谷瘟病菌拮抗放線菌的篩選、鑒定及抑菌活性

牛倩云，劉麗青，孫 碩，儀慧蘭

（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

谷瘟病菌拮抗放線菌的篩選、鑒定及抑菌活性

牛倩云，劉麗青，孫 碩，儀慧蘭

（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

采用平板稀釋法從谷子根際土壤中分離到放線菌93株，以谷瘟病菌為指示菌，利用平板對峙法篩選拮抗菌株，得到1株對谷瘟病菌有良好拮抗效果的菌株A26，抑菌率達63.9%；結(jié)合形態(tài)學特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析，將該菌株鑒定為黃三素鏈霉菌（Streptomyces flavotricini）。初步研究證實，A26無菌發(fā)酵液對谷瘟病菌有較強的抑制作用，隨發(fā)酵液用量加大抑菌率提高，當無菌發(fā)酵液體積分數(shù)為50%時，對谷瘟病菌的抑制率可達87.4%。該拮抗菌的分離為谷瘟病的生物防治及其防治機制的研究提供了基礎。

谷瘟??；谷子；放線菌；拮抗作用

谷子是我國重要的糧食作物之一，具有抗旱、耐貧瘠、水分利用率高、營養(yǎng)豐富等特點，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要地位。山西省是谷子的主產(chǎn)區(qū)，播種面積在全國位居第2，然而，谷子病害的不斷發(fā)生嚴重影響了谷子的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。目前，最常見且危害嚴重的谷子病害主要有：白發(fā)病、黑穗病、銹病、谷瘟病和紋枯病[2]。其中，谷瘟病的病原菌為粟梨孢菌（Pyricularia setariae Nishik），該病菌不僅可侵染葉片，引起谷子苗葉枯死，還可侵染葉鞘、莖節(jié)、穗部，形成莖節(jié)瘟和穗頸瘟，使谷穗萎縮，從而造成谷子減產(chǎn)[3]。

現(xiàn)階段對谷瘟病的主要防治措施有：選育種植抗病性強的谷子品種；加強田間管理，控制好種植密度，實行作物間的輪作；使用有機磷殺菌劑如克瘟散、三環(huán)唑、春雷霉素等進行藥劑防治。但由于抗病性強的谷子品種單一，而化學藥劑的長期使用會導致病原菌產(chǎn)生抗藥性，并引起農(nóng)田和糧食的農(nóng)藥殘留，嚴重威脅食品安全和生態(tài)環(huán)境[4]。因此，迫切需要尋求新型、有效、無公害的防治措施來控制植物病害。而生物防治被認為是一種高效安全的方法，獲得拮抗菌是生物防治的基礎[5]。目前，國內(nèi)利用生防菌防治谷子真菌性病害的研究主要是針對谷子紋枯病，董立[6]等、王燕[7]分別從谷子根際土壤中篩選到對紋枯病有良好拮抗作用的生防菌，對其進行盆栽試驗和田間防治效果研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，拮抗菌對谷子紋枯病有顯著的防治效果，而對谷瘟病生物防治的研究鮮有報道。

本研究從谷子根際土壤中分離、篩選得到對谷瘟病菌有良好拮抗作用的放線菌，并結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析對其進行鑒定，以期為谷瘟病生防菌劑的研究和開發(fā)提供優(yōu)良的菌種資源。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

土壤樣品：于山西省農(nóng)業(yè)科學院谷子研究所谷子試驗田采集不發(fā)病植株根際土壤，低溫保存帶回實驗室，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

供試病原菌：谷瘟病病原菌——粟梨孢菌，由山西省農(nóng)業(yè)科學院谷子研究所郭二虎研究員惠贈。

主要試劑：PCR試劑購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；溶菌酶、蛋白酶K等試劑購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

主要培養(yǎng)基：培養(yǎng)特征、生理生化特征試驗所用的培養(yǎng)基均采用放線菌培養(yǎng)、分離鑒定常用培養(yǎng)基[8-9]。

1.2 方法

1.2.1 土壤放線菌的分離純化 取土樣10 g，用無菌水稀釋成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6的土壤懸液，吸取不同梯度土壤懸液各200μL于高氏一號固體平板上，涂布均勻，28℃倒置培養(yǎng)5～7 d。根據(jù)平板上菌落的形態(tài)、顏色、大小等特征，挑取不同單菌落進行劃線純化培養(yǎng)，將純化菌株4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗菌的篩選 采用平板對峙法，從分離得到的放線菌中篩選拮抗菌株。將谷瘟病菌和放線菌分別培養(yǎng)5～7 d后，制成直徑8 mm的菌餅。取谷瘟病菌菌餅倒貼于PDA平板中央，在距離中央2.5 cm處對稱接種放線菌菌餅，以不接放線菌的平板作為對照，每個處理重復3次，28℃培養(yǎng)7 d后觀察記錄結(jié)果，并計算抑菌率，選擇抑菌率高的菌株作為拮抗菌株。

抑菌率＝（對照組病原菌菌落半徑－處理組病原菌菌落半徑）/對照組病原菌菌落半徑×100%。

1.2.3 拮抗菌的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學特征 將篩選得到的拮抗菌株（A26）接種于高氏一號培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、酵母膏麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、無機鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨酵母鐵瓊脂培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)5～7 d，觀察記錄菌落形態(tài)、生長狀況、可溶性色素產(chǎn)生情況、基內(nèi)菌絲和氣生菌絲顏色。利用插片法[8]，在光學顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)特征。

1.2.3.2 生理生化特征 葡萄糖利用、蔗糖利用、尿素利用、H2S產(chǎn)生、黑色素產(chǎn)生、明膠液化、淀粉水解、纖維素利用等生理生化試驗均參照文獻[9]的方法進行。

1.2.3.3 16S rDNA序列分析 采用改良的CTAB法提取DNA，選取通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′；1492R：5′-ACGGYTACCTTGTTAC GACTT-3′）對菌株16S rDNA進行擴增。PCR擴增體系為20μL，包括：10×buffer 2μL，dNTP 1.6μL，引物各0.8μL，DNA模板0.4μL，Taq酶0.2μL，雙蒸水14.2μL。擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送北京華大基因科技有限公司測序。將測得的序列在Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫中進行同源比對，并利用MEGA 5.1軟件通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過Bootstrap（重復抽樣1 000次）分析樹的穩(wěn)定性，初步確定拮抗菌可能的屬和種。

1.2.4 拮抗菌無菌發(fā)酵液抑菌活性的測定

1.2.4.1 發(fā)酵不同天數(shù)的無菌發(fā)酵液抑菌活性的測定 將菌株A26菌餅接種于100 mL高氏一號液體培養(yǎng)基中，28℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)3，5，7，9，11 d后，分別取發(fā)酵液于4℃，4 000 r/min離心5 min，收集上清液，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，得無菌發(fā)酵液，4℃保存?zhèn)溆谩o菌發(fā)酵液以體積分數(shù)20%的比例與PDA培養(yǎng)基混勻倒平板，以加等量無菌水的平板為對照。挑取谷瘟病菌菌餅倒貼于平板中央，于28℃培養(yǎng)。待對照平板長滿菌絲時，測量各平板中谷瘟病菌菌落半徑，并計算抑菌率。每個處理重復3次。

1.2.4.2 不同體積分數(shù)無菌發(fā)酵液抑菌活性的測定

將無菌發(fā)酵液分別以體積分數(shù)5%，10%，20%，30%，50%的比例與PDA培養(yǎng)基混勻倒平板，在混合平板中央放置谷瘟病菌菌餅，每個處理重復3次，以相同體積分數(shù)的無菌水處理作為對照，于28℃培養(yǎng)。待對照組菌絲長滿平板時測量各組菌落半徑，并計算抑菌率。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的分離與篩選

從土壤樣品中共分離到放線菌93株。通過平板對峙試驗，最終獲得1株對谷瘟病菌拮抗效果較好的菌株（圖1），抑菌率達63.9%，編號為A26。

2.2 拮抗菌A26的鑒定

菌株A26在高氏一號培養(yǎng)基上生長良好，菌落邊緣整齊，為同心圓環(huán)，菌落中央菌絲粉狀，氣生菌絲呈紫灰色，基內(nèi)菌絲無色，無可溶性色素產(chǎn)生（圖2-A）。在光學顯微鏡下觀察，菌株A26菌絲無橫隔，不斷裂，呈分枝狀，孢子絲長，孢子直鏈排列，表面光滑，呈橢圓形至圓柱形（圖2-B）。根據(jù)這些特征，將菌株A26鑒定為鏈霉菌[9]。

菌株A26在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、酵母膏麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、無機鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨酵母鐵瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，氣生菌絲分別為紫灰色、淺紅色、白色、灰白色；基內(nèi)菌絲除馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基為淺黃色外，其他均為無色；在蛋白胨酵母鐵瓊脂培養(yǎng)基中產(chǎn)生了黑色可溶性色素，其他培養(yǎng)基中不產(chǎn)生色素（表1）。

表1 菌株A26的培養(yǎng)特征

生理生化特征分析結(jié)果顯示（表2），菌株A26能利用葡萄糖、尿素，不能利用蔗糖，能產(chǎn)生黑色素和H2S，能使明膠液化、淀粉水解，不能分解纖維素。

表2 菌株A26的生理生化特征

將A26菌株16S rDNA序列在Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對，結(jié)果顯示，其與黃三素鏈霉菌（S.flavotricini）相似度達到100%；構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株A26與黃三素鏈霉菌（S. flavotricini）聚為一支，表明其與黃三素鏈霉菌親緣關(guān)系較近。因此，結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析結(jié)果，初步確定該株放線菌為黃三素鏈霉菌。

2.3 拮抗菌A26無菌發(fā)酵液的抑菌活性

菌株A26的無菌發(fā)酵液對谷瘟病菌有顯著的抑制作用（圖4），且發(fā)酵時間對其抑菌作用的強弱有一定影響。發(fā)酵7 d的無菌濾液抑制作用最強，抑菌率達52.3%，繼續(xù)發(fā)酵其抑菌活性呈下降趨勢。故后續(xù)的試驗取發(fā)酵7 d的發(fā)酵液進行。

檢測不同體積分數(shù)無菌發(fā)酵液的抑菌活性發(fā)現(xiàn)，無菌發(fā)酵液的體積分數(shù)越大，對谷瘟病菌的抑制效果越明顯，當體積分數(shù)為50%時，抑菌率達87.4%（圖5）。

3 討論

本研究利用平板對峙法，從谷子根際土壤分離的放線菌中篩選出1株對谷瘟病菌有顯著拮抗作用的菌株A26，根據(jù)其形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析，初步確定該株放線菌為黃三素鏈霉菌。放線菌是與人類關(guān)系最為密切的微生物類群之一[10]，種類繁多，分布廣泛，是盛產(chǎn)抗生素的一類菌，是微生物農(nóng)藥的重要來源[11]。其中，鏈霉菌屬是最高等的放線菌，主要分布在土壤中，以產(chǎn)多種抗生素而著稱[12]，是植物病原菌拮抗菌的主要菌屬之一，在植物病害的生物防治方面具有良好的應用前景[13-15]。黃三素鏈霉菌作為鏈霉菌屬的一員，關(guān)于其抑菌作用的報道及在生物防治中的應用逐漸增多。鄭金土等[16]從土壤中分離出1株對楊梅潰瘍病有拮抗作用的菌株，經(jīng)鑒定為黃三素鏈霉菌；KHALIL等[17]從稻田獲得的黃三素鏈霉菌對水稻稻瘟病菌有明顯的拮抗作用；HEMANT等[18]分離到的黃三素鏈霉菌能抑制茄絲核菌，減少番茄根部的腐爛，抑菌率為40.14%；XUE等[19]從棉花根際土中分離出1株黃三素鏈霉菌，對棉花黃萎病菌的抑制率為65.8%，同時田間防治效果顯著，防效達51.04%。本研究篩選的拮抗菌株A26也為黃三素鏈霉菌，對谷瘟病菌的抑制作用明顯，表明菌株A26可作為谷瘟病害生物防治的良好資源。

有研究表明，拮抗菌對植物病害的防治機制主要有2種：分泌代謝拮抗物質(zhì)和競爭空間位置及營養(yǎng)成分[20]。菌株A26的無菌發(fā)酵液對谷瘟病菌有良好的抑菌活性，說明菌株A26可能是通過分泌某種化學物質(zhì)發(fā)揮抑菌作用的。檢測發(fā)酵不同時間發(fā)酵液的抑菌效果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵7 d的無菌發(fā)酵液抑菌作用最強，抑制率達52.3%，繼續(xù)發(fā)酵其抑菌率下降，可能是由于隨著發(fā)酵時間的延長，培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)成分逐漸減少[21]。另外，不同體積分數(shù)無菌發(fā)酵液抑菌活性的研究結(jié)果表明，抑菌效果隨著發(fā)酵液體積分數(shù)的增加而增強，當體積分數(shù)為50%時，抑菌率達87.4%，進一步說明菌株A26對谷瘟病菌的拮抗作用與其所產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)的多少呈正相關(guān)。

現(xiàn)階段，我國對谷瘟病的防治措施主要是選用抗病品種和藥劑防治，對生物防治的研究報道相對較少，本研究首次報道了黃三素鏈霉菌對谷瘟病菌的拮抗作用，且篩選出的菌株A26拮抗作用穩(wěn)定，其無菌發(fā)酵液具有顯著的抑菌效果，為研究谷瘟病的生防菌劑奠定了基礎。

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Screening and Identification of Antagonistic Actinomycetes against P yricularia setariae Nishik and Analysis of Its Antipathogenic Activity

NIUQianyun，LIULiqing，SUNShuo，YIHuilan

（College ofLife Science，ShanxiUniversity，Taiyuan 030006，China）

By using the dilution plate method,93 actinomycetes strains were separated from the rhizosphere offoxtailmillet.One of them named A26 strain showed the strongest antagonistic effect against Pyricularia setariae Nishik.Based on morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA phylogenetic analysis,A26 strain was identified as Streptomyces flavotricini.Furthermore,the cell-free fermentation filtrate of A26 had significant inhibition on growth of Pyricularia setariae Nishik. Inhibitory percentage increased with increasing the dose of fermentation filtrate of A26 and reached 87.4%when the volume of fermentation filtrateat reached 50%.Conclusively,our research provides a useful data for further studying on the the mechanism and biologicalcontroloffoxtailmilletblast.

foxtailmilletblast;foxtailmillet;actinomycete;antagonistic effect

S435.15

：A

：1002-2481（2017）09-1525-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.09.31

2017-04-07

國家自然科學基金面上項目（31371868）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系建設專項（CARS-07-12.5-A10）

牛倩云（1993-），女，山西太原人，在讀碩士，研究方向：植物逆境生物學。儀慧蘭為通信作者。