魚鰾糖胺聚糖的提取及其吸濕保濕性能評價

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(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心,水產(chǎn)品深加工廣東省高等學校重點實驗室,廣東湛江 524088;2.中山市淡水產(chǎn)品技術(shù)服務(wù)協(xié)同創(chuàng)新中心,廣東中山 528436; 3.中山火炬職業(yè)技術(shù)學院,廣東中山 528436)

魚鰾糖胺聚糖的提取及其吸濕保濕性能評價

屈義1,周斯儀1,馮陶1,鐘賽意1,2,*,諶素華1,蘇偉明1,吳小禾2,3

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心,水產(chǎn)品深加工廣東省高等學校重點實驗室,廣東湛江 524088;2.中山市淡水產(chǎn)品技術(shù)服務(wù)協(xié)同創(chuàng)新中心,廣東中山 528436; 3.中山火炬職業(yè)技術(shù)學院,廣東中山 528436)

以魚鰾為原料,通過枯草中性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶酶解提取糖胺聚糖,在單因素實驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)曲面法對提取條件進行優(yōu)化,通過理化分析及UV、IR分析其性質(zhì)和化學結(jié)構(gòu)特征,并評價其吸濕保濕性。結(jié)果表明:酶法提取魚鰾糖胺聚糖的最佳工藝條件:料液比1∶20 g∶mL、酶解時間4 h,酶解溫度50 ℃,酶用量7%,酶解pH8,最優(yōu)條件下魚鰾糖胺聚糖粗品得率為1.19%,糖胺聚糖含量為19.09%;紅外吸收光譜檢測表明,其具有典型的糖胺聚糖特征吸收峰,且含有α糖苷鍵的吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu);魚鰾糖胺聚糖具有良好的吸濕保濕性,總體吸濕保濕性優(yōu)于殼聚糖、海藻酸鈉等常規(guī)保濕劑。綜上表明,魚鰾糖胺聚糖作為一種天然的保濕劑具有一定的應(yīng)用前景。

魚鰾,糖胺聚糖,提取工藝,理化及結(jié)構(gòu)特征,吸濕性,保濕性

魚鰾(Swim bladder),又稱魚肚或魚泡,為膠質(zhì)囊狀物,是魚游泳時的水中深淺位置調(diào)節(jié)器。在我國漢代就有魚鰾作為藥材的記載;唐朝時期,魚鰾已作為貢品之一,與燕窩、魚翅齊名,素有“海洋人參”之譽。中醫(yī)認為魚鰾具有滋陰養(yǎng)血、補腎固精、嫩膚養(yǎng)顏、抗癌等功效。我國作為世界水產(chǎn)第一大國,擁有豐富的魚鰾資源,但目前缺乏對魚鰾中功效因子的研究與開發(fā)。

前人研究表明魚鰾的主要營養(yǎng)成分為高級膠原蛋白、糖胺聚糖和多種維生素及鈣、鋅、鐵、硒等多種微量元素,其中糖胺聚糖含量豐富,約占魚鰾干重的8.9%[1]。目前,國內(nèi)外對魚鰾的研究主要集中在營養(yǎng)成分分析、蛋白提取及活性研究等方面,如段振華[2]分析評價了不同來源的魚鰾的營養(yǎng)成分。辛昭[3]證明大黃魚魚鰾多糖對CCl4致肝損傷有良好的預(yù)防作用。索華義[4]發(fā)現(xiàn)黃魚魚鰾多糖可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT-116細胞的凋亡;然而關(guān)于魚鰾糖胺聚糖的分離提取及其結(jié)構(gòu)性質(zhì)的研究未見任何報道。作為海洋生物中含量豐富的生物活性物質(zhì),已經(jīng)發(fā)現(xiàn)糖胺聚糖在抗癌、抗腫瘤、抗病毒、抗血栓等方面表現(xiàn)較強的活性,展現(xiàn)出良好的應(yīng)用開發(fā)前景,有望成為新型的海洋藥物和功能性保健食品的原料來源[5]。同時,糖胺聚糖分子中含有大量羧基和羥基等親水性官能團,使其具備一些優(yōu)良的理化性質(zhì),如強吸水性、乳化性和成膜性等[6]。有些多糖,如殼聚糖、透明質(zhì)酸等已經(jīng)廣泛應(yīng)用于保健品、食品、化妝品等行業(yè)[7]。本實驗以魚鰾為原料,采用酶法提取糖胺聚糖,對其提取工藝進行優(yōu)化,并初步分析魚鰾糖胺聚糖的基本理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征,同時首次對其吸濕保濕性能進行評價,旨在為魚鰾功效因子的研究與開發(fā),以及魚鰾糖胺聚糖作為天然保濕因子應(yīng)用于功能食品和化妝品中提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

鳘魚魚鰾 市售干品;枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(酶活力150 U/mg)、胰蛋白酶(酶活力250 U/mg) 均購自上海源葉生物;D-葡萄糖醛酸、牛血清白蛋白 均購自中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司;肝素鈉、Folin-酚試劑盒 均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司;阿利新蘭 8GX(進口分裝) 購自上海藍季科技發(fā)展有限公司;鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、氯仿、正丁醇、三氯乙酸、無水乙醇、丙酮、咔唑、濃硫酸、苯酚、葡萄糖、四硼酸鈉、明膠、氯化鋇、無水乙酸鈉、硫酸鉀等試劑 均為國產(chǎn)分析純試劑。

UV-2550紫外可見分光光度計 日本島津公司;Bruker Tensor-27傅里葉紅外光譜儀 德國 Bruker公司;FD8508真空冷凍干燥機 韓國ilshin公司;EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本ELELA;5810R高速臺式冷凍離心機 Eppendorf;V-5000可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;PHS-3C精密pH計 上海雷磁儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1 魚鰾基本成分分析 粗蛋白質(zhì)含量的測定參照GB 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》,采用凱氏定氮法;粗脂肪含量的測定參照GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測定》,采用索氏抽提法;水分含量的測定參照GB 5009.3-2010《食品中水分的測定》,采用105 ℃烘干恒質(zhì)量法;灰分含量的測定參照GB 5009.4-2010《食品中灰分的測定》,采用爐550 ℃灼燒法;多糖含量的測定參照GB/T9695.31-2008《肉制品總糖含量的測定》,采用苯酚-硫酸法;總糖胺聚糖含量測定,采用阿利新藍法[8]。

1.2.2 糖胺聚糖提取工藝優(yōu)化

1.2.2.1 原料預(yù)處理 將魚鰾置于50 ℃烘箱中干燥72 h,用高速旋轉(zhuǎn)粉碎機粉碎魚鰾成粉末狀(粒度為200目),放在干燥器中備用。

1.2.2.2 糖胺聚糖提取工藝流程 魚鰾粉→雙酶酶解(酶由枯草桿菌中性酶和胰蛋白酶按照1∶1酶活比混合組成)→沸水浴滅酶(100 ℃,10 min)→離心取上清液(6000 r/min,10 min)→醇沉(60%醇量(V/V),4 ℃,24 h)→離心收集沉淀(3000 r/min,10 min)→無水乙醇和丙酮交替洗滌2次→冷凍干燥→魚鰾糖胺聚糖F0。

1.2.2.3 單因素實驗 料液比對魚鰾糖胺聚糖粗品得率和含量的影響：取50 g魚鰾粉,分別按照1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 (g/mL)的料液比加蒸餾水,加入質(zhì)量分數(shù)為1%的混合酶,調(diào)節(jié)溶液pH為8,在50 ℃條件下酶解4 h,其它操作同1.2.2.2,計算魚鰾糖胺聚糖粗品得率和含量的乘積Y值(×10-4)。

酶解時間對魚鰾糖胺聚糖粗品得率和含量的影響：取50 g魚鰾粉,加入1 L蒸餾水,加入質(zhì)量分數(shù)為1%的混合酶,調(diào)節(jié)溶液pH為8,在50 ℃條件下分別酶解1、2、3、4、5、6 h,其它操作同1.2.2.2,計算魚鰾糖胺聚糖粗品得率和含量的乘積Y值(×10-4)。

酶用量對魚鰾糖胺聚糖粗品得率和含量的影響：取50 g魚鰾粉,加入1 L蒸餾水,分別加入質(zhì)量分數(shù)為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的混合酶,調(diào)節(jié)溶液pH為8,在50 ℃條件下酶解4 h,其它操作同1.2.2.2,計算魚鰾糖胺聚糖粗品得率和含量的乘積Y值(×10-4)。

酶解溫度對魚鰾糖胺聚糖粗品得率和含量的影響：取50 g魚鰾粉,加入1 L蒸餾水,分別加入質(zhì)量分數(shù)為6%的混合酶,調(diào)節(jié)溶液pH為8,分別在30、40、50、60、70 ℃條件下酶解4 h,其它操作同1.2.2.2,計算魚鰾糖胺聚糖粗品得率和含量的乘積Y值(×10-4)。

酶解pH對魚鰾糖胺聚糖粗品得率和含量的影響：取50 g魚鰾粉,加入1 L蒸餾水,分別加入質(zhì)量分數(shù)為6%的混合酶,調(diào)節(jié)溶液pH為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,在50 ℃條件下酶解4 h,其它操作同1.2.2.2,計算魚鰾糖胺聚糖粗品得率和含量的乘積Y值(×10-4)。

1.2.2.4 Box-Behnken實驗設(shè)計 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理,考察酶用量(A)、酶解pH(B)、酶解溫度(C)3個因素,以糖胺聚糖粗品得率(%)和糖胺聚糖含量(%)的乘積Y(×10-4)為響應(yīng)值指標,采用Design Expert 8.05 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析。Box-Behnken 實驗設(shè)計水平見表1。

表1 Box-Behnken實驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.2.5 糖胺聚糖含量測定 采用阿利新藍法測定糖胺聚糖含量。準確稱取0.10 g肝素鈉標準品,用蒸餾水定容至100 mL,配制成1 mg/mL的肝素鈉標準溶液。向15% H3PO4與2% H2SO4的混合溶液中加入0.110 g阿利新藍,充分溶解后定容至100 mL。

分別吸取0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL肝素鈉標準溶液于試管中,補水至0.1 mL,加入1.5 mL阿利新藍染色液進行染色,室溫靜置10 min,在波長490 nm處比色測定吸光度,得到標準曲線回歸方程為:Y=0.002X-0.0011,R2=0.9999;Y為吸光度,X為肝素鈉含量(mg/mL)。

表2 魚鰾主要成分組成Table 2 Main components of swim bladder

式(1)

式中:C:糖胺聚糖濃度(mg/mL);V:糖胺聚糖體積(mL);N:稀釋倍數(shù);M:稱取糖胺聚糖質(zhì)量(g)。

式(2)

式中:M:糖胺聚糖質(zhì)量(g);M0:魚鰾粉質(zhì)量(g)。

1.2.3 Sevag法脫蛋白 將糖胺聚糖粗品配成1%的溶液,離心(3000 r/min,10 min)去沉淀,用氯仿∶正丁醇=4∶1混合物,按糖胺聚糖溶液∶Sevag試劑=5∶1的比例劇烈振搖30 min,離心(3600 r/min,10 min)脫蛋白,重復(fù)多次直至蛋白質(zhì)層去除完全[9]。將糖胺聚糖溶液流水透析48 h,濃縮、冷凍干燥,得到初步純化的糖胺聚糖F1。

1.2.4 魚鰾糖胺聚糖的化學組成分析 多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法;蛋白質(zhì)含量的測定采用Folin-酚法[10];糖胺聚糖含量的測定采用阿利新藍法;己糖醛酸含量的測定采用硫酸咔唑法;硫酸基含量的測定采用BaCl2-gel比濁法[11]。

1.2.5 魚鰾糖胺聚糖的紫外光譜掃描 分別稱取脫蛋白前后的糖胺聚糖5 mg,用蒸餾水配成1 mg/mL的溶液,在200～800 nm范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描。

1.2.6 魚鰾糖胺聚糖的紅外光譜掃描 將干燥后的樣品與溴化鉀壓制成薄片,在4000～500 cm-1范圍內(nèi)掃描。

1.2.7 魚鰾糖胺聚糖的吸濕保濕特性研究

1.2.7.1 吸濕性的測定 魚鰾糖胺聚糖的吸濕性測定[12]在恒溫恒濕條件下進行,將碳酸鉀飽和溶液和硫酸銨飽和溶液分別置于干燥器內(nèi),控制環(huán)境溫度為20 ℃,制成相對濕度(RH)分別為43%和81%的環(huán)境。將魚鰾糖胺聚糖F1、海藻酸鈉、殼聚糖及數(shù)個規(guī)格相同的稱量瓶在50 ℃條件下干燥至質(zhì)量恒定。精確稱取0.1 g樣品置于稱量瓶中,以丙三醇、殼聚糖、海藻酸鈉為對照,將稱量瓶敞口放置在相對濕度分別為43%和81%的干燥器中,密封干燥器。放置3、6、12、24、36、48、60、72 h后,稱量其質(zhì)量變化,按式(3)計算吸濕率:

式(3)

式中:M0為吸濕前各樣品的質(zhì)量(g);Mt為吸濕不同時間后各樣品的質(zhì)量(g)。

1.2.7.2 保濕性的測定 魚鰾糖胺聚糖的吸濕性測定在恒溫的干燥環(huán)境下進行?？刂骗h(huán)境溫度為20 ℃,在干燥器底部加入200 g變色硅膠。將魚鰾糖胺聚糖F1、對照品及數(shù)個規(guī)格為20 mL的小燒杯置于干燥箱中,50 ℃干燥至質(zhì)量恒定。準確稱取魚鰾糖胺聚糖F1、丙三醇、海藻酸鈉、殼聚糖各0.1 g,分別加水10 mL配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液。配制完成的溶液均敞口置于恒溫密閉硅膠干燥器中。放置4、12、24、36、48、60、72、84、96 h后,稱量其質(zhì)量變化,按式(4)計算保濕率:

式(4)

式中:M0為吸濕前各樣品的質(zhì)量(g);Mt為吸濕不同時間后各樣品的質(zhì)量(g)。

1.3數(shù)據(jù)處理

Microsoft Excel 2007軟件作圖;Design Expert 8.05統(tǒng)計軟件擬合實驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1魚鰾基本成分分析

魚鰾的基本成分分析結(jié)果見表2，糖胺聚糖含量達1.77%±0.07%。

2.2單因素實驗

2.2.1 料液比對魚鰾糖胺聚糖粗品得率和含量的影響 由圖1可知,隨著提取溶劑用量的增加,Y值也逐漸增大,在料液比為1∶20時Y值達到最大;繼續(xù)增大溶劑使用量時,Y值反而略顯下降,且過大的溶劑使用量不利于后續(xù)的分離、濃縮、醇沉等工藝,故選擇1∶20的料液比。

圖1 料液比對魚鰾糖胺聚糖提取的影響Fig.1 Effect of material/liqried rations on the extraction yeild of glycosaminoglycan from swim bladder

2.2.2 酶解時間對魚鰾糖胺聚糖粗品得率和含量的影響 由圖2可以看出,酶解時間在1～4 h范圍內(nèi),Y值隨著酶解時間的延長而呈現(xiàn)逐漸增長的趨勢;4 h時Y值最大,繼續(xù)延長酶解時間,Y值則表現(xiàn)下降趨勢,這可能是由于長時間的提取反應(yīng)導(dǎo)致蛋白酶結(jié)構(gòu)的變化,進而造成酶活性位點被破壞,致使提取效率降低[13]。

圖2 酶解時間對魚鰾糖胺聚糖提取的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on the extraction yeild of glycosaminoglycan from swim bladder

2.2.3 酶用量對魚鰾糖胺聚糖粗品得率和含量的影響 由圖3可知,Y值隨著酶用量的增多而增大,酶用量7%時依然表現(xiàn)出一定的上升趨勢,但是當酶用量從5%提高到6%時,Y值提高7.7%,6%酶用量提高到7%時Y值提高5%,由此可以看出隨著酶用量的增加,Y值的增加幅度反而呈現(xiàn)下降趨勢;同時,考慮到枯草中性蛋白酶和胰蛋白酶的經(jīng)濟成本較高,故選擇6%酶用量。

圖3 酶用量對魚鰾糖胺聚糖提取的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on the extraction yeild of glycosaminoglycan from swim bladder

2.2.4 酶解溫度對魚鰾糖胺聚糖粗品得率和含量的影響 由圖4可知,在50 ℃之前,Y值隨著酶解溫度的升高而逐漸提高;當酶解溫度達到50 ℃時,Y值最大;繼續(xù)提高酶解溫度時,Y值則表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢,這是因為枯草中性蛋白酶和胰蛋白酶的活性在50 ℃時最佳,過低或者過高的提取溫度都會影響二種酶的活性。

圖4 酶解溫度對魚鰾糖胺聚糖提取的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the extraction yeild of glycosaminoglycan from swim bladder

2.2.5 酶解pH對魚鰾糖胺聚糖粗品得率和含量的影響 由圖5可知,酶解pH在8之前,Y值隨著酶解pH的增大而增大,并在酶解pH為8時達到最大值;繼續(xù)提高酶解pH,Y值則表現(xiàn)出明顯的下降趨勢。由此可知,在本酶解過程中,溶液pH為8時提取效果最好,即枯草中性蛋白酶和胰蛋白酶這兩種混合酶的最適酶解pH為8,過酸、過堿都會影響兩種酶的活性。

圖5 酶解pH對魚鰾糖胺聚糖提取的影響Fig.5 Effect of enzymolysis pH on the extraction yeild of glycosaminoglycan from swim bladder

2.3響應(yīng)面實驗

2.3.1 Box-Behnken實驗分析方案及結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,采用響應(yīng)面中的Box-Behnken模型進行二次旋轉(zhuǎn)多元回歸方程設(shè)計,共計15個實驗點,12個分析因子,3個零點?？紤]到料液比和酶解時間這2個單因素對酶法提取糖胺聚糖的影響相對于其它3個單因素來說稍弱,以及實驗數(shù)據(jù)及實際情況,故選擇酶用量、酶解溫度、酶解pH這3個因素為自變量,糖胺聚糖粗品得率和糖胺聚糖含量的乘積Y值(×10-4)為響應(yīng)值進行Box-Behnken 實驗。對實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合,得到Y(jié)值對于各因素回歸方程:

Y=22.66-1.30A+0.36B+0.41C-1.04AB+0.13AC-1.04BC-1.03A2-2.43B2-0.51C2。

表4 糖胺聚糖提取參數(shù)ANOVA 分析結(jié)果Table 4 ANOVA of the constructed regression model of glycosaminoglycan sample

注:**p<0.01為極顯著;* p<0.05為差異顯著。

表3 響應(yīng)面實驗分析方案及實驗結(jié)果Table 3 Response surface design arrangement and experimental results

2.3.2 回歸方程擬合及方差分析 由表4可知,整體模型的p值小于0.01,表明該模擬二次方程極顯著,失擬項p值不顯著,說明該實驗方法是可行的?；貧w方程的擬合度可通過復(fù)相關(guān)系數(shù)R2和校正決定系數(shù)來驗證,本次實驗校正決定系數(shù)為0.9326,表明魚鰾糖胺聚糖提取工藝中約有93%的變異分布在這3個單因素中;復(fù)相關(guān)系數(shù)R2是0.9759,則表明魚鰾糖胺聚糖提取工藝的實際值和預(yù)測值有較好的擬合相關(guān)性。因此,可以利用該回歸方程來分析和預(yù)測魚鰾糖胺聚糖的最佳提取工藝。方程一次項中A為極顯著因素，B、C為不顯著因素,同時根據(jù)F值也可以判斷出這三個因素對魚鰾糖胺聚糖提取效果的影響為A>C>B;AB、BC 交互作用極顯著,AC交互作用不顯著;方程二次項中B2極顯著,A2顯著,C2不顯著,表明這3個單因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系,二次項和交互作用均對響應(yīng)值有較大影響。

2.3.3 響應(yīng)面圖分析 利用 Design-Expert 8.05 軟件得到的響應(yīng)面圖可以用來研究各個自變量的交互作用并確定各個自變量對于最大響應(yīng)值的最優(yōu)水平。由響應(yīng)面回歸分析和回歸方程擬合繪制出的響應(yīng)面分析圖見圖6。

圖6 交互作用對于魚鰾糖胺聚糖提取影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots for the interaction effects on the extraction yeild of glycosaminoglycan from swim bladder

圖6(a)可以看出,酶用量和酶解pH這二個因素的交互作用極顯著。隨著酶用量和酶解pH的變化,Y值也隨之變化,且當酶用量和酶解pH達到一定值時,Y值達到最大值。圖6(b)可以看出,酶解溫度和酶用量的交互作用不顯著。圖6(c)可以看出,酶解溫度和酶解pH的交互作用極顯著。當酶解溫度趨于50 ℃、酶解pH趨于8時,Y值達到最大值。

2.4驗證實驗

綜上分析可以得知回歸方程存在極大值點,即理論最優(yōu)提取條件為酶用量7%,酶解pH7.85,酶解溫度50.12 ℃;在此條件下,Y值為23.14(×10-4)。為了驗證本實驗響應(yīng)面法的可行性,將實際操作修正為酶解溫度50 ℃、酶用量7%、酶解pH8,重復(fù)三次平行實驗,得到糖胺聚糖粗品的得率平均值為1.19%,糖胺聚糖平均含量為19.09%,因此三次平行實驗得到的平均Y值為22.72×10-4;與其它文獻報道的數(shù)據(jù)相比,周小雙[14]從合浦珠母貝中提取糖胺聚糖的粗品得率為0.518%,糖胺聚糖含量為10.9%,Y值為5.23×10-4;董曉靜[15]從波紋巴菲蛤中提取糖胺聚糖的Y值為41.3×10-4;孫曉鵬[16]從四角蛤蜊中提取的糖胺聚糖Y值為4.49×10-4;李瑞[17]從翡翠貽貝中提取糖胺聚糖的Y值為25.5×10-4;許江鷺[18]從泥螺中提取糖胺聚糖的Y值為26.5×10-4,這說明從魚鰾中提取糖胺聚糖的方法還是可行的;同時,經(jīng)過響應(yīng)面回歸方程的擬合出的理論值和實際值相吻合,證明響應(yīng)面法可以有效的優(yōu)化魚鰾糖胺聚糖的提取工藝。

2.5魚鰾糖胺聚糖的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析

2.5.1 魚鰾糖胺聚糖的理化性質(zhì)分析 由表5可知,魚鰾糖胺聚糖的粗品經(jīng)過Sevag法脫蛋白后,糖胺聚糖含量和多糖含量分別增加48.6%、28.3%,蛋白質(zhì)含量降低64.9%,說明Sevag法具有較好的脫蛋白效果。

表5 各組分的成分分析(%)Table 5 The chemical composition of different types of polysaccharides(%)

2.5.2 紫外-可見光光譜 魚鰾糖胺聚糖F0和F1的紫外掃描圖譜如圖7所示。從圖7中可以看出,魚鰾糖胺聚糖粗品F0在260～280 nm范圍內(nèi)有明顯的吸收峰,說明粗品中蛋白質(zhì)含量較多;經(jīng)過初步純化后,魚鰾糖胺聚糖精制品F1在260～280 nm范圍內(nèi)的吸收明顯減弱,未除盡的蛋白質(zhì)可能和糖胺聚糖結(jié)合,以蛋白聚糖的形式存在;對比魚鰾糖胺聚糖脫蛋白前后的紫外掃描圖可以發(fā)現(xiàn)精制品中的蛋白質(zhì)含量較低,這與多糖基本組分測定時粗品中蛋白質(zhì)含量明顯高于精制品的結(jié)果一致,說明Sevag法可以很好地脫除魚鰾糖胺聚糖中的蛋白質(zhì)。

圖7 魚鰾糖胺聚糖組分的紫外吸收光譜圖Fig.7 UV spectra of glycosaminoglycan from swim bladder

2.5.3 紅外光譜分析糖胺聚糖的結(jié)構(gòu) 魚鰾糖胺聚糖粗品和精制品的紅外掃描光譜見圖8,二條紅外光譜的峰型基本相同,說明Sevag法脫蛋白沒有破壞糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)。魚鰾糖胺聚糖粗品及精制品在3315.571 cm-1和3406.223 cm-1處都出現(xiàn)較寬的峰,說明存在糖類的-OH;在2920.171 cm-1處出現(xiàn)中等強度吸收峰是由-CH3的C-H對稱伸縮振動產(chǎn)生的;在2850 cm-1處出現(xiàn)弱的吸收峰是由-CH3的C-H反對稱伸縮振動產(chǎn)生的;1654.892 cm-1和1652.963 cm-1處有吸收,說明存在酰胺基的C=O伸縮振動;在1415.724 cm-1和1413.795 cm-1處的小峰是由糖類的C-H變角振動產(chǎn)生的;在1230.561 cm-1和1226.703 cm-1處出現(xiàn)的弱吸收峰是由磺?；腟=O伸縮振動引起的,以上符合糖胺聚糖的特征。另外,1051.184 cm-1和1045.298 cm-1處出現(xiàn)強的吸收峰是吡喃糖環(huán)中醚鍵的伸縮振動和O-H鍵的變角彎曲引起的;840.948 cm-1處出現(xiàn)吸收峰,890～900 cm-1區(qū)段無明顯吸收,表明魚鰾糖胺聚糖以α型吡喃糖苷為主[19-20]。

圖8 魚鰾糖胺聚糖組分的傅里葉紅外吸收光譜圖Fig.8 FT-IR spectra of glycosaminoglycan from swim bladder

將魚鰾糖胺聚糖和魚皮硫酸皮膚素[21]的紅外光譜圖對比,發(fā)現(xiàn)二者的紅外吸收波段基本相同,且峰的強弱也十分相似,故可以判定魚鰾中含有硫酸皮膚素;肝素紅外吸收特征峰的波段是860 cm-1和940 cm-1[22],魚鰾糖胺聚糖在840.948 cm-1處出現(xiàn)吸收峰,890～900 cm-1區(qū)段無明顯吸收,說明魚鰾糖胺聚糖可能含有肝素;硫酸軟骨素的紅外吸收特征峰[23]的波段是725、852、930 cm-1,魚鰾糖胺聚糖僅在840.948 cm-1處出現(xiàn)吸收峰,說明魚鰾糖胺聚糖可能含有硫酸軟骨素;透明質(zhì)酸標準品[24]則分別在3410、1615、1050、1565、1410、1315、1380 cm-1出現(xiàn)紅外吸收峰,與魚鰾糖胺聚糖的紅外吸收光譜圖對比,發(fā)現(xiàn)魚鰾糖胺聚糖可能含有透明質(zhì)酸;對比魚鰾糖胺聚糖和從牦牛肺中提取的硫酸乙酰肝素[25]的紅外光譜圖發(fā)現(xiàn),魚鰾糖胺聚糖也可能含有硫酸乙酰肝素。

圖9 相對濕度43%(a)和81%(b)條件下糖胺聚糖和常規(guī)保濕劑的吸濕率對比Fig.9 Hygroscopicity of glycosaminoglycan compared with traditional humectant at RHs=43%(a)and 81%(b)

2.6魚鰾糖胺聚糖的吸濕性和保濕性測定

2.6.1 吸濕性測定 如圖9a所示,在低濕度(43%)條件下,魚鰾糖胺聚糖的吸濕率高于殼聚糖和海藻酸鈉,低于丙三醇。6 h前,魚鰾糖胺聚糖、殼聚糖、海藻酸鈉的吸濕率隨著吸濕時間的延長而逐漸增長,6 h后,魚鰾糖胺聚糖、殼聚糖、海藻酸鈉的吸濕基本飽和,此時,魚鰾糖胺聚糖的吸濕率為5.8%,殼聚糖和海藻酸鈉的吸濕率分別為3.9%和1.9%;丙三醇在12 h后達到最大吸濕率24.2%,并持續(xù)保持該吸濕能力。在高濕度(81%)條件下,魚鰾糖胺聚糖、殼聚糖、海藻酸鈉的吸濕率在0～6 h內(nèi)增加較快,其中魚鰾糖胺聚糖的吸濕率高于殼聚糖和海藻酸鈉;6 h后,殼聚糖、海藻酸鈉的吸濕率略微增加并達到最大值,分別為16.8%和17.3%;魚鰾糖胺聚糖和丙三醇的吸濕率繼續(xù)保持增長趨勢,48 h后,魚鰾糖胺聚糖和丙三醇的吸濕率基本飽和,吸濕率分別為39.1%和93.1%。戴宏杰等對擬目烏賊生殖腺堿提多糖的吸濕性進行研究,在RH=81%條件下吸濕32 h后達到最大吸濕率16.3%,低于魚鰾糖胺聚糖的最大吸濕率39.1%。同時,根據(jù)文獻報道[26],透明質(zhì)酸、鯊魚軟骨素這2種化妝品常用生物多糖的在同等條件下的吸濕性也低于本研究所得到的魚鰾糖胺聚糖,表明魚鰾糖胺聚糖具有較強的吸濕性,具有開發(fā)為保濕劑的潛力。

2.6.2 保濕性測定 魚鰾糖胺聚糖、常規(guī)保濕劑(丙三醇、殼聚糖、海藻酸鈉)在硅膠干燥環(huán)境中的保濕性見圖10。由圖10可知,隨著保濕時間的延長,魚鰾糖胺聚糖和常規(guī)保濕劑(丙三醇、殼聚糖、海藻酸鈉)的保濕率均表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢。在96 h時魚鰾糖胺聚糖的保濕率為82%,和丙三醇、殼聚糖、海藻酸鈉的保濕率相當,且在整個保濕過程中,魚鰾糖胺聚糖和丙三醇、殼聚糖、海藻酸鈉的變化曲線十分相似,保濕率也較為接近,說明魚鰾糖胺聚糖作為天然提取物,保濕性能良好,應(yīng)用前景十分可觀。

圖10 糖胺聚糖和常規(guī)保濕劑的保濕率對比Fig.10 Moisture retention ability of glycosaminoglycan from swim bladder compared with traditional humectants

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面法優(yōu)化魚鰾糖胺聚糖提取工藝,最佳工藝條件為料液比1∶20、酶解時間4 h,酶解溫度50 ℃,酶用量7%,酶解pH8,在此條件下糖胺聚糖粗品得率為1.19%,糖胺聚糖含量為19.09%,Y值為22.72×10-4。通過對魚鰾糖胺聚糖的基本結(jié)構(gòu)測定可知:Sevag法可以在不損壞糖胺聚糖結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,達到良好的除蛋白效果;魚鰾糖胺聚糖主要是硫酸皮膚素組成。魚鰾糖胺聚糖在保濕吸濕實驗中表現(xiàn)出良好的效果,能夠在減緩水分散失速率的同時,也具有良好的吸濕能力,其總體吸濕保濕性優(yōu)于殼聚糖、海藻酸鈉等常規(guī)保濕劑,可進一步開發(fā)為天然保濕因子或功能性添加劑應(yīng)用于功能食品和化妝品等領(lǐng)域。

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Extractionofglycosaminoglycansfromswimbladderandevaluationofthecapacitiesofitshygroscopicityandmoistureretention

QUYi1,ZHOUSi-yi1,FENGTao1,ZHONGSai-yi1,2,*,CHENSu-hua1,SUWei-ming1,WUXiao-he2,3

(1.College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety,Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center of Marine Food,Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,Zhanjiang 524088,China; 2.Zhongshan Collaborative Innovation Center of Technical Services for Industry of Freshwater Products,Zhongshan 528436,China; 3.Zhongshan Torch Polytechnic,Zhongshan 528436,China)

The extraction process of glycosaminoglycan from swim bladder via enzymatic hydrolysis by pancreatin and neutral protease ofBacillussubtiliswere optimized by response surface methodology based on single factor experiments,the physic-chemical characters and structure properties were analyzed by UV and IR spectroscopy,and the evaluation of the capacities of hygroscopicity and moisture retention were conducted in this investigation. The results showed that the optimum processing conditions of enzyme hydrolysis was solid-liquid ration of 1∶20 g∶mL,enzymolysis time of 4 h,enzymolysis temperature of 50 ℃,enzyme dosage of 7%,and the enzmolysis pH of 8.0. Under these optimum conditions,the yield and content of glycosaminoglycan were of 1.19%,19.09%. Moreover,the IR spectrum showed that the extracted glycosaminoglycan had typical characteristic absroption peaks of polysaccride,and comprised a pyranose ring structure having anαglycosidic bond. Finally,the extracted glycosaminoglycan had excellent capacities of hygroscopicity and moisture retention,which were superior to those of the conventional humectants,such as chitosan and sodium alginate. These results clearly established the possibility that swim bladder glycosaminoglycan could be effectively employed as a moisturizer.

swim bladder;glycosaminoglycan;extraction process;physic-chemical characters and structure properties;hygroscopicity;moisture retention

2017-02-13

屈義(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：海洋多糖的研究與開發(fā),E-mail:qy7626@126.com。

*通訊作者:鐘賽意(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：食品功能因子開發(fā)及功效評價，E-mail:zsylxc@126.com。

廣東省高等教育“創(chuàng)新強校工程”專項資金(GDOU2016050203)；2017年廣東省海洋和漁業(yè)發(fā)展專項資金生物醫(yī)藥與功能性制品研發(fā)2；中山市淡水產(chǎn)品技術(shù)服務(wù)協(xié)同創(chuàng)新中心項目(2016C1007)。

TS201.1

:A

:1002-0306(2017)16-0118-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.023