針刺對端粒酶敲除小鼠大腦海馬區(qū)、皮質(zhì)區(qū)Trk-B信號調(diào)節(jié)激酶表達(dá)的影響?

林麗莉，莊婉玉，陳慧娥，吳 強(qiáng)，林 棟(福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院， 福州 350122)

【針灸研究】

針刺對端粒酶敲除小鼠大腦海馬區(qū)、皮質(zhì)區(qū)Trk-B信號調(diào)節(jié)激酶表達(dá)的影響?

林麗莉，莊婉玉，陳慧娥，吳 強(qiáng)，林 棟△
(福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院， 福州 350122)

目的：探討臨床常用的不同針刺方法，手針、電針干預(yù)對端粒酶敲除小鼠大腦海馬區(qū)、皮質(zhì)區(qū)Trk-B信號調(diào)節(jié)激酶表達(dá)的影響。方法：端粒酶敲除小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為手針組、電針組、空白對照組各6只。電針組使用一對華佗牌不銹鋼針具(0.3 mm×0.25 mm)對雙側(cè)足三里進(jìn)行針刺干預(yù)，交替頻率，強(qiáng)度0.5～1.2 mA，幅度2/100 HZ，每日30 min，連續(xù)干預(yù)7 d。 手針組使用華佗牌不銹鋼針具(0.3 mm×0.25 mm)對雙側(cè)足三里進(jìn)行針刺干預(yù)，每5 min捻轉(zhuǎn)1次，每次30 min，空白對照組不做任何干預(yù)。采用Western blot 法檢測大腦海馬和皮質(zhì)區(qū)域Trk-B的表達(dá)情況。結(jié)果：手針組小鼠在干預(yù)后自主活動程度較空白組均有所增加，海馬區(qū)電針組與空白組對照組比較Trk-B表達(dá)明顯增高；手針組與空白對照組比較Trk-B表達(dá)明顯增高；但在皮質(zhì)區(qū)電針組與手針組比較Trk-B表達(dá)明顯降低；電針組與空白對照組比較表達(dá)明顯降低。結(jié)論：電針對不同腦區(qū)Trk-B表達(dá)的影響不同，電針可促進(jìn)海馬區(qū)Trk-B的表達(dá)，相同的穴位刺激電針和手針的作用機(jī)制不同，可能與酪氨酸B(Trk-B)信號調(diào)節(jié)激酶表達(dá)有關(guān)。

電針；手針；酪氨酸B(Trk-B)；端粒酶敲除小鼠

近年來，對于端粒和端粒酶的研究表明，端粒酶在大腦神經(jīng)前體細(xì)胞發(fā)育過程中存在著高表達(dá)，且在保護(hù)神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞特性中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。端粒酶基因敲除小鼠正逐步成為目前人類研究衰老機(jī)制的一類重要模型。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，衰老不是一種疾病，是每個人生命中必然發(fā)生且無法避免的正常生理現(xiàn)象?！袄稀笔且粋€必然經(jīng)歷的生命階段，“衰”是伴隨“老”而出現(xiàn)的各種虛損不足的生命狀態(tài)?！袄隙宜ァ笔潜厝唤?jīng)歷的生命狀態(tài)，而“老而不衰”則是中醫(yī)養(yǎng)生的目標(biāo)和追求[1-2]。針灸是中醫(yī)用于防病治病、抗老防衰、延年益壽、養(yǎng)生保健的重要措施?，F(xiàn)代臨床觀察也表明，針刺在延緩腦衰老、改善腦功能、減輕癡呆r癥狀方面的確有明顯的效果[3]。本研究通過探討不同針刺方式對端粒酶敲除小鼠大腦海馬區(qū)、皮質(zhì)區(qū)酪氨酸蛋白激酶受體B(Tyrosine receptor kinase B，TrkB)表達(dá)的影響，探討針刺延緩神經(jīng)系統(tǒng)衰老的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究使用的端粒酶基因敲除小鼠(telomerase-deficient，Terc-/-)由美國Jackson Laboratory引進(jìn)(Stock#004132)，該模型動物是通過采用新霉素片段替換野生型C57BL/6J小鼠3號染色體的端粒酶基因，從而導(dǎo)致該類小鼠的端粒酶表達(dá)缺失(https:∥www.jax.org/strain/023535)。該動物由上海茂生衍生物科技有限公司代理引進(jìn)(貨號MS13-127)，并于福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心SPF級轉(zhuǎn)基因動物室進(jìn)行保種、育種。本研究選用SPF級第4代端粒酶基因敲除(Generation 4 Terc-/-)小鼠，待第4代小鼠3～4周齡時采用PCR法進(jìn)行基因型鑒定。

1.2 動物分組及干預(yù)

根據(jù)基因鑒定結(jié)果選用純合子Terc-/-小鼠共18只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為手針組、電針組及空白對照組各6只。電針組使用一對華佗牌不銹鋼針(0.3 mm×0.25 mm)對雙側(cè)足三里進(jìn)行針刺干預(yù)，交替頻率強(qiáng)度0.5～1.2 mA，頻率2/100 Hz，每日30 min，連續(xù)干預(yù)7 d。手針組使用華佗牌不銹鋼針(0.3 mm×0.25 mm)對雙側(cè)足三里進(jìn)行針刺干預(yù)，每5 min捻轉(zhuǎn)1次，每次30 min。空白對照組不做任何干預(yù)。小鼠穴位定位參照《實驗針灸學(xué)》中“常用實驗動物針灸穴位圖”。在第7天干預(yù)結(jié)束后進(jìn)行取材，在小鼠麻醉后將小鼠斷頭暴露腦組織，取左右皮質(zhì)及海馬組織浸于無菌0.01 mol/L的PBS(預(yù)冷)中沖洗血漬，后將組織置于-80℃冰箱用于Western blot蛋白檢測。

1.3 自主活動實驗

采用小鼠自主活動測試儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所制造)分析受試小鼠的自主活動程度，由微電腦自動記錄小鼠在實驗過程中的活動次數(shù)，測試時間10 min，測試結(jié)束后記錄小鼠的活動次數(shù)，每天于固定時間測試1次，連續(xù)2 d。

1.4 Western blot檢測皮質(zhì)區(qū)海馬區(qū)Trk-B含量

腦組織蛋白提取及測定：將腦組織從-80℃冰箱取出稱重,取100 mg 組織加500 μL 組織裂解液(普利萊基因有限公司提供)勻漿后，以12000 r/min 速度在4 ℃離心15 min，取上清液用于蛋白定量檢測(BCA 蛋白定量檢測試劑盒由普利萊基因有限公司提供);SDS-聚炳烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE): 從上述提取的樣品中取出20 μg總蛋白，用10% SDS-PAGE 在4 ℃、20 mA 條件下進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，在4 ℃、400 mA 條件下將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE 轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上;抗體免疫反應(yīng): 按產(chǎn)品使用說明書使用一抗Trk-B、β-actin (購自美國Thermo Fisher Scientific)及二抗(購自美國Santa Cruz Biotechnology)，一抗按合適比例稀釋后加入硝酸纖維素膜中并覆蓋膜的全部，4 ℃放置12 h以上；PBS清洗后加入二抗平穩(wěn)搖動，室溫2 h；化學(xué)發(fā)光顯影及凝膠圖像分析: 將顯影和定影好的膠片進(jìn)行掃描,目的條帶采用Bio-Rad圖像分析軟件進(jìn)行光密度積分值分析，以β-actin為內(nèi)參，各蛋白與β-actin光密度積分值的比值作為蛋白表達(dá)含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的自主活動實驗結(jié)果

圖1顯示，手針組及電針組的小鼠在干預(yù)后自主活動程度較空白組均有所增加，且手針組與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但手針組與電針之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 各組小鼠自主活動能力比較

2.2 各組小鼠皮質(zhì)區(qū)Trk-B蛋白表達(dá)結(jié)果

圖2顯示，在皮質(zhì)區(qū)手針組與電針組Trk-B表達(dá)存在差異，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；電針組與空白對照組比較，Trk-B表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；手針組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 各組小鼠海馬區(qū)Trk-B蛋白表達(dá)結(jié)果

圖3顯示，在海馬區(qū)手針組與空白對照組比較，Trk-B表達(dá)增加，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；電針組與空白對照組比較，Trk-B表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；手針組與電針組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 各組小鼠海馬區(qū)Trk-B蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討論

3.1 端粒酶基因敲除小鼠神經(jīng)系統(tǒng)衰老特點

隨著端粒和端粒酶與衰老的相關(guān)研究不斷深入，衰老的端粒相關(guān)學(xué)說逐漸成為研究熱點。近年來，Terc-/-小鼠在衰老研究領(lǐng)域的應(yīng)用也逐漸增多。Terc-/-小鼠是通過采用新霉素片段替換野生型C57BL/6J小鼠3號染色體的端粒酶基因組分，從而導(dǎo)致該類小鼠的端粒酶表達(dá)缺失，其后代均表現(xiàn)出以約3～5 kb/代速率進(jìn)行性端?？s短和末端融合的增加，當(dāng)端粒低于臨界長度會導(dǎo)致小鼠端粒功能紊亂[4-5]，進(jìn)而表現(xiàn)出全身性多系統(tǒng)自然衰老征象，它們的皮膚、大腦、內(nèi)臟和其他器官均發(fā)生老化，出現(xiàn)嗅覺衰退、不育、腸部和脾臟受損等疾病。 Terc-/-小鼠目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)、生殖醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域的醫(yī)學(xué)研究，近年來陸續(xù)將Terc-/-小鼠應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的相關(guān)研究[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)[8-12]，Terc-/-小鼠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的衰老主要表現(xiàn)為腦部縮小、大腦早衰，海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF, brain derived neurotrophic factor)表達(dá)低于正常，且易引起阿爾茨海默癥、帕金森病等腦部衰老性疾病。筆者所在團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)[13]，Terc-/-小鼠的行為學(xué)特點與正常小鼠比較，出現(xiàn)了增齡性的快速衰老現(xiàn)象。本研究結(jié)果表明，電針及手針均能改善端粒酶基因敲除小鼠的自主活動能力，但電針與手針比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，Terc-/-小鼠的衰老特點與年齡密切相關(guān)，在外在體征、學(xué)習(xí)記憶能力及自主活動等行為學(xué)方面有增齡性的快速衰老現(xiàn)象。

3.2 電針與不同腦區(qū)Trk-B的表達(dá)

Trk-B即酪氨酸激酶B(Tyrosine kinase B，Trk-B)是由酪氨酸激酶原癌基因編碼的一種神經(jīng)營養(yǎng)素家族(Neurotrophins，NTFs)高親和力受體。Trk-B作為BDNF高親和力的功能性受體，通過與BDNF結(jié)合而啟動細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，激活細(xì)胞內(nèi)絲裂原激活蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activitedporteinkinase/extraccllularsigna-lrelatedkinase，MAPK/ERK)、磷脂酶Cr(phospholipase-Cgamma，PLCr)和磷酷酞肌醇3激酶(phosphatidylinosito-l3-kinase，PI3k)等下游信號通路，發(fā)揮廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用，在神經(jīng)凋亡和分子調(diào)控、神經(jīng)損傷和再生、神經(jīng)元的可塑性及神經(jīng)退行性疾病治療方面發(fā)揮了重要作用。國內(nèi)外大量研究已證實，BDNF和Trk-B相互結(jié)合對阿爾茨海默癥、帕金森病及其他神經(jīng)退行性疾病所致的神經(jīng)損傷具有明確的神經(jīng)修復(fù)和再生的治療作用，二者在神經(jīng)疾病方面的治療有著廣闊的應(yīng)用前景。Trk-B與BDNF是所有神經(jīng)營養(yǎng)因子中惟一一對在時間和空間上協(xié)同表達(dá)的受體配體復(fù)合體，兩者廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤以大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)域含量最高。有研究表明，隨著機(jī)體的不斷衰老，BDNF及其受體Trk-B在中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變中，其mRNA表達(dá)明顯下降[15]，且Trk-B的mRNA表達(dá)降低比BDNF含量降低更普遍，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元Trk-B的mRNA表達(dá)量改變會影響其神經(jīng)元的形態(tài)和功能改變，BDNF生物學(xué)功能的發(fā)揮，必須與其受體Trk-B結(jié)合才能實現(xiàn)，若阻斷其信號傳導(dǎo)通路，則BDNF不能發(fā)揮其生物學(xué)功能[16]。因此，Trk-B表達(dá)量對BDNF生物學(xué)功能的發(fā)揮，神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療至關(guān)重要。

近年來大量臨床實驗研究表明，針刺可調(diào)節(jié)腦循環(huán)，改善局部血流供應(yīng)，調(diào)整神經(jīng)細(xì)胞電生理活動、生化反應(yīng)機(jī)制和基因表達(dá)來保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受細(xì)胞毒的損害，保護(hù)腦組織，減輕腦損傷，增強(qiáng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)部代償，從而改善神經(jīng)功能、延緩腦衰老、改善腦功能、減輕癡呆癥狀等。筆者所在團(tuán)隊前期研究已證實[6]，針刺可通過調(diào)節(jié)BDNF信號傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白起到神經(jīng)保護(hù)，改善神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病所致的神經(jīng)損傷。本研究結(jié)果表明，電針對皮質(zhì)區(qū)Trk-B的表達(dá)起抑制作用，而對海馬區(qū)Trk-B的表達(dá)起促進(jìn)作用，提示電針在不同腦區(qū)對Trk-B表達(dá)的影響不同；海馬作為學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位是最易受衰老影響的腦區(qū)[17]，是一系列以進(jìn)行性記憶力和認(rèn)知功能減退等為主癥的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的好發(fā)部位。本研究結(jié)果提示，電針可能是通過促進(jìn)海馬區(qū)Trk-B的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的生物學(xué)效應(yīng)。

3.3 不同針刺方式對Trk-B表達(dá)的影響

傳統(tǒng)針刺即手針是在刺入身體后施以提插、捻轉(zhuǎn)等手法達(dá)到治療效果的，是屬于機(jī)械性刺激。電針相比手針，被認(rèn)為不僅有針刺作用還有電流刺激作用。近年來的研究表明[18]，傳統(tǒng)手針和電針對機(jī)體作用存在差異，在神經(jīng)傳導(dǎo)通路、對神經(jīng)遞質(zhì)及免疫分子的影響等諸方面都存在差異。有研究發(fā)現(xiàn)[19-21]，手針和電針足三里穴對大腦產(chǎn)生不同效應(yīng)，手針引起腦中大范圍的激活，而電針則引起腦中大范圍負(fù)激活，且手針和電針激活的腦區(qū)明顯不同，表明手針和電針可能有著不同的調(diào)節(jié)機(jī)制。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)[26]，電針對痛癥及神經(jīng)損傷的治療有優(yōu)勢，而手針在對免疫分子的調(diào)節(jié)方面存在優(yōu)勢。

本研究結(jié)果表明，手針和電針均可促進(jìn)海馬區(qū)Trk-B的表達(dá)，但在皮質(zhì)區(qū)電針對Trk-B的表達(dá)起抑制作用較之手針更為突出，二者間的作用差異提示，手針與電針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能存在不同的作用機(jī)制。

[1] 宋昊翀, 孫冉冉, 張惠敏, 等. 衰老的中醫(yī)理論研究[J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2015，30(6):1889-1893.

[2] 茅飛波. 中醫(yī)老年保健古代文獻(xiàn)資料整理研究[D]. 廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué), 2007.

[3] 丁曉蓉, 韓景獻(xiàn). 針灸抗腦衰老的研究進(jìn)展[J]. 針刺研究, 2006，31(2):125-128.

[4] 梁愛玲, 黃迪南, 侯敢. mterc～(-/-)小鼠在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 上海實驗動物科學(xué), 2005，25(1):49-53.

[5] SAMPER E, FERNANDEZ P, EGUIA R, et al. Long-term repopulating ability of telomerase-deficient murine hematopoietic stem cells[J]. Blood, 2002,99(8):2767-2775.

[6] LIN D, WU Q, LIN X, et al. Brain-derived Neurotrophic Factor Signaling Pathway: Modulation by Acupuncture in Telomerase Knockout Mice[J]. Altern Ther Health Med, 2015,21(6):36-46.

[7] ROLYAN H, SCHEFFOLD A, HEINRICH A, et al. Telomere shortening reduces Alzheimer's disease amyloid pathology in mice[J]. Brain, 2011,134(Pt 7):2044-2056.

[8] ZHAN Y, SONG C, KARLSSON R, et al. Telomere Length Shortening and Alzheimer Disease-A Mendelian Randomization Study[J]. JAMA Neurol, 2015,72(10):1202-1203.

[9] The study of telomere length in patients with Parkinson's disease[J]. Zh Nevrol Psikhiatr Im S S Korsakova, 2014,114(8):58-61.

[10] MAEDA T, GUAN J Z, KOYANAGI M, et al. Aging-associated alteration of telomere length and subtelomeric status in female patients with Parkinson's disease[J]. J Neurogenet, 2012,26(2):245-251.

[11] PANOSSIAN L A, PORTER V R, VALENZUELA H F, et al. Telomere shortening in T cells correlates with Alzheimer's disease status[J]. Neurobiol Aging, 2003,24(1):77-84.

[12] ZHANG J, KONG Q, ZHANG Z, et al. Telomere dysfunction of lymphocytes in patients with Alzheimer disease[J]. Cogn Behav Neurol, 2003,16(3):170-176.

[13] 莊婉玉, 黃曉真, 卜婉萍, 等. 端粒酶基因敲除小鼠行為學(xué)特征的增齡性變化研究[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2016，26(19):1-5.

[14] 賴紅, 趙海花, 曾亮, 等. 老齡海馬的BDNF及Trk-B mRNA表達(dá)與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系[J]. 解剖科學(xué)進(jìn)展, 2004，10(4):353-356.

[15] 張繼紅, 李愛敏, 滕紹春, 等. K252a對表達(dá)Trk-B的NB細(xì)胞耐藥性的影響[J]. 中國腫瘤臨床, 2005，32(20):9-12.

[16] HONG E J, WEST A E, GREENBERG M E. Transcriptional control of cognitive development[J]. Curr Opin Neurobiol, 2005,15(1):21-28.

[17] 賈君君, 解秸萍, 農(nóng)艷, 等. 傳統(tǒng)手針與電針對比研究現(xiàn)狀[J]. 針灸臨床雜志, 2007(4):62-63.

[18] 譚建豪, 王燕燕, 隆曉菁, 等. 手針和電針足三里穴持續(xù)性效應(yīng)的功能磁共振成像研究[J]. 湖南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版, 2013(7):64-68.

[19] BAI L, TIAN J, ZHONG C, et al. Acupuncture modulates temporal neural responses in wide brain networks: evidence from fMRI study[J]. Mol Pain, 2010,6:73.

[20] BAI L, QIN W, TIAN J, et al. Time-varied characteristics of acupuncture effects in fMRI studies[J]. Hum Brain Mapp, 2009,30(11):3445-3460.

Expression of Trk-b Signal Pathway in Hippocampus and Cortex of Telomerase Knockout Mice by Acupuncture

LIN Li-li, ZHUANG Wan-yu, CHEN Hui-e, WU Qiang, LIN Dong△
(CollegeofAcupuncture,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122,China)

Objective: To investigate the acupuncture and electric acupuncture intervention that the different acupuncture method in the clinical commonly used, have expression influence on B (Trk - B) signal conditioning tyrosine kinases of the hippocampus region and cortex region in telomerase-deficient (Terc-/-) mice brain. Methods: A total of twenty-four (Terc-/-) mice were randomly assigned to acupuncture group, electric acupuncture group and control group. In the electric acupuncture group, used a pair of hua tuo brand eletroacupunture apparatus (0.3 mm×0.25 mm) acupuncture at the stomach 36 (ST-36) position, the eletroacupunture apparatus were connected with alternation of frequency and intensity of 0.5～1.2 mA, 2/100 HZ, for 30 min/d for 7d. in the acupuncture group, used a pair of hua tuo brand stainless steel needles (0.3 mm × 0.25 mm)acupuncture at the stomach 36 (ST-36) position, once every five minutes twisting for 30 min/d for 7d. the control group was used in reared under the same conditions without any intervention. Then for Western blot method on the Trk - B expression in the hippocampus region and cortex region. Results：In the hippocampus region, compared with the control group, the electric acupuncture group and the acupuncture group were increased significantly in the Trk - B expression; However, in the cortex region, compared with the electric acupuncture group, the acupuncture group and the control group were decreased significantly in the Trk - B expression. Conclusion: The electric acupuncture intervention has different influence on the expression of Trk - B in the different brain regions, and it can promote the expression of the hippocampus Trk - B; There are different mechanisms in the acupuncture and the electric acupuncture intervention when we acupuncture the same acupoint, it may be related to the expression of Trk - B signal conditioning tyrosine kinases.

Electric acupuncture; Acupuncture; Trk B; Telomerase deficient(Terc-/-) mice

福建省自然科學(xué)基金資助項目(2017J01540)-基于端粒酶活性相關(guān)的針刺抗衰老效應(yīng)對Terc-/-小鼠海馬神經(jīng)元保護(hù)作用研究；福建省資助省屬高?？蒲袑ｍ桱K類(JK2016018/JAT160221)-自發(fā)熱溫灸針對慢性神經(jīng)痛模型大鼠脊髓疼痛調(diào)控時效特征的研究

R245.9+7

B

1006-3250(2017)08-1129-03

2017-01-11

△通訊作者：林 棟(1977-)，男，副教授，E-mail：bluelike1@sina.com。