產(chǎn)果膠酶黑曲霉的UV誘變及基于葡萄皮渣的固態(tài)發(fā)酵

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(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院,陜西楊凌 712100;2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心,陜西楊凌 712100)

產(chǎn)果膠酶黑曲霉的UV誘變及基于葡萄皮渣的固態(tài)發(fā)酵

黃丹梅1,宋育陽(yáng)1,2,劉延琳1,2,秦義1,2,*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院,陜西楊凌 712100;2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心,陜西楊凌 712100)

對(duì)產(chǎn)果膠酶的黑曲霉進(jìn)行紫外誘變,使用透明圈法并結(jié)合液態(tài)發(fā)酵法進(jìn)行篩選,獲得果膠酶產(chǎn)量提高的黑曲霉菌株,并利用葡萄皮渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶。結(jié)果表明,H40741、H40493、H40982、H41133、H41134、H41034、H40493和H22148等8株黑曲霉中,H40741產(chǎn)果膠酶最高,對(duì)其進(jìn)行0～360 s紫外誘變,獲得高產(chǎn)果膠酶突變菌株H40741-20,其在果膠液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中可獲得酶活力為462.84 U/mL的果膠酶,是出發(fā)菌株的3倍。通過(guò)優(yōu)化固體發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄皮渣、麥麩和水的含量,獲得較佳培養(yǎng)基配方為:葡萄皮渣50 g,麩皮50 g,水100 mL,硫酸銨2 g,硫酸鎂0.07 g,硫酸鉀0.1 g。H40741-20利用此固態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵,可獲得酶活力為421.06 U/mL果膠酶,是出發(fā)菌株H40741的2.7倍。

果膠酶,黑曲霉,紫外誘變,固體發(fā)酵,葡萄皮渣

果膠在不同程度上影響天然產(chǎn)物的釋放,在適宜條件下,添加果膠酶有利于天然產(chǎn)物的提取[1-2]。果膠酶是指能夠分解果膠物質(zhì)的一種復(fù)合酶的總稱(chēng)[3-6]。果膠酶包含聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)、果膠裂解酶(pentin lyases,PL)、果膠甲酯酶(pectin esterases,PE)和原果膠酶等。

微生物生產(chǎn)果膠酶的來(lái)源極其廣泛,包括真菌、細(xì)菌、放線菌,如:假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、歐文式菌(Erwinia)、酵母屬(Saccharomyces)、曲霉屬(Aspergillus)等[7-8]。黑曲霉是國(guó)際公認(rèn)的安全菌株(generally regardedas safe,GRAS),也是美國(guó)(FDA)認(rèn)可使用安全產(chǎn)酶微生物之一,其代謝產(chǎn)物可直接用于食品、飲料、造紙等行業(yè)[9-10]。誘變育種是通過(guò)誘變劑作用于微生物菌種,并尋找正向突變菌株的一種誘變方法,此方法具有簡(jiǎn)單、快速、有效等特點(diǎn)[11-16]。近年國(guó)內(nèi)外學(xué)者,如陳勇強(qiáng)[17]、余秋生[18]、N Jafari[19]、G Izmirlioglu[20]等人在黑曲霉的篩選、原生質(zhì)體選育與誘變育種相結(jié)合方面取得了顯著的成果。這些方法是通過(guò)誘變因子修改目的微生物的基因組,從而產(chǎn)生突變型菌株。

利用微生物固態(tài)發(fā)酵(Solid State Fermentation,SSF)生產(chǎn)果膠酶具有原料成本低、來(lái)源廣,工藝操作簡(jiǎn)單,發(fā)酵過(guò)程中不需要嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作,基質(zhì)含水量低,反應(yīng)容器體積小,無(wú)環(huán)境污染[21]等優(yōu)點(diǎn)。我國(guó)葡萄酒廠眾多,且分布廣泛。每年葡萄酒的生產(chǎn)位居世界前列,同時(shí)也產(chǎn)生大量的葡萄皮渣,約占葡萄加工量的25%～30%[22-24]。葡萄皮渣中含有大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),如酚類(lèi)物質(zhì)(poly-phenolic compounds,PP)含量可達(dá) 285～550 mg/kg[25],花青素的含量為6.96 mg/g[26],葡萄籽油約占葡萄籽重量的9%～17%[27],同時(shí)葡萄皮渣中也含有一定量的果膠[28]。在過(guò)去葡萄酒的釀造過(guò)程中,葡萄皮渣被當(dāng)做廢棄物扔掉,不僅浪費(fèi)資源,也污染環(huán)境。對(duì)葡萄皮渣進(jìn)行廢物重新綜合利用,不僅實(shí)現(xiàn)了資源利用的最大化,也降低了對(duì)環(huán)境的污染。與固態(tài)發(fā)酵相比,采用液態(tài)發(fā)酵法進(jìn)行篩選具有發(fā)酵時(shí)間短、易操作等優(yōu)點(diǎn)。因此,本研究采用透明圈法與液態(tài)發(fā)酵法相結(jié)合進(jìn)行篩選高產(chǎn)果膠酶的黑曲霉菌株,并對(duì)篩選所得菌株進(jìn)行葡萄皮渣固體發(fā)酵,為利用葡萄皮渣固體發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶奠定基礎(chǔ)。

表1 標(biāo)準(zhǔn)樣配制Table 1 Preparation of standard sample

1 材料和方法

1.1材料與儀器

黑曲霉H40741、H40493、H40982、H41133、H41134、H41034、H41278和H2214 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

葡萄皮渣 赤霞珠葡萄經(jīng)壓榨并進(jìn)行自然曬干后獲得,其果膠含量約為1%～1.6%;麥麩 集貿(mào)市場(chǎng);實(shí)驗(yàn)果膠 上海源葉生物科技有限公司;半乳糖醛酸 北京索萊寶科技有限公司;3,5-二硝基水楊酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;硫酸鎂、硝酸鈉、硫酸鐵、硫酸銨、硫酸鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、氯化鈉、丙三醇等均為分析純級(jí)。

UV1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) Agilent Technologies;PB-10酸度計(jì) 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;QYC-2112型恒溫?fù)u床 上海福馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;MJPS-250霉菌培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑的配制 DNS試劑:3.25 g 3,5-二硝基水楊酸,162.5 mL 2 mol/L氫氧化鈉,22.5 g丙三醇,定容至500 mL[29]。

pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖液[29]:取71.62 g十二水合磷酸氫二鈉,21.01 g檸檬酸,分別定容至1000 mL,按10.3∶9.7混合。

盧戈氏碘液:將2 g碘化鉀溶解于少量蒸餾水中,再將1 g碘溶解在碘化鉀溶液中,待碘溶解完全后定容至300 mL,避光保存。

1.2.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基(PDA) 200 g馬鈴薯(去皮,切塊,加水,煮沸30 min,破碎,用紗布過(guò)濾,濾液加糖,定容至100 mL),20 g瓊脂,20 g葡萄糖,1000 mL蒸餾水,pH自然。

果膠培養(yǎng)基(%)0.1 g磷酸氫二鉀,0.5 g硫酸鎂,0.3 g硝酸鈉,0.001 g硫酸鐵,2.0 g瓊脂,0.2 g實(shí)驗(yàn)果膠,pH5.5[30-31]。

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(%)0.1 g磷酸氫二鉀,0.5 g硫酸鎂,0.3 g硝酸鈉,0.001 g硫酸鐵,0.2 g實(shí)驗(yàn)果膠,pH5.5。

1.2.3 高產(chǎn)果膠酶菌株的篩選 依據(jù)Qu E J等[16]的研究透明圈直徑(Dp)與菌落直徑(Dc)比值較大產(chǎn)果膠酶的酶活相應(yīng)較高。為了獲得產(chǎn)果膠酶酶活最高的黑曲霉菌株,本實(shí)驗(yàn)對(duì)初篩中Dp/Dc比值較大的幾株黑曲霉菌株進(jìn)行復(fù)篩。

初篩:將黑曲霉菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基上,28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)5～7 d。將培養(yǎng)好的黑曲霉斜面菌株存放于-4 ℃冰箱中。取活化好的斜面菌株1支,加入無(wú)菌水沖洗孢子,制成均勻的孢子濃度為106個(gè)/mL的孢子懸液,將菌懸液分別稀釋10-6、10-5、10-4、10-3倍。用移液槍吸取100 μL稀釋后的菌液接種在無(wú)菌果膠平板培養(yǎng)基上(每個(gè)梯度做3個(gè)平行),涂抹均勻,倒置于30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)3～4 d[15]。將平板上的單菌落保藏于甘油凍存管中,再向平板中加入5 mL盧戈氏碘液,靜止2 min后將碘液倒出,再加入5 mL生理鹽水放置10 min后倒出,24 h后可見(jiàn)明顯透明圈,選取透明圈直徑(Dp)與菌落直徑(Dc)比值較大的菌[16]進(jìn)行復(fù)篩。

復(fù)篩:準(zhǔn)確稱(chēng)取半乳糖醛酸1.0 g,用pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖液定容至1000 mL,得到1 mg/mL的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。取9支25 mL的具塞管并編號(hào),并按表1加入各種試劑,混合均勻,沸水浴5 min,流水冷卻,加蒸餾水定容至25 mL,用紫外分光光度計(jì)在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以吸光度值(A)為橫坐標(biāo),半乳糖醛酸濃度(B mg/mL)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為B=1.6269×A-0.0118(R2=0.9982)。

在300 mL錐形瓶中加100 mL液體果膠培養(yǎng)基,用接種環(huán)沾取菌種接于液體培養(yǎng)基中,28 ℃,260 r/min條件下培養(yǎng)2～3 d,將培養(yǎng)液于3600 r/min下離心8 min,取上清液作為待測(cè)粗酶液。

1.2.4 果膠酶酶活測(cè)定 采用DNS法測(cè)果膠酶酶活力,在15 mL具塞管中加入0.8 mL 1.0%的果膠溶液,50 ℃恒溫水浴3 min,加入0.2 mL適當(dāng)稀釋的粗酶液,精確反應(yīng)10 min后加入3 mL DNS,混勻后沸水浴10 min,流水冷卻,蒸餾水定容至15 mL,在紫外分光光度計(jì)540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值,以滅活酶液為空白對(duì)照[32-33]。酶活力計(jì)算:

X(U/mL)=[(A1-A2)×Dr×3]/(K×t)

式(1)

式(1)中A1為樣品吸光度值,A2為空白對(duì)照吸光度值;K為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,Dr是稀釋倍數(shù);t為反應(yīng)時(shí)間(h)。

1.2.5 紫外誘變 紫外照射劑量:取28 ℃培養(yǎng)5 d的上述步驟1.2.4所得到的酶活力最高的菌株,用0.9%的生理鹽水沖洗孢子,將孢子懸浮液置于無(wú)菌的錐形瓶中,放入幾粒玻璃珠振蕩使孢子分散,用四層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾,然后用生理鹽水將孢子懸浮液濃度調(diào)整到106個(gè)/mL,該步驟在血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)[34]。取7個(gè)直徑9 cm培養(yǎng)皿,分別加入6 mL上述孢子懸浮液。將15 W的紫外燈打開(kāi),預(yù)熱20 min使光波穩(wěn)定。將盛有懸浮液的培養(yǎng)皿置于距紫外燈垂直距離30 cm處,打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋子照射(照射計(jì)時(shí)從開(kāi)蓋起,加蓋停),照射時(shí)間分別為0、60、120、180、240、300、360 s。從每個(gè)照射時(shí)間的培養(yǎng)皿中取出菌懸液,分別稀釋10、100、1000倍。吸取100 μL稀釋后的菌懸液,涂布于果膠平板培養(yǎng)基上,每個(gè)濃度做3個(gè)平行,全程均在紅光燈下進(jìn)行。將培養(yǎng)皿用鋁箔紙包裹以避光,放置于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～4 d,待菌落長(zhǎng)好后計(jì)算不同照射時(shí)間下的致死率并保存,計(jì)算公式為

F(%)=[(A-B)/A]×100

式(2)

式(2)中F為致死率;A為原菌落數(shù);B為誘變后菌落數(shù)。

突變株的篩選:將上述誘變菌株計(jì)數(shù)并保存后采用盧戈氏碘液染色法,分別觀測(cè)透明圈直徑(Dp)與菌圈直徑(Dc)大小,并計(jì)算Dp/Dc比值,找出Dp/Dc比值大的菌株進(jìn)行酶活力測(cè)定。

突變株酶活力的測(cè)定:將篩選得到的突變菌株進(jìn)行活化培養(yǎng),制備粗酶液。然后采用上述步驟1.2.4所述方法測(cè)定突變菌株的果膠酶酶活力。

1.2.6 形態(tài)觀察 采用插片法[34]將滅菌后的蓋玻片斜插在培養(yǎng)基上,用接種環(huán)將菌種接種在蓋玻片一側(cè),放入培養(yǎng)箱28 ℃條件下培養(yǎng)4～5 d,電子顯微鏡下觀察菌株形態(tài)。待菌株生長(zhǎng)后用無(wú)菌刀片切一小塊長(zhǎng)有菌落的培養(yǎng)基,于電子顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍下照片。將剩下的培養(yǎng)基繼續(xù)放置培養(yǎng)箱中,定期取出進(jìn)行電子顯微鏡觀察與拍照。

1.2.7 突變株和出發(fā)菌株固體發(fā)酵 葡萄皮渣用于固態(tài)發(fā)酵[35]的培養(yǎng)基配方為:葡萄皮渣的添加量分別為0、10、30、50、70、90 g,采用麥麩補(bǔ)足至100 g,每組分別添加100、200 mL水,均添加2 g硫酸銨,0.07 g硫酸鎂,0.1 g硫酸鉀,以進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄皮渣、麥麩與水的配比優(yōu)化。

將篩選得到的出發(fā)菌株和上述步驟1.2.4測(cè)得酶活力最高的突變菌株進(jìn)行固體發(fā)酵,發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后接入2 mL孢子懸浮液,28 ℃條件下培養(yǎng)4～5 d。固體發(fā)酵結(jié)束后,將錐形瓶中的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至燒杯中,并在燒杯中加入料液比1∶10 (g∶mL)的含0.01%吐溫-80的蒸餾水,在30 ℃條件下恒溫浸提50 min后用3層紗布進(jìn)行過(guò)濾,將所得液體在4000 r/min下離心15 min,所得上清液即為粗酶液[30],并測(cè)定其果膠酶酶活力,方法同上述步驟1.2.4。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用軟件Origin 8繪制出黑曲霉菌株篩選和發(fā)酵的果膠酶酶活力圖,用SPSS進(jìn)行差異顯著性分析,p<0.05差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1產(chǎn)果膠酶菌株的篩選

通過(guò)采用果膠培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)H40741、H40493、H40982、H41133、H41134、H41034、H41278和H2214等八株黑曲霉菌株進(jìn)行定性篩選。根據(jù)菌株的生長(zhǎng)情況和水解果膠的能力,采用盧戈氏碘液染色法篩選出Dp/Dc比值較大的菌株。通過(guò)初篩得到H40741、H41134、H41133和H40982四株菌株的Dp/Dc比值分別為2.2、1.4、1.5、1.4,較另外四株黑曲霉的Dp/Dc比值大,如圖1所示。

圖1 八株黑曲霉菌株染色后的透明圈Fig.1 Transparent circle of eight aspergillus niger strains after dyeing

從圖2可以看出,黑曲霉菌株H40741的酶活高于其他菌株,酶活力達(dá)到154.15 U/mL。據(jù)方差分析,復(fù)篩菌株H40741產(chǎn)果膠酶的酶活力較H41133、H411134、H40982三株菌的產(chǎn)果膠酶活力具有顯著差異(p<0.05)。

圖2 復(fù)篩菌株產(chǎn)果膠酶的酶活力Fig.2 Enzyme activity of pectinase produced by re-screening strains

2.2出發(fā)菌株紫外誘變

結(jié)果表明紫外照射時(shí)間對(duì)菌株H40741的致死非常顯著,當(dāng)照射時(shí)間為240 s時(shí),致死率可以達(dá)到91%(圖3)。將紫外誘變0、60、120、180、240、300、360 s后的菌懸液稀釋1000倍,將稀釋后的孢子懸液涂布于果膠平板培養(yǎng)基上,28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)3 d進(jìn)行初篩。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),誘變后的菌落大小差異顯著(p<0.05),甚至個(gè)別菌落難以形成孢子(圖4)。說(shuō)明在紫外誘變過(guò)程中菌株不僅發(fā)生了正突變,同時(shí)也發(fā)生了負(fù)突變[36]。出發(fā)菌株H40741對(duì)紫外線較為敏感且果膠酶的酶活力比H41133、H411134、H40982三株菌都高,是一株適宜于進(jìn)行誘變育種的菌株。

圖3 紫外誘變致死率曲線Fig.3 The curve of UV-mutation lethality

圖4 紫外照射時(shí)間與菌的存活數(shù)Fig.4 UV irradiation time and survival number of strains注:從上到下、從左到右,誘變時(shí)間依次為0、60、120、180、240、300、360 s。

2.3紫外誘變菌株的篩選

結(jié)果顯示各菌株的Dp/Dc比值均有提高(圖5)。據(jù)方差分析,各菌株的Dp/Dc比值都有較顯著的提高(p<0.05),其中H40741-20菌株提高的最為顯著(p<0.05)(圖6)。

圖5 264株誘變菌株Dp/Dc比值Fig.5 The ratio Dp/Dc of 264 mutant strains

圖6 出發(fā)菌株H40741與誘變菌株H40741-20的透明圈Fig.6 Transparent circle of original strain H40741 and mutant strain H40741-20

圖7 七株Dp/Dc比值較大的黑曲霉突變菌株果膠酶酶活力Fig.7 The enzyme activity of seven aspergillus niger mutant strains with higher ratio Dp/Dc注:圖中不同字母代表在Duncan檢驗(yàn)中差異顯著(p<0.05)。

將初篩所獲得的Dp/Dc比值較大的7株黑曲霉突變株H40741-2、H40741-3、H40741-19、H40741-20、H40741-42、H40741-57、H40741-61分別進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵,并檢測(cè)果膠酶的酶活力,最終篩選得到一株高產(chǎn)果膠酶的突變菌株H40741-20,其果膠酶酶活力達(dá)到462.84 U/mL,是出發(fā)菌株H40741的3倍(圖7)。對(duì)酶活力值進(jìn)行顯著性分析發(fā)現(xiàn),除H40741-19與H40741-3,H40741-2與H40741-61無(wú)顯著性差異外(p>0.05),其余菌株間均有顯著性差異(p<0.05)。因此,將果膠酶酶活力提高最多的誘變菌株H40741-20用于葡萄皮渣的固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

2.4突變菌株形態(tài)學(xué)鑒定

突變株H40741-20在顯微鏡下的孢子囊形態(tài),菌叢黑褐色,頂囊為大球形,小梗雙層,分生孢子為球形,呈黑色,表面粗糙(圖8),與唐文俊[37]等人研究的黑曲霉菌體形態(tài)比較相符。通過(guò)與出發(fā)菌株對(duì)比發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)紫外誘導(dǎo)后的孢子囊明顯小于出發(fā)菌株的孢子囊。

圖8 突變株H40741-20在顯微鏡下的孢子囊形態(tài)Fig.8 Sporangial morphology of mutant strain H40741-20 under the microscope注:顯微鏡放大倍數(shù)為100倍。

2.5葡萄皮渣固態(tài)發(fā)酵

麥麩中含有纖維素、低聚糖、β-淀粉酶等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),其中纖維類(lèi)物質(zhì)約占30%,糖類(lèi)物質(zhì)約占70%[38]。因此,麥麩可作為碳源與氮源,且具有一定的疏松度,能夠給黑曲霉的生長(zhǎng)提供充足的氧氣。與麥麩相對(duì)比,葡萄皮渣中果膠物質(zhì)約占1.0%～1.6%[39],而果膠酶屬于誘導(dǎo)酶,葡萄皮渣既可作誘導(dǎo)物又可作碳源。添加葡萄皮渣能有效提高果膠酶的產(chǎn)量,且果膠酶活力最高能提高266.91 U/mL。通過(guò)調(diào)整葡萄皮渣和麥麩的配比,不僅有利于提高果膠酶的產(chǎn)量,還能減少原料的浪費(fèi)。研究發(fā)現(xiàn),隨著葡萄皮渣添加量每增加20 g,果膠酶活力提高150 U/mL左右。當(dāng)葡萄皮渣含量超過(guò)50%時(shí),若繼續(xù)增加其含量,菌絲的生長(zhǎng)會(huì)更加旺盛,但果膠酶酶活力會(huì)隨之降低(圖9)。因此,固體發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄皮渣與麥麩質(zhì)的添加量分別為50、50 g最合適。

圖9 不同質(zhì)量的葡萄皮渣與麥麩發(fā)酵的酶活力Fig.9 Enzyme activity of fermentation of grape skin residue and bran in different quality

3 結(jié)論

本研究采用液態(tài)發(fā)酵與紫外誘變獲得產(chǎn)果膠酶活力最高的菌株H40741-20,將其與出發(fā)菌株H40741分別進(jìn)行葡萄皮渣固態(tài)發(fā)酵。通過(guò)優(yōu)化固體培養(yǎng)基配比,發(fā)現(xiàn)當(dāng)葡萄皮渣50 g、麥麩50 g、水100 mL時(shí),H40741-20的酶活力最高(421.06 U/mL),較H40741提高173.15%。因此,以葡萄皮渣為原料進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶,既能做到資源的合理利用和降低環(huán)境污染,又能實(shí)現(xiàn)葡萄酒廢棄資源利用的最大化。

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UVmutagenesisofAspergillusnigerforincreasingpectinaseproductionanditssolid-statefermentationusinggrapeskinresidue

HUANGDan-mei1,SONGYu-yang1,2,LIUYan-lin1,2,QINYi1,2,*

(1.College of Enology,Northwest A&F University,Yangling 712100,China; 2.Shaanxi Engineering Research Center for Wine and Viticulture,Yangling 712100,China)

For increasing pectinase productiont,UV light was used to produceAspergillusnigermutagenesis,and the grape skin residue was used to produce pectinase byAspergillusniger. The results showed that,in the eightAspergillusnigerstrains H40741,H40493,H40982,H41133,H41134,H41034,H40493 and H22148,the H40741 has the highest pectinase activity. Ultraviolet light on H40741 spores 0～360 s,and we obtained a high yield pectinase mutant strain H40741-20. The pectinase activity was 462.84 U/mL in pectin liquid fermentation medium,which was 3 times of the original strain. By optimizing the contents of grape skin residue,wheat bran and water,we obtained a better medium formula was grape skin residue 50 g,wheat bran 50 g,water 100 mL,ammonium sulfate 2 g,magnesium sulfate 0.07 g,potassium sulfate.The pectinase enzyme activity was 421.06 U/mL,which was 2.7 times higher than that of the original strain H40741 by using this optimized solid medium.

pectinase;Aspergillusniger;UV mutagenesis;solid-state fermentation;grape skin residue

2017-01-20

黃丹梅(1992-),女,在讀碩士研究生,研究方向:釀酒微生物,E-mail:hdmhuang92@163.com。

*通訊作者:秦義(1982-),男,博士,講師,研究方向:釀酒微生物學(xué),E-mail:qinyi@nwsuaf.edu.cn。

國(guó)家自然基金(3050215184);國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(葡萄)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(CRAS-30-jg-3)。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)17-0125-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.024