高效降解游離棉酚并改善棉籽粕營養(yǎng)品質(zhì)的菌株篩選

亓秀曄 謝全喜 陳 振 于佳民 徐海燕 谷 巍

(山東寶來利來生物工程股份有限公司，泰安271000)

高效降解游離棉酚并改善棉籽粕營養(yǎng)品質(zhì)的菌株篩選

亓秀曄 謝全喜 陳 振 于佳民 徐海燕 谷 巍

(山東寶來利來生物工程股份有限公司，泰安271000)

本試驗(yàn)旨在利用枯草芽孢桿菌和植物乳酸菌發(fā)酵棉籽粕，研究其對棉籽粕中游離棉酚降解率的影響，并對發(fā)酵前后棉籽粕的營養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)如活菌數(shù)、中性蛋白酶活性、酸溶蛋白質(zhì)含量、pH、游離棉酚含量等進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：可高效降解棉籽粕中游離棉酚的枯草芽孢桿菌菌株為BLCC1-0039，可有效改善發(fā)酵風(fēng)味的植物乳酸菌菌株為BLCC2-0092。綜合上述2株益生菌的優(yōu)點(diǎn)，篩選出最優(yōu)復(fù)配發(fā)酵方式為植物乳酸菌BLCC2-0092與枯草芽孢桿菌BLCC1-0039按照1∶1比例接種，37 ℃需氧發(fā)酵24 h再厭氧發(fā)酵。與空白對照組相比，最優(yōu)復(fù)配發(fā)酵組各發(fā)酵階段發(fā)酵棉籽粕的pH顯著降低(P<0.05)，厭氧發(fā)酵72 h時(shí)pH降至5.27；酸溶蛋白質(zhì)含量顯著提高(P<0.05)，厭氧發(fā)酵72 h時(shí)酸溶蛋白質(zhì)含量達(dá)到23.54%；游離棉酚含量顯著降低(P<0.05)，需氧發(fā)酵24 h時(shí)游離棉酚降解率達(dá)到52.12%，厭氧發(fā)酵72 h時(shí)游離棉酚降解率達(dá)到61.58%。由此可知，植物乳酸菌BLCC2-0092與枯草芽孢桿菌BLCC1-0039復(fù)配發(fā)酵可有效降低發(fā)酵棉籽粕中的游離棉酚含量并改善其營養(yǎng)品質(zhì)。

枯草芽孢桿菌；植物乳酸菌；棉籽粕；游離棉酚；營養(yǎng)品質(zhì)

隨著我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展，飼料的需求量越來越大。棉籽餅(粕)是一種優(yōu)質(zhì)的植物性蛋白質(zhì)飼料，其粗蛋白質(zhì)含量在20%～40%，粗纖維含量約為11%，此外，硫胺素和有機(jī)磷含量也比較多[1-2]，是畜禽飼糧中非常有價(jià)值的一種飼料原料。然而，棉籽餅(粕)中含有棉酚、環(huán)丙稀脂肪酸、單寧等有毒物質(zhì)，制約了其在畜牧業(yè)中的應(yīng)用，其中最主要的是棉酚。棉酚的存在形式有2種，即結(jié)合棉酚和游離棉酚。結(jié)合棉酚在機(jī)體消化系統(tǒng)中不被吸收，可很快隨糞便排出體外，毒性很低。游離棉酚分子結(jié)構(gòu)中的活性基團(tuán)(醛基和羧基)對動(dòng)物毒性很大，長期飼喂動(dòng)物過多的含未經(jīng)脫毒棉籽餅(粕)的飼料，棉酚會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)蓄積，引發(fā)中毒，導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)急性呼吸窘迫、厭食乏力等臨床癥狀，甚至死亡等[3]。

棉籽餅(粕)的主要脫毒方法有物理法、化學(xué)法、溶劑浸出法和微生物發(fā)酵法[4-7]，最具有應(yīng)用前景的是微生物發(fā)酵法，該法不但能脫除棉籽餅(粕)中的游離棉酚，而且還可以提高棉籽餅(粕)的粗蛋白質(zhì)含量，并且發(fā)酵底物中存留許多酶類、維生素、氨基酸以及一些促生長因子，從而大大改善棉籽餅(粕)的營養(yǎng)價(jià)值和飼用價(jià)值，提高棉籽餅(粕)的利用率[8]。但不同微生物菌種對棉酚的降解能力有較大的差異，篩選優(yōu)良的微生物菌種是保證棉籽餅(粕)脫毒效果和營養(yǎng)價(jià)值的首要步驟。據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌對棉酚具有較高的降解活性[6,9]，但某些芽孢桿菌在氨基酸代謝中會(huì)發(fā)生脫羧或脫氨作用，產(chǎn)生刺鼻的氨，影響發(fā)酵風(fēng)味；此外，乳酸菌對棉酚也具有較高的降解活性，其發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸和乙酸等揮發(fā)性物質(zhì)，可以改善飼料適口性。本研究旨在利用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和植物乳酸菌(Lactobacillusplantarum)對棉籽粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，以降低其棉酚含量，提高其營養(yǎng)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1 發(fā)酵原材料及菌株

試驗(yàn)用棉籽粕由新疆泰昆生物集團(tuán)提供，粉碎過40目篩。

枯草芽孢桿菌菌株：BLCC1-0039、BLCC1-0090、BLCC1-0157和BLCC1-0169；植物乳桿菌菌株：BLCC2-0015、BLCC2-0092、BLCC2-0111、BLCC2-0112和BLCC2-0111。以上菌株均由山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院菌種保藏中心保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基：葡萄糖2 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、酵母膏5 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)pH至7.0，121 ℃滅菌20 min。

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、牛肉膏8 g、酵母膏4 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸錳0.3 g、檸檬酸銨2 g、乙酸鈉5 g、吐溫-80 1 mL，蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)pH至6.0，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

葡萄糖：山東祥瑞藥業(yè)有限公司；蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉(分析純)：天津博迪化工股份有限公司；酵母膏、牛肉膏：天津市英博生化試劑有限公司；硫酸鎂、硫酸錳：濟(jì)南匯豐達(dá)化工有限公司；檸檬酸銨：上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；乙酸鈉：青島捷世康生物科技有限公司；吐溫-80：天津凱通化學(xué)試劑有限公司；乙腈、丙酮、甲醇(均為色譜級(jí))：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；磷酸(分析純)：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；微孔濾膜(直徑13 mm、孔徑0.22 μm)：上海安譜有限公司；棉酚標(biāo)準(zhǔn)品[高效液相色譜(HPLC)級(jí)]：上海源葉生物科技有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 種子液制備

取經(jīng)過2次活化的枯草芽孢桿菌斜面1環(huán)(約0.05 g)于裝有100 mL酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，待用。取經(jīng)過2次活化的植物乳酸菌斜面1環(huán)(約0.05 g)于裝有100 mL MRS培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，待用。

1.2.2 枯草芽孢桿菌的篩選

采用生料發(fā)酵。稱取一定量的棉籽粕于1 000 mL三角瓶中，料水比為1.0∶0.4(g∶mL)，裝料量為100 g/瓶，按2%接種量分別接入培養(yǎng)好的枯草芽孢桿菌種子液中，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，以不接種任何菌株的空白料為空白對照，均置于37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行需氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24和48 h后取樣，測定發(fā)酵樣的芽孢桿菌活菌數(shù)、中性蛋白酶活性、酸溶蛋白質(zhì)含量及游離棉酚含量。

1.2.3 植物乳酸菌的篩選

采用生料發(fā)酵。稱取一定量的棉籽粕裝袋，料水比為1.0∶0.4(g∶mL)，裝料量為100 g/袋，按2%接種量分別接入培養(yǎng)好的植物乳酸菌種子液，密封，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，以不接種任何菌株的空白料為空白對照，均置于37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行厭氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24和48 h后取樣，測定發(fā)酵樣的乳酸菌活菌數(shù)、pH、酸溶蛋白質(zhì)含量及游離棉酚含量。

1.2.4 枯草芽孢桿菌和植物乳酸菌第1次復(fù)配發(fā)酵

采用生料發(fā)酵。將上述篩選得到的枯草芽孢桿菌和植物乳酸菌進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵，發(fā)酵方式為先需氧7 h再厭氧48 h。稱取一定量的棉籽粕裝袋，料水比為1.0∶0.4(g∶mL)，裝料量為100 g/袋，按2%接種量接種復(fù)配菌(枯草芽孢桿菌∶植物乳酸菌=1∶1)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，以不接種任何菌株的空白料為空白對照，置于37 ℃培養(yǎng)箱發(fā)酵，分別于厭氧發(fā)酵24和48 h后取樣，測定發(fā)酵樣的乳酸菌和芽孢桿菌活菌數(shù)、pH、中性蛋白酶活性。

1.2.5 枯草芽孢桿菌和植物乳酸菌第2次復(fù)配發(fā)酵

采用生料發(fā)酵。將上述第1次復(fù)配發(fā)酵篩選得到的枯草芽孢桿菌和植物乳酸菌進(jìn)行第2次復(fù)配發(fā)酵，發(fā)酵方式為先需氧24 h再厭氧48 h(共計(jì)72 h)。稱取一定量的棉籽粕裝袋，料水比為1.0∶0.4(g∶mL)，裝料量為100 g/袋，按2%接種量接種復(fù)配菌(枯草芽孢桿菌∶植物乳酸菌=1∶1)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，以不接種任何菌株的空白料為空白對照，置于37 ℃培養(yǎng)箱發(fā)酵，分別于需氧發(fā)酵24 h以及厭氧發(fā)酵48、72 h后取樣，測定發(fā)酵樣的乳酸菌和芽孢桿菌活菌數(shù)、中性蛋白酶活性、pH、酸溶蛋白質(zhì)含量及游離棉酚含量。

1.3測定指標(biāo)及方法

1.3.1 芽孢稈菌和乳酸菌活菌數(shù)的測定

準(zhǔn)確稱取發(fā)酵棉籽粕10.0 g，用玻璃珠振蕩打散菌群，以便稀釋計(jì)數(shù)。用生理鹽水10倍遞增稀釋，取適當(dāng)稀釋度的樣品分別至酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基及MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落數(shù)計(jì)算樣品中芽孢桿菌和乳酸菌活菌數(shù)，結(jié)果用CFU/g表示。

1.3.2 中性蛋白酶活性的測定

準(zhǔn)確稱取發(fā)酵棉籽粕1.0 g，加入8倍體積的磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)溶解，充分混勻后離心取上清液，采用福林-酚試劑法測定樣品中中性蛋白酶活性。中性蛋白酶活性定義：1 g固體酶粉(或1 mL液體酶)，在一定溫度和pH條件下，1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個(gè)活性單位，以U/g表示。

1.3.3 酸溶蛋白質(zhì)含量的測定

準(zhǔn)確稱取2.00 g發(fā)酵棉籽粕于25 mL具塞試管中，加入15%三氯乙酸溶液10 mL，混合均勻，靜止5 min，定容至25 mL，每隔2 min混勻1次，共計(jì)時(shí)30 min。將溶液定量轉(zhuǎn)移，抽濾，取濾液10 mL，轉(zhuǎn)入消化管中，加入3 g混合催化劑(硫酸鉀∶無水硫酸銅=15∶1)，與濾液混合均勻，再加入7～8 mL濃硫酸，將消化管置于消化爐中420 ℃消化，待消化液呈透亮的藍(lán)綠色時(shí)，繼續(xù)消化40 min，按照凱氏定氮法測定上清液中可溶性蛋白質(zhì)含量。另準(zhǔn)確稱取2.00 g發(fā)酵棉籽粕，采用凱氏定氮法測定樣品中粗蛋白質(zhì)含量。

酸溶蛋白質(zhì)含量(%)=(上清液中可溶性蛋白質(zhì)含量×25/10)/樣品中粗蛋白質(zhì)含量。

1.3.4 游離棉酚含量的測定[10]

棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取棉酚標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈-0.2%磷酸(體積比為85∶15)溶解得1.21 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，標(biāo)準(zhǔn)貯備液再用乙腈-0.2%磷酸(體積比為85∶15)稀釋成121 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液。用流動(dòng)相將標(biāo)準(zhǔn)品工作液逐級(jí)稀釋得到濃度分別為61.50、20.17、5.04、2.52和1.21 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度由低至高進(jìn)樣測定，以峰面積和濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.000 005 45X+0.160 525(R2=0.999 965 2)，線性范圍為1.21～121 μg/mL。

待測樣品游離棉酚的提?。簻?zhǔn)確稱取待測樣品3.00 g，加入丙酮30 mL，超聲提取30 min，25 ℃下3 000 r/min離心10 min，重復(fù)提取3次，合并上清液。將上清液全部轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用乙腈-0.2%磷酸(體積比為85∶15)溶液溶解，多次超聲清洗轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，定容，過0.22 μm濾膜后供HPLC測定。

1.4數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007進(jìn)行初步處理后，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)程序進(jìn)行方差分析，LSD法進(jìn)行組間多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由棉酚標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖(圖1，棉酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度6.15 μg/mL)，可以看出，在5.686 min左右出棉酚色譜峰，且穩(wěn)定性良好、分離效果好、峰型理想、靈敏度高。由圖2可以看出，游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線線性吻合良好、定量范圍廣、定量限低、準(zhǔn)確度和靈敏度高，該方法可用于準(zhǔn)確測定游離棉酚的含量。

2.2枯草芽孢桿菌的篩選

由表1可知，發(fā)酵24 h時(shí)，各芽孢桿菌菌株均能夠成功發(fā)酵棉籽粕，各組發(fā)酵棉籽粕中芽孢桿菌活菌數(shù)均在幾十億水平，以BLCC1-0039和BLCC1-0157組較高，顯著高于BLCC1-0090和BLCC1-0169組(P<0.05)；發(fā)酵棉籽粕酸溶蛋白質(zhì)含量以BLCC1-0039組最高，其次是BLCC1-0157組，均顯著高于空白對照組(P<0.05)，其中BLCC1-0039組的酸溶蛋白質(zhì)含量較空白對照組高出54.80%。發(fā)酵棉籽粕中中性蛋白酶活性以BLCC1-0039組最高，達(dá)到4 111.40 U/g，其次是BLCC1-0157組，二者均顯著高于BLCC1-0090和BLCC1-0169組(P<0.05)，但二者間差異不顯著(P>0.05)。

圖1 棉酚標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖

圖2 游離棉酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由表1可知，發(fā)酵48 h時(shí)，各組發(fā)酵棉籽粕中芽孢桿菌活菌數(shù)均達(dá)到幾十億水平及以上，以BLCC1-0039組最高，BLCC1-0157組次之。與空白對照組相比，各菌株發(fā)酵均顯著提高了發(fā)酵棉籽粕中酸溶蛋白質(zhì)含量(P<0.05)，其中以菌株BLCC1-0039發(fā)酵時(shí)最高，較空白對照組提高了69.43%。發(fā)酵棉籽粕中中性蛋白酶活性以BLCC1-0039組最高，達(dá)到3 983.24 U/g，其次是BLCC1-0157組，二者均顯著高于空白對照組以及BLCC1-0090和BLCC1-0169組(P<0.05)，但二者間差異不顯著(P>0.05)。綜上可知，枯草芽孢桿菌各菌株發(fā)酵棉籽粕均可以提高酸溶蛋白質(zhì)含量和中性蛋白酶活性，其中以菌株BLCC1-0039的效果最好。

由表2可知，發(fā)酵24 h時(shí)以BLCC1-0039組發(fā)酵棉籽粕游離棉酚含量最低，顯著低于其他各組(P<0.05)，其游離棉酚降解率達(dá)到93.89%，其次是BLCC1-0157組；菌株BLCC1-0039發(fā)酵棉籽粕48 h時(shí)發(fā)酵棉籽粕游離棉酚含量最低，顯著高于其余3株菌株發(fā)酵時(shí)(P<0.05)，其游離棉酚降解率達(dá)到96.67%。綜合可知，4株枯草芽孢桿菌中以菌株BLCC1-0039發(fā)酵棉籽粕降棉酚效果最好。

2.3植物乳酸菌的篩選

由表3可知，5個(gè)植物乳酸菌發(fā)酵組中，發(fā)酵24 h時(shí)除BLCC2-0112組發(fā)酵棉籽粕中乳酸菌活菌數(shù)較低外，其他植物乳酸菌發(fā)酵組間差異不顯著(P>0.05)，均在幾十億水平，發(fā)酵48 h時(shí)仍以BLCC2-0112組發(fā)酵棉籽粕中乳酸菌活菌數(shù)最低，顯著低于其他植物乳酸菌發(fā)酵組(P<0.05)；無論是發(fā)酵24 h時(shí)還是發(fā)酵48 h時(shí)，發(fā)酵棉籽粕中酸溶蛋白質(zhì)含量和游離棉酚含量各組間均差異不顯著(P>0.05)；無論是發(fā)酵24 h時(shí)還是發(fā)酵48 h時(shí)，發(fā)酵棉籽粕的pH均以BLCC2-0092和BLCC2-0001組最低，其次為BLCC2-0015組，這3組在發(fā)酵48 h時(shí)pH均降至5.00以下，其中BLCC2-0092組在發(fā)酵48 h時(shí)pH降至4.67。從降低發(fā)酵棉籽粕的pH來看，5株植物乳酸菌中以菌株BLCC2-0092、BLCC2-0001和BLCC2-0015發(fā)酵棉籽粕較好，最優(yōu)為菌株BLCC2-0092。

表1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵對發(fā)酵棉籽粕品質(zhì)的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表2 枯草芽孢菌發(fā)酵對發(fā)酵棉籽粕游離棉酚含量的影響

游離棉酚降解率=[(空白對照組樣品游離棉酚含量-發(fā)酵組樣品游離棉酚含量)/空白對照組樣品游離棉酚含量]×100。表5同。

Free gossypol degrading rate=[(sample free gossypol content in CK group-sample free gossypol content in fermentation group)/ sample free gossypol content in CK group]×100. The same as Table 5.

2.4植物乳酸菌和枯草芽孢桿菌第1次復(fù)配發(fā)酵

由表4可知，棉籽粕由植物乳酸菌和枯草芽孢桿菌復(fù)配菌株先需氧發(fā)酵7 h情況下，再厭氧發(fā)酵24 h時(shí)后各復(fù)配菌株發(fā)酵組發(fā)酵棉籽粕乳酸菌活菌數(shù)均達(dá)到幾十億水平，pH降至6.00以下，厭氧發(fā)酵48 h時(shí)pH降至5.00以下，說明植物乳酸菌發(fā)酵成功；厭氧發(fā)酵48 h時(shí)各復(fù)配菌株發(fā)酵組發(fā)酵棉籽粕芽孢桿菌活菌數(shù)與厭氧發(fā)酵24 h相比增加了1個(gè)數(shù)量級(jí)，但48 h時(shí)中性蛋白酶活性最高僅在201.18 U/g(枯草芽孢桿菌BLCC1-0039單獨(dú)發(fā)酵48 h后中性蛋白酶活性可達(dá)到3 983.24 U/g)，說明此條件下不適宜枯草芽孢桿菌生長。

2.5植物乳酸菌和枯草芽孢桿菌第2次復(fù)配發(fā)酵

由于第1次設(shè)定的復(fù)配發(fā)酵條件不適宜芽孢桿菌生長，之后改變發(fā)酵方式，延長需氧發(fā)酵時(shí)間至24 h，并選取降解棉酚效果較好的植物乳桿菌BLCC2-0092、BLCC2-0001和枯草芽孢桿菌BLCC1-0039進(jìn)行第2次復(fù)配發(fā)酵。

由表5可以看出，延長需氧發(fā)酵時(shí)間至24 h時(shí)，各復(fù)配菌株發(fā)酵組發(fā)酵棉籽粕中乳酸菌和芽孢桿菌活菌數(shù)均可以達(dá)到幾十億水平，中性蛋白酶活性較高，均達(dá)到2 000 U/g以上。綜合各項(xiàng)指標(biāo)來看，2個(gè)復(fù)配菌株發(fā)酵組中以BLCC2-0092+BLCC1-0039組最優(yōu)。與空白對照組相比，BLCC2-0092+BLCC1-0039組各發(fā)酵階段的發(fā)酵棉籽粕的pH均顯著降低(P<0.05)，厭氧發(fā)酵72 h時(shí)pH降至5.27；酸溶蛋白質(zhì)含量顯著提高(P<0.05)，厭氧發(fā)酵72 h時(shí)酸溶蛋白質(zhì)含量達(dá)到23.54%；游離棉酚含量顯著降低(P<0.05)，需氧發(fā)酵24 h時(shí)游離棉酚降解率達(dá)到52.12%，厭氧發(fā)酵72 h時(shí)游離棉酚降解率達(dá)到61.58%。

表3 植物乳酸菌發(fā)酵對棉籽粕品質(zhì)和游離棉酚含量的影響

表4 植物乳酸菌和枯草芽孢桿菌第1次復(fù)配發(fā)酵對棉籽粕品質(zhì)的影響

3 討 論

微生物發(fā)酵棉籽餅(粕)脫毒的關(guān)鍵是菌種的選擇，不同微生物菌種對棉酚的降解能力不同，篩選優(yōu)良的微生物菌種是影響棉籽餅(粕)脫毒效果的首要條件。提高微生物發(fā)酵棉籽餅(粕)，在使其游離棉酚含量的安全性大大提高的同時(shí)，若粗蛋白質(zhì)含量及其他飼用品質(zhì)也能得到大幅度的提高，就可以提高其在動(dòng)物飼糧中的添加量，提高棉籽餅(粕)的利用率[11]；發(fā)酵、酶解粕類和植物蛋白質(zhì)源的主要目的是將其中的大分子蛋白質(zhì)降解成為小分子蛋白質(zhì)，甚至降解成多肽和小肽，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)礦物質(zhì)元素的吸收利用，提高動(dòng)物機(jī)體的免疫機(jī)能以及動(dòng)物的生長速率和生產(chǎn)性能。研究表明，使用酸溶蛋白質(zhì)含量指標(biāo)評(píng)價(jià)發(fā)酵、酶解粕類蛋白質(zhì)品質(zhì)，既可以反映其中抗原蛋白質(zhì)和其他蛋白質(zhì)抗?fàn)I養(yǎng)因子被水解的程度，進(jìn)而揭示該類抗?fàn)I養(yǎng)因子活性被消除的程度，又可在一定程度上反映肽含量的高低[12-13]；枯草芽孢桿菌是美國食品藥物管理局公布的安全菌種[14]，是當(dāng)今工業(yè)酶的主要生產(chǎn)菌種之一，也是工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛的菌種之一，其中性蛋白酶活性為枯草芽孢桿菌生長的主要考察指標(biāo)[15]。據(jù)報(bào)道，利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉籽粕，特別是加入木瓜蛋白酶后可有效提高棉籽粕的營養(yǎng)價(jià)值[16]。

表5 植物乳酸菌和枯草芽孢桿菌第2次復(fù)配發(fā)酵對棉籽粕品質(zhì)的影響

目前報(bào)道的用于棉籽餅(粕)脫毒的菌株種類較少，且主要集中于酵母菌和霉菌，有關(guān)天然真菌的脫毒效果也有一些報(bào)道[17-18]。而對于降解棉酚的芽孢桿菌，相關(guān)研究有枯草芽孢桿菌M-9[9]和M-4[6]，這2株枯草芽孢桿菌對棉酚具有較高的降解活性，但仍存在一些不足，如：在對棉籽餅(粕)進(jìn)行發(fā)酵脫毒時(shí)需要額外加入碳源(蔗糖等)，增加了棉酚降解的成本；菌種的接種量大(10%)、降解所需時(shí)間長(60 h以上)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌Br可有效降解棉籽粕中的棉酚，但僅對滅菌后的棉籽粕有效，未滅菌處理的棉籽粕中的微生物反而會(huì)抑制蠟樣芽孢桿菌Br的生長[19]。在本研究中，利用枯草芽孢桿菌BLCC1-0039單獨(dú)發(fā)酵棉籽粕，37 ℃發(fā)酵24 h后游離棉酚降解率達(dá)到93.89%，此外，中性蛋白酶活性達(dá)到4 111.40 U/g，酸溶蛋白質(zhì)含量達(dá)到21.10%。

雖然作者在文獻(xiàn)中未查閱到乳酸菌在降解棉酚方面的相關(guān)文章，但是乳酸菌發(fā)酵飼料具有氣味香、適口性好、飼喂簡單方便、消化率高、功效穩(wěn)定等優(yōu)勢，因此具有良好的生產(chǎn)和應(yīng)用價(jià)值[20]。本研究發(fā)現(xiàn)植物乳酸菌不具有降解棉酚的能力，但可以降低發(fā)酵棉籽粕的pH，植物乳酸菌BLCC2-0092發(fā)酵24 h時(shí)，發(fā)酵棉籽粕pH降至5.47。因此，利用植物乳酸菌和枯草芽孢桿菌復(fù)配發(fā)酵棉籽粕，在降低發(fā)酵棉籽粕中游離棉酚含量的同時(shí)，可以消除枯草芽孢菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的刺鼻的氨味，改善發(fā)酵風(fēng)味，提高飼料營養(yǎng)價(jià)值。通過2次復(fù)配發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，植物乳酸菌BLCC2-0092和枯草芽孢桿菌BLCC1-0039按照比例1∶1接種，37 ℃需氧發(fā)酵24 h再厭氧發(fā)酵時(shí)效果優(yōu)于同等條件下需氧發(fā)酵7 h再厭氧發(fā)酵的情況，說明較長的需氧發(fā)酵時(shí)間有利于枯草芽孢桿菌的生長，而枯草芽孢桿菌的生長對棉酚的降解至關(guān)重要，再進(jìn)行厭氧發(fā)酵有利于乳酸菌的生長，乳酸菌的生長會(huì)降低發(fā)酵料的pH，對改善發(fā)酵風(fēng)味至關(guān)重要。與空白對照組相比，最優(yōu)復(fù)配發(fā)酵組(BLCC2-0092+BLCC1-0039組)各階段發(fā)酵棉籽粕的pH顯著降低，厭氧發(fā)酵72 h時(shí)pH降至5.27，改善了發(fā)酵風(fēng)味，增加了酸香味；酸溶蛋白質(zhì)含量顯著提高，厭氧發(fā)酵72 h時(shí)酸溶蛋白質(zhì)含量達(dá)到23.54%；游離棉酚含量顯著降低，需氧發(fā)酵24 h時(shí)游離棉酚降解率達(dá)到52.12%，厭氧發(fā)酵72 h時(shí)游離棉酚降解率達(dá)到61.58%。本研究得出的游離棉酚降解率高于王曉玲等[21]利用枯草芽孢桿菌和釀酒酵母復(fù)配發(fā)酵棉籽粕(30 ℃需氧發(fā)酵48 h)所得的游離棉酚降解率(48.5%)。

4 結(jié) 論

① 利用枯草芽孢桿菌BLCC1-0039發(fā)酵棉籽粕，可有效降低發(fā)酵棉籽粕中的游離棉酚含量，發(fā)酵24 h后游離棉酚降解率可達(dá)93.89%，同時(shí)可有效提高發(fā)酵棉籽粕中的中性蛋白酶活性和酸溶蛋白質(zhì)含量。

② 植物乳酸菌無降解游離棉酚的能力，但可有效降低發(fā)酵棉籽粕的pH，植物乳酸菌BLCC2-0092發(fā)酵48 h后發(fā)酵棉籽粕的pH降至4.67。

③ 枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌復(fù)配發(fā)酵可有效降低發(fā)酵棉籽粕中的游離棉酚含量，并提高發(fā)酵棉籽粕中的中性蛋白酶活性和酸溶蛋白質(zhì)含量，有效降低發(fā)酵棉籽粕的pH，增加酸香味。

④ 綜合各指標(biāo)，推薦棉籽粕的最優(yōu)復(fù)配發(fā)酵方式為枯草芽孢桿菌BLCC2-0092與枯草芽孢桿菌BLCC1-0039按照1∶1比例接種，37 ℃時(shí)需氧發(fā)酵24 h再繼續(xù)厭氧發(fā)酵。

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Author, QI Xiuye, assistant professor, E-mail： 437734742@qq.com

(責(zé)任編輯 菅景穎)

Screening of High Efficient Free Gossypol-Degrading and Improving Cottonseed Meal Nutritive Quality Stains

QI Xiuye XIE Quanxi CHEN Zhen YU Jiamin XU Haiyan GU Wei

(Shandong Baolai-Leelai Bioengineering Co., Ltd., Tai’an 271000, China)

This experiment was conducted to study the effects of cottonseed meal fermented byBacillussubtilisandLactobacillusplantarumon free gossypol degrading rate of cottonseed meal, and to compare the nutritive quality indices of cottonseed meal before and after fermentation, such as viable count of bacteria, neutral proteases activity, pH, acid-soluble protein content and gossypol content, etc. The results showed that theBacillussubtilisBLCC1-0039 had high efficient free gossypol-degrading capacity and theLactobacillusplantarumBLCC2-0092 had improving fermentation flavor capacity. Comprehensive the advantages ofBacillussubtilisBLCC1-0039 andLactobacillusplantarumBLCC2-0092, the optimal compound fermentation conditions were showed as follows: the inoculative proportion ofBacillussubtilisBLCC1-0039 andLactobacillusplantarumBLCC2-0092 was 1∶1, 24 h for aerobic fermentation and then anaerobic fermentation. Compared with control check group, the pH of fermented cottonseed meal in each fermentation stage of optimal compound fermentation group was significantly decreased (P<0.05), and the pH after anaerobic fermentation 72 h reduced to 5.27; the acid-soluble protein content was significantly (P<0.05), and the acid-soluble protein content after anaerobic fermentation 72 h increased to 23.54%; the feed gossypol content was significantly decreased (P<0.05), and the free gossypol degrading rate after aerobic fermentation 24 h and anaerobic fermentation 72 h reached to 52.12% and 61.58%, respectively. It is concluded that compound fermentation ofBacillussubtilisBLCC1-0039 andLactobacillusplantarumBLCC2-0092 can effectively degrade the content of free gossypol in cottonseed meal and improve the nutritive quality of cottonseed meal.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(9)：3258-3266]

Bacillussubtilis;Lactobacillusplantarum; cottonseed meal; free gossypol; nutritive quality

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.09.029

2017-02-23

泰安市科技發(fā)展計(jì)劃(201540701)

亓秀曄(1987—)，女，山東泰安人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物微生態(tài)制劑研發(fā)工作。E-mail： 437734742@qq.com

S816

：A

：1006-267X(2017)09-3258-09