程遙
摘 要:就植物組織培養(yǎng)而言,污染和褐化現(xiàn)象較為常見,是影響組織培養(yǎng)實驗效果的主要因素。污染主要由真菌和細(xì)菌導(dǎo)致,褐化則主要由外植體中多酚氧化酶激活導(dǎo)致。筆者從2種問題的根本成因入手,結(jié)合自身工作經(jīng)驗,就污染和褐化防治措施發(fā)表幾點看法,以供相關(guān)人員參考。
關(guān)鍵詞:植物組織培養(yǎng);污染;褐化;防治措施
中圖分類號:Q943.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A DOI:10.11974/nyyjs.20170833008
污染和褐化既是組織培養(yǎng)實驗的常見問題,也是組織培養(yǎng)質(zhì)量管理的工作難點。污染和褐化問題之所以難以根除,是由微生物的特性導(dǎo)致的。微生物是污染和褐化問題的根本成因,但由于其具有體積微小、生存能力強(qiáng)、繁殖速度快、容易傳播等特點,防治管理較為困難。本文重點分析了組織培養(yǎng)污染和褐化問題的形成原因,并提出了有針對性的防止措施,具體內(nèi)容如下。
1 污染現(xiàn)象成因及防治措施分析
1.1 污染現(xiàn)象成因分析
1.1.1 細(xì)菌污染分析
細(xì)菌污染主要是由交叉污染或表面消毒未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求導(dǎo)致的,其特征是菌斑表現(xiàn)為黏液狀,且較容易被發(fā)現(xiàn),通常在接種后的24~48h內(nèi)被發(fā)現(xiàn)。從操作實施的角度分析,細(xì)菌污染主要是由操作人員使用工具未經(jīng)過合格消毒及人體呼吸放出的細(xì)菌造成的,少數(shù)情況下,操作人員的手與培養(yǎng)器皿邊緣或相關(guān)材料接觸也會導(dǎo)致細(xì)菌污染。
1.1.2 真菌污染分析
真菌污染主要是由于接種箱或接種室內(nèi)空氣污染導(dǎo)致的。具體原因如下:接種室室內(nèi)空氣消毒處理未達(dá)到培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn);操作過程中,瓶蓋打開狀態(tài)下,有真菌孢子進(jìn)入瓶內(nèi);在去除包頭紙橡皮筋或包頭紙過程中,揚起了其表面附著的真菌孢子,造成室內(nèi)空氣污染。
1.1.3 潛伏性污染分析
有些污染是由培養(yǎng)材料內(nèi)部菌體導(dǎo)致的,如維管組織帶菌等,此類組織自身具有一定的防御細(xì)菌的能力,在培養(yǎng)初期,微生物處于潛伏狀態(tài)。隨著培養(yǎng)的持續(xù)進(jìn)行,培養(yǎng)環(huán)境發(fā)生較大的變化,外植體組織發(fā)生壞死,微生物開始繁殖,最終導(dǎo)致污染。
1.2 污染防治措施分析
組織培養(yǎng)污染防治措施,主要分為以下幾點內(nèi)容:做好培養(yǎng)室內(nèi)的消毒工作,使用濃度為70.0%的酒精噴霧進(jìn)行降塵消毒,使用標(biāo)準(zhǔn)消毒水對工作臺、地板及墻板等物體表面進(jìn)行消毒,并使用紫光燈進(jìn)行照射消毒;從加強(qiáng)對菌類來源的控制和管理,超凈工作臺門口應(yīng)懸掛雙層紗布,以阻隔灰塵及菌類污染物的進(jìn)入;操作人員在正式操作前,還應(yīng)做好個人消毒處理,并嚴(yán)格執(zhí)行相關(guān)操作規(guī)定,科學(xué)避免污染問題的發(fā)生。
2 褐化現(xiàn)象及防治措施分析
2.1 褐化問題成因分析
褐化主要是因外植體內(nèi)部多酚氧化酶處于激活狀態(tài),導(dǎo)致細(xì)胞代謝變化造成的,酚類物質(zhì)在氧化過程中產(chǎn)生醌類物質(zhì),此類物質(zhì)會對其他類型酶的活性產(chǎn)生抑制,并隨著培養(yǎng)的進(jìn)行而不斷擴(kuò)散,最終形成毒害。由于其顏色為褐色,所以這種變化被稱為褐化。褐化的影響因素眾多,如基因型、植物種類及外植體生理狀況等,均會引起褐化差異,不同類型的褐化,危害程度也不同。
2.1.1 基因型影響分析
在組織培養(yǎng)實踐過程中可以發(fā)現(xiàn),同一種植物組織培養(yǎng)過程中,部分樣品的褐變較少,而部分樣品較容易發(fā)生褐變。酚類物質(zhì)含量差異和多酚氧化酶活性差異,是造成這種實踐差異的主要原因。
2.1.2 外植體生理狀態(tài)影響
相關(guān)研究表明,材料自身生理狀態(tài)與接種后褐化現(xiàn)象有著直接且緊密的聯(lián)系,以歐洲栗為例,當(dāng)幼年體植株的醌類物質(zhì)含量就會遠(yuǎn)少于成年體植株。同時,外植體長短、生長季節(jié)等均會對褐變造成影響。
2.2 褐化問題防治措施分析
在植物培養(yǎng)前,應(yīng)確保外植體和培養(yǎng)條件的適宜性。多項試驗研究證明,優(yōu)化外植體選擇,加強(qiáng)培養(yǎng)條件的管理和控制,是避免組織培養(yǎng)出現(xiàn)褐化問題的主要渠道和手段。通常情況下,外植體具備較強(qiáng)的分生能力,創(chuàng)建適宜的培養(yǎng)條件,使外植體細(xì)胞脫分化和再分化處于最優(yōu)狀態(tài),即可達(dá)到理想的抑制褐變發(fā)生的目的;操作人員可選擇使用抗氧化劑的形式,人工降低醌類物質(zhì)的不良影響。目前,常用的抗氧化劑包括檸檬酸、血清白蛋白、Vit E、Vit C及聚乙烯吡咯烷酮等。
3 結(jié)語
植物組織培養(yǎng)是一個系統(tǒng)、復(fù)雜的過程,對于外植體選擇、培養(yǎng)條件控制及培養(yǎng)環(huán)境潔凈狀態(tài)有著較高且嚴(yán)苛的標(biāo)準(zhǔn)要求。為避免污染和褐化問題的發(fā)生,相關(guān)人員應(yīng)全面提高對組織培養(yǎng)工作的重視,加強(qiáng)消毒管理和個人衛(wèi)生管理,優(yōu)化外植體選擇和培養(yǎng)條件控制,以確保植物組織培養(yǎng)實施效果。
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