng)站對6個物種篩選得到的8個差異代謝物進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析,以錯誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate,FDR)為標(biāo)準(zhǔn)(FDR<0.05)篩選富集顯著的代謝通路,其中只有氰基氨基酸代謝通路符合條件(FDR=0.0056)。研究結(jié)果指出,該代謝過程與油菜種皮的顏色形成過程相關(guān)[30],并且從代謝通路圖可以看出,參與氰基氨基酸代謝的代謝物僅為酪氨酸和丙氨酸兩種,且均處于代謝通路的邊緣部分,起到銜接其他代謝過程的作用(圖1)。所以,并不能確定參與此代謝通路的差異代謝物的具體功能。其余6個差異代謝物并未涉及任何的代謝通路,可能是目前還尚未明確其具體功能,有待進(jìn)一步的發(fā)現(xiàn)。

圖1 差異代謝物的氰酸代謝通路富集圖Fig.1 The figures of cyanoamino acid metabolism pathway for differential metabolites注:圖中圓圈指代謝物,方框指參與該過程的酶。圓圈即代謝物在通路中所處的位置。

圖2 6種作物的代表性差異代謝物和相關(guān)蛋白的網(wǎng)絡(luò)連接圖Fig.2 The network of the potentially representative differential metabolites and protein for six crops注:節(jié)點(diǎn):橢圓代表代謝物,圓代表蛋白質(zhì);邊:代表代謝物和蛋白質(zhì)的關(guān)系,線的粗細(xì)代表關(guān)聯(lián)性的強(qiáng)弱。

由以上結(jié)果可知,該代謝物的功能分析存在一定的局限性,而多數(shù)代謝物是由大分子物質(zhì)消化水解得到的,所以又通過STITCH 5.0網(wǎng)站,追溯到代謝物上游的蛋白質(zhì)層面,進(jìn)行代謝物和蛋白質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析,并對相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析。網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的結(jié)果表明,8種代謝物相互之間存在緊密聯(lián)系,其中丙氨酸和檸檬酸作為整個網(wǎng)絡(luò)的重要連接物質(zhì),都是重要的能量代謝中間物質(zhì)。與代謝物相關(guān)的多個蛋白質(zhì)間也存在較顯著的關(guān)聯(lián)性,可以更加明確的揭示相關(guān)代謝過程(圖2)。同樣以FDR<0.05為閾值進(jìn)行蛋白質(zhì)的代謝通路篩選,6個物種的分析結(jié)果顯示,代謝物關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)主要參與TCA循環(huán)、乙醛酸和二羧酸代謝和丙酮酸代謝等能量代謝過程[31-33](表4)。

表4 6種作物的代表性差異代謝物相關(guān)蛋白質(zhì)的通路富集分析Table 4 The pathway enrichment result of proteins associated with the potentially representative differential metabolites in STITCH website for six crops

注:FDR指錯誤發(fā)現(xiàn)率,值越小,說明蛋白質(zhì)在該代謝通路的富集結(jié)果越顯著。篩選標(biāo)準(zhǔn)為FDR<0.05。

上述結(jié)果與多項(xiàng)已發(fā)表的單一物種轉(zhuǎn)基因非預(yù)期效應(yīng)的研究結(jié)果[18,34]一致,Liu等人通過比較轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因水稻的基因表達(dá)情況,從轉(zhuǎn)錄水平解釋了轉(zhuǎn)基因事件對水稻的影響,發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要參與能量代謝過程,并提出這可能是由于外源轉(zhuǎn)入的冗余標(biāo)記基因引起了作物本身的應(yīng)激反應(yīng)所導(dǎo)致的,而應(yīng)激反應(yīng)需要更多的能量,從而表現(xiàn)在能量代謝方面的變化。Montero等人通過對轉(zhuǎn)基因樣本、相同處理的非轉(zhuǎn)基因樣本和野生型樣本基因表達(dá)情況的兩兩比較,得出轉(zhuǎn)基因過程以及體外培養(yǎng)條件都會對植株產(chǎn)生一定的損傷和刺激,從而引發(fā)一系列的應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致與能量代謝相關(guān)的基因發(fā)生了差異表達(dá)。

2.4玉米和水稻的差異代謝物分析結(jié)果

為避免物種偏好性對數(shù)據(jù)分析結(jié)果產(chǎn)生影響,對玉米和水稻的差異代謝物分別進(jìn)行了分析。玉米和水稻的數(shù)據(jù)集合并且處理后分別得到了42個和46個差異代謝物,同樣對其進(jìn)行單樣本單邊t檢驗(yàn),兩物種分別得到11個和3個代表性差異代謝物(表3)。同樣通過STITCH 5.0網(wǎng)站分析,得到兩物種的通路富集分析結(jié)果(表5)。通過結(jié)果比較可知,玉米和水稻與6個物種的分析結(jié)果有類似之處,都參與能量代謝過程,比如嘌呤代謝、乙醛酸和二羧酸代謝以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝等,但是各自涉及的代謝通路并不完全相同,且相關(guān)基因數(shù)目也有所差異,說明所有物種的差異代謝物分析結(jié)果并不完全依賴于樣本數(shù)較多的玉米和水稻物種,不存在明顯的物種偏好性,該結(jié)果可以反映轉(zhuǎn)基因事件對這6種作物的普遍影響情況。

表5 玉米和水稻的代表性差異代謝物相關(guān)蛋白質(zhì)的通路富集分析Table 5 The pathway enrichment result of proteins associated with the potentially representative differential metabolites in STITCH website for maize and rice

注:FDR指錯誤發(fā)現(xiàn)率,值越小,說明蛋白質(zhì)在該代謝通路的富集結(jié)果越顯著。篩選標(biāo)準(zhǔn)為FDR<0.05。

3 結(jié)論

本文通過收集18篇已發(fā)表文章的轉(zhuǎn)基因差異代謝物數(shù)據(jù),對6種作物的差異代謝物進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),得到了8種代表性差異代謝物,并在沒有明顯物種偏好性的前提下,結(jié)合關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析,從代謝物和蛋白質(zhì)兩方面對其進(jìn)行了綜合分析,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因樣本與野生型樣本在能量代謝上存在顯著性差異。多項(xiàng)研究結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因事件會通過激發(fā)植物的應(yīng)激反應(yīng)來引起作物能量代謝過程的變化,本文的結(jié)果恰好是對此現(xiàn)象的進(jìn)一步論證,并且揭示了轉(zhuǎn)基因事件對多種作物的能量代謝可能存在普遍影響的現(xiàn)象。除此之外,沒有發(fā)現(xiàn)其他顯著且普遍存在的轉(zhuǎn)基因非預(yù)期效應(yīng),希望該結(jié)果可以為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品在代謝物層面的安全性分析提供一定的參考價值。

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Cooperativeanalysisofthedifferencesinmetabolomeforgeneticallymodifiedcrops

XUWen-jie1,DUZhi-xin2,ZHANGLiang-liang3,FUWei1,*

(1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing 100029,China;2.Guangxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Testing Center,Nanning 530021,China;3.Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Testing Center,Haikou 570311,China)

Transgenic technology is widely used,particularly for obtaining the high-quality crops. But in the commercialization of genetically modified crops,the safety of the products has been concerned. The continuous development of the omics has provided a new method for the safety evaluation of genetically modified crops. In view of the instantaneity and availability of metabolite data,the comparison results of metabolites for 6 crops between wild and transgenic samples were analyzed comprehensively,and the data were collected from many articles which had been reported in the metabolomics analysis of genetically modified crops. Eight differential metabolites were obtained with the representativeness based on the significant test,and the result of metabolic pathway enrichment showed that the proteins associated with them were involved in energy metabolism,which was same as the published result of the transgenic unintended effect study for single-species. The study revealed that transgenic event affected the energy metabolism of these six crops from both metabolites and proteins aspects,and the phenomenon may be prevalent in a variety of genetically modified crops. It is hoped to provide a reference for the safety evaluation of genetically modified crops.

genetically modified crops;safety evaluation;metabolomics;differential metabolite;energy metabolism

2017-03-10

許文杰(1990-)，女，博士研究生，研究方向：植物檢疫與入侵生物學(xué)，E-mail:xuwenjieee@163.com。

*通訊作者:付偉(1983-)，女，博士，副研究員，研究方向：轉(zhuǎn)基因生物安全，E-mail:fuwei0212@163.com。

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品抽制樣和精準(zhǔn)檢測技術(shù)(2018ZX08012-001);廣西區(qū)內(nèi)主要農(nóng)作物及其制品轉(zhuǎn)基因精準(zhǔn)檢測技術(shù)研究與應(yīng)用(2016GXCIQ003)。

TS201.6

:A

:1002-0306(2017)17-0135-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.026