中華蟾蜍DNA條形碼鑒定△

趙群，張?zhí)?，高波，李燈林，楊艷，李軍德*

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700；2.皖西學(xué)院，安徽 六安 237012；3.安徽華潤(rùn)金蟾藥業(yè)股份有限公司，安徽 淮北 235000)

·專(zhuān)題·

中華蟾蜍DNA條形碼鑒定△

趙群1,2，張?zhí)?，高波3，李燈林3，楊艷3，李軍德1*

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京100700；2.皖西學(xué)院，安徽 六安237012；3.安徽華潤(rùn)金蟾藥業(yè)股份有限公司，安徽 淮北235000)

目的：通過(guò)DNA條形碼研究鑒別中藥材中華蟾蜍BufogargarizansCantor及其混偽品的可行性。方法：從GenBank下載了6種蟾蜍屬Bufo、2種林蛙屬Rana、1種側(cè)褶蛙屬Pelophylax和1種小鯢屬Hynobius的COI線粒體基因DNA序列。用Clustal X1.81和BioEdit軟件分別對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)和編輯。利用MEGA4.0軟件按照Kimura雙參數(shù)法計(jì)算種內(nèi)和種間的遺傳距離。用貝葉斯法和簡(jiǎn)約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)對(duì)中華蟾蜍進(jìn)行鑒定。結(jié)果：構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，中華蟾蜍的所有樣本聚類(lèi)為一個(gè)單系，能很好地與其他混偽品區(qū)分。結(jié)論：COI條形碼DNA序列能夠?qū)χ兴幹腥A蟾蜍進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

中華蟾蜍；細(xì)胞色素C氧化酶I亞基基因；條形碼；鑒定

中華蟾蜍BufogargarizansCantor隸屬于蟾蜍科(Bufonidae)、蟾蜍屬Bufo，由其獲得的蟾皮和蟾酥是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，該種動(dòng)物為上述中藥材的重要基源動(dòng)物[1-3]。研究表明，在中華蟾蜍的皮中含有的水溶性化學(xué)成分具有顯著的抗腫瘤作用，市場(chǎng)上已出現(xiàn)由其有效成分生產(chǎn)的抗腫瘤藥華蟾素注射液[4-5]。目前，入藥的中華蟾蜍主要來(lái)源于野生，但由于野生資源的逐年減少，市場(chǎng)上出現(xiàn)了以其他動(dòng)物代替中華蟾蜍的混偽品[6]。由于混偽品中抗腫瘤活性成分低于中華蟾蜍[5，7]，必須尋找鑒定中華蟾蜍真?zhèn)蔚挠行Х椒ǎ拍鼙ＷC該種中藥的臨床用藥安全和市場(chǎng)的有效監(jiān)管。

目前，關(guān)于脊椎動(dòng)物類(lèi)藥材的鑒定主要依據(jù)外部形態(tài)、骨片橫斷面特征、薄層色譜法和紫外光譜吸收特征對(duì)藥材進(jìn)行鑒別[2，8-9]。此外，核型和線粒體12S rRNA基因可用于中華蟾蜍與部分種類(lèi)的鑒別[10-11]。然而，這些有的分辨率不高，有的復(fù)雜費(fèi)時(shí)不利于推廣，有的則涉及鑒別種類(lèi)較少，沒(méi)有對(duì)鑒別的可靠性和實(shí)用性作進(jìn)一步研究。線粒體細(xì)胞色素C氧化酶I亞基cytochrome oxidase subunit I(COI)基因?yàn)榈鞍踪|(zhì)編碼基因，其密碼子第三位堿基受自然選擇的壓力影響較小，具有較大的變異，同時(shí)其他部位又具有一定的保守性，可以較為容易地設(shè)計(jì)通用引物，在不同物種中擴(kuò)增出來(lái)，便于不同物種之間進(jìn)行比較分析，用于物種的鑒定[12]。因此，COI基因可以作為DNA條形碼的分子標(biāo)記。本研究以COI基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，研究用其鑒別中藥材基源動(dòng)物中華蟾蜍及其混偽品的可行性。

1 材料與方法

1.1材料

用于構(gòu)建中華蟾蜍及其混偽品系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的內(nèi)群和外群的COI基因序列均來(lái)自于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的GenBank。用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)內(nèi)群的序列來(lái)自于6種蟾蜍屬Bufo、2種林蛙屬Rana和1種側(cè)褶蛙屬Pelophylax，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。外群則包括來(lái)自于小鯢屬Hynobius中國(guó)小鯢Hynobiuschinensis的3條COI線粒體基因部分DNA序列(GenBank登錄號(hào)為JN165870、JN165869和JN165868)。

用于待檢真?zhèn)蔚捏钙に幉馁?gòu)于安徽亳州藥材市場(chǎng)，從所購(gòu)蟾皮藥材中隨機(jī)抽取3個(gè)樣本進(jìn)行真?zhèn)舞b定。3個(gè)樣本分別命名為Sample1、Sample2、Sample3。

表1 中華蟾蜍及其混偽品COI序列及GenBank登錄號(hào)

1.2方法

1.2.1序列分析 用軟件ClustalX1.81對(duì)從GenBank下載的中華蟾蜍、混偽品及外群的COI基因部分序列進(jìn)行比對(duì)和排序，用軟件BioEdit7.0.9.0[13]對(duì)比對(duì)后的序列進(jìn)行編輯，用MEGA4.0軟件[14]統(tǒng)計(jì)所有序列的變異位點(diǎn)，利用MEGA4.0軟件按照Kimura雙參數(shù)法計(jì)算種內(nèi)和種間的遺傳距離。

1.2.2系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 基于比對(duì)和編輯過(guò)的所有COI基因部分序列，分別用貝葉斯法(Bayesianinference，BI)和簡(jiǎn)約法(maximumparsimony，MP)對(duì)中華蟾蜍和其混偽品進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建BI和MP兩種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。其中BI樹(shù)用MrBayes3.1.2[15]軟件構(gòu)建，MP樹(shù)用PAUP*4.0beta10軟件構(gòu)建[16]。構(gòu)建BI樹(shù)時(shí)，由于COI基因3個(gè)密碼子區(qū)域的分子進(jìn)化模式不同，因此根據(jù)3個(gè)密碼子所在的位置把整個(gè)序列分為三個(gè)部分。用MrModeltest2.3軟件[17]根據(jù)AIC(AkaikeInformationCriterion)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)分別選擇3個(gè)不同部分?jǐn)?shù)據(jù)的最適進(jìn)化模型。其中，第一個(gè)密碼子位點(diǎn)所在部分的最適模型為(GTR+G)，第二個(gè)密碼子位點(diǎn)所在部分的最適模型是(HKY+I)，第三個(gè)密碼子位點(diǎn)所在部分的最適模型是(GTR+G)。馬爾科夫鏈的蒙特卡洛方法(MarkovChainsMonteCarlo，MCMC)設(shè)置為四條鏈并運(yùn)行2000000代。為了確定其收斂情況，MCMC分別運(yùn)行兩次。每100代抽取一個(gè)樣本，共形成40002個(gè)樣本。經(jīng)過(guò)分析得知，整個(gè)運(yùn)行在100000代后達(dá)到平穩(wěn)，這樣，總共剩余的樣本數(shù)為38002，用剩余樣本重建系統(tǒng)樹(shù)，并估計(jì)其后驗(yàn)概率值。構(gòu)建MP樹(shù)時(shí)，設(shè)置自舉重復(fù)次數(shù)bootstrapnreps為1000次，使用啟發(fā)式搜索分析自舉重復(fù)數(shù)據(jù)集，啟發(fā)式搜索設(shè)置由隨機(jī)逐步添加法產(chǎn)生起始樹(shù)，重復(fù)10次，采用TBR分支交換。

1.2.3待檢樣本的真?zhèn)舞b別 基因組DNA的提?。河脴?biāo)準(zhǔn)苯酚-三氯甲烷抽提和乙醇沉淀方法提取待測(cè)樣本的整個(gè)基因組DNA。提取后的DNA置于-80℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增和DNA序列測(cè)定：用引物對(duì)Chmf4和Chmr4對(duì)待檢樣本的COI基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中，正向引物Chmf4的序列為5′-TYTCWACWAAYCAYAAAGAYATCGG-3′，反向引物Chmr4的序列為5′-ACYTCRGGRTGRCCRAARAATCA-3′[18]。PCR反應(yīng)總體系為25μL，包括DNA模板0.5μL(5～50ng)、上游引物和下游引物各1μL(10pmol)、10×PCRBuffer2.5μL、MgCl2(25mmol·L-1)1.5μL、dNTPs(10mmol·L-1)0.5μL、TaqDNApolymerase(5u·μL-1)0.5μL、ddH2O17.5μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min；接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性1min，46℃退火1min，72℃復(fù)性1min；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物由生工生物工程上海(股份)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序引物分別為COI-C01和COI-C03，其中COI-C01的序列為5′-TYTCWACWAAYCAYAAAGAYATTGG-3′，COI-C03的序列為5′-ACYTCYGGRTGACCAAARAAYCA-3′[18]。

待檢樣本的真?zhèn)畏治觯豪肅lustalX1.81和上述1.2.1序列分析步驟中的所有序列進(jìn)行分析和比對(duì)。用MEGA4.0軟件按照Kimura雙參數(shù)法計(jì)算每個(gè)待檢樣本與其他各個(gè)物種之間的遺傳距離。按上述1.2.2方法，將該步驟中所有物種的序列與待檢樣本的序列構(gòu)建BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和MP系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

通過(guò)以上方法，如果待檢樣本與中華蟾蜍之間的遺傳距離小于與其他各物種之間的遺傳距離，且待檢樣本與中華蟾蜍在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中聚類(lèi)于同一分支上形成單系，則該待檢樣本為正品中華蟾蜍的蟾皮，反之則為偽品。

2 結(jié)果

2.1序列分析

中華蟾蜍、相關(guān)混偽品和外群的COI基因部分同源片段序列經(jīng)過(guò)比對(duì)和編輯后，序列片斷的長(zhǎng)度為556bp，有223個(gè)變異位點(diǎn)，其中包含217個(gè)簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn)(parsimony-informativecharacters)。所有序列的平均G+C含量為46.3%，中華蟾蜍的平均G+C含量為47.8%，因此中華蟾蜍與所有序列的平均G+C含量差異不大。中華蟾蜍種內(nèi)遺傳距離的范圍為0.018～0.031，與其他種類(lèi)的種間遺傳距離為0.112～0.294。種內(nèi)最大遺傳距離為0.031，而種間最小遺傳距離為0.112。因此，中華蟾蜍的種內(nèi)遺傳距離小于與其他混偽品之間的種間遺傳距離。

2.2中華蟾蜍及其混偽品的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

通過(guò)BI法和MP法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，2種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)主干基本一致，見(jiàn)圖1。圖1中各譜系分支的節(jié)點(diǎn)處標(biāo)有BI樹(shù)的后驗(yàn)概率值(posteriorprobability，PP)和MP樹(shù)的自舉支持度(Bootstrap，BS)。在BI和MP系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，中華蟾蜍所有序列的單倍型均聚類(lèi)為1個(gè)分支。盡管該分支在BI樹(shù)中的支持度不高(PP=0.67)，但在MP樹(shù)中，中華蟾蜍的單倍型以極高的支持度形成1個(gè)單系(BS=99)。

注：譜系分支節(jié)點(diǎn)上方為BI樹(shù)的后驗(yàn)概率PP和MP樹(shù)的自舉支持度BS，其中，在斜線的左邊為PP值，斜線的右邊為BS值，斜線任何一邊為空白，表明PP值小于0.5或BS值小于50。圖1 中華蟾蜍及混偽品的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3待檢樣本的真?zhèn)舞b別結(jié)果

通過(guò)比對(duì)和分析，3個(gè)待檢樣本形成1個(gè)單倍型，該單倍型用“Sample”表示。待檢測(cè)樣本與中華蟾蜍之間的遺傳距離在0.002與0.033之間，小于與其他物種之間的遺傳距離。同時(shí)，待檢物種的單倍型Sample與中華蟾蜍的單倍型聚為1個(gè)分支形成單系，見(jiàn)圖2，尤其是與中華蟾蜍的其中1個(gè)單倍型Hap9以極高的支持度聚類(lèi)在一起(PP=0.95；BS=93)。

注：譜系分支節(jié)點(diǎn)上方為BI樹(shù)的后驗(yàn)概率PP和MP樹(shù)的自舉支持度BS，其中，在斜線的左邊為PP值，斜線的右邊為BS值，斜線任何一邊為空白，表明PP值小于0.5或BS值小于50。圖2 待檢樣本、中華蟾蜍和混偽品的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

3.1COI基因序列分析

中華蟾蜍及其混偽品COI基因序列分析表明，中華蟾蜍種內(nèi)遺傳距離最大為0.031，而其與所有混偽品的種間遺傳距離最小為0.112。因此，中華蟾蜍種內(nèi)遺傳距離小于與其他混偽品之間的種間遺傳距離，可以用COI基因序列為分子標(biāo)記，用來(lái)鑒別中華蟾蜍及其混偽品。由于在COI序列中存在中華蟾蜍不同于其他混偽品的特異性堿基位點(diǎn)，所以可以通過(guò)特異性堿基位點(diǎn)設(shè)計(jì)中華蟾蜍的特異性鑒別引物，用于中華蟾蜍的快速鑒定。目前，已有很多中藥材可以通過(guò)特異性PCR進(jìn)行快速鑒定[19-23]。

3.2系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

通過(guò)貝葉斯法和簡(jiǎn)約法構(gòu)建中華蟾蜍及其混偽品的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出，中華蟾蜍的單倍型在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中聚類(lèi)為一個(gè)單系，因此，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，可以把中華蟾蜍與混偽品區(qū)分開(kāi)，以達(dá)到鑒別中華蟾蜍正品的目的。

3.3待檢樣本的真?zhèn)舞b別

由于3個(gè)待檢樣本的單倍型與中華蟾蜍之間的遺傳距離最小，且與中華蟾蜍在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中聚類(lèi)于同一分支上形成單系，因此3個(gè)待檢樣本為正品中華蟾蜍的蟾皮。

4 結(jié)論

本研究分析結(jié)果表明，線粒體COI基因序列能夠通過(guò)比較待測(cè)樣本、中華蟾蜍和其混偽品之間的遺傳距離的遠(yuǎn)近，以及通過(guò)構(gòu)建待測(cè)樣本與這些物種之間的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)判斷該樣本是否為中華蟾蜍的蟾皮，從而達(dá)到對(duì)待測(cè)樣本的真?zhèn)舞b定。因此，COI基因序列是較為理想的鑒定中華蟾蜍及其混偽品的DNA條形碼。

[1] 費(fèi)梁，胡淑琴，葉昌媛，等.中國(guó)動(dòng)物志：兩棲綱(中卷)，無(wú)尾目[M].北京：科學(xué)出版社，2009.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[3] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典：下冊(cè)[M].上海：上海人民出版社，1977.

[4] 曾洋，張愛(ài)軍，文筱.干蟾皮的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2011，1(15)：29-31.

[5] 王宏潔，楊立新，高波，等.高效液相色譜法測(cè)定不同種蟾皮中蟾蜍噻嚀的含量[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2012，19(11)：44-45.

[6] 喬淑芬.中華大蟾蜍生活習(xí)性及人工養(yǎng)殖場(chǎng)地選擇[J].通化師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，29(4)：39-41.

[7] 張振海，王晉艷，陳彥，等.不同品種及產(chǎn)地蟾皮中抗腫瘤活性成分含量比較[J].中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(11)：2698-2701.

[8] 朱華，林冬杰，莫小玲，等.廣西蛤蚧、泰國(guó)蛤蚧及其混偽品海蛤蚧(紅瘰疣螈)的生藥鑒定[J].廣西中醫(yī)藥，1997，20(6)：34-37.

[9] 王純玉.蛤蚧及其偽品的鑒別[J].傳統(tǒng)醫(yī)藥，2003，12(11)：64.

[10]袁毅君，楊金義，袁惠群，等.甘肅中華蟾蜍和中國(guó)林蛙核型的初步研究[J].天水師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，27(5)：26-28.

[11]熊榮川，田應(yīng)洲，李松，等.威寧中華蟾蜍的分子鑒定[J].貴州農(nóng)業(yè)，2014，42(12)：32-36.

[12]王鑫，黃兵.DNA條形編碼技術(shù)在動(dòng)物分類(lèi)中的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2006，4：67-72.

[13]HallTA.BIOEDIT：auser-friendlybiologicalsequencealignmenteditorandanalysisprogramforWindows95/98/NT[J].NucleicAcidsSymposiumSeries，1999，41(41)：95-98.

[14]TamuraK，DudleyJ，NeiM，etal.MEGA4：MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis(MEGA)softwareversion4.0[J].MolecularBiologyandEvolution，2007，24(8)：1596-1599.

[15]RonquistF，HuelsenbeckJP.MrBayes3：Bayesianphylogeneticinferenceundermixedmodels[J].Bioinformatics，2003，19(12)：1572-1574.

[16]SwoffordDL.PAUP*：PhylogeneticAnalysisUsingParsimony(*andOtherMethods)[Z].SinauerAssociates，Sunderland，MA，2002.

[17]Nylander，JAA.PAUP*：MRMODELTESTversion2.1.Computerprogramdistributedbytheauthor[Z].UppsalaUniversity，Uppsala，2004.

[18]CheJ,ChenHM,YangJX,etal.UniversityCOIprimersforDNAbarcodingamphibians[J].MolecularEcology,2012,12(2):247-258.

[19]唐雙焱，傅文，陳永久，等.中藥材鹿鞭的分子鑒定研究[J].中國(guó)中藥雜志，2002，27(8)：573-575.

[20]馮成強(qiáng)，唐曉晶，黃璐琦，等.金錢(qián)白花蛇及其混淆品高特異性PCR的鑒別[J].中國(guó)中藥雜志，2006，31(13)：1050-1053.

[21]Sun X Q，Wei Y L，Qin M J，et al.Authentication of an Endangered Herb Changium smyrnioides from Different Producing Areas Based on rDNA ITS Sequences and Allele-Specific PCR[J].Archives of Pharmacal Research，2012，35(4)：701-708.

[22]陳康，蔣超，袁媛，等.快速PCR方法在蛇類(lèi)藥材真?zhèn)舞b別中的應(yīng)用[J].中國(guó)中藥雜志，2014，39(19)：3673-3677.

[23]Han B X，Yuan Y，Huang L Q，et al.Specific PCR identification betweenPeucedanumpraeruptorumandAngelicadecursivaand identification between them and adulterant using DNA barcode[J].Pharmacognosy Magazine，in press.

Identification ofBufogargarizansand Its Adulterants by DNA Barcoding Technique

ZHAO Qun1,2，ZHANG Tian1，GAO Bo3，LI DengLin3，YANG Yan3，LI JunDe1*

(1.National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs，Beijing，100700，P.R.China；2.West Anhui University，Lu’an 237012，P.R.China；3.Anhui China Resources Jinchan Pharmaceutical Co.，Ltd.，Huaibei 235000，P.R.China)

Objective：To study the feasibility of using DNA barcoding technique to identifyBufogargarizansand its adulterants based on COI gene.Methods：Sequences of partial mitochondrial DNA from cytochrome oxidase subunit I(COI)gene of 6 species fromBufo，2 species fromRana，1 species fromPelophylax，and 1 species fromHynobiuswere downloaded from the GenBank data library.The COI sequences were aligned and edited using ClustalX 1.81 and BioEdit 7.0.9.0 software，respectively.The interspecific and intraspecific genetic distances of different sequences were calculated by Kimura double parameter method using software MEGA 4.0.Based on all the aligned and edited COI sequences，the phylogenetic analyses were conducted using Bayesian inference(BI)and maximum parsimony(MP)to identifyB.gargarizansand adulterant.Results：COI sequence haplotypes of different samples ofB.gargarizanswere gathered together，formed its own monophyly，and distinguished from its adulterants by BI and MP trees.Conclusion：The COI sequence is ideal DNA barcode to identifyB.gargarizansand its adulterants correctly.

Bufogargarizans；COI；DNA barcode；identification

中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目(2060302)；蟾蜍規(guī)范化養(yǎng)殖技術(shù)研究(3-YFB2014005)；安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2016SD61)

] 李軍德，研究員，研究方向：藥用動(dòng)物資源與動(dòng)物藥材鑒定，E-mail：jundeli99@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.1.002

2016-09-02)

*[