采用聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)分析小熊貓胃腸道菌群的多樣性

李 楊 鄧家波 牛李麗 余建秋 曾 燕 劉 倩 周 毅 熊律晨 倪學勤** 曾 東**

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院動物微生態(tài)研究中心，成都611130；2.成都動物園，成都610081)

采用聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)分析小熊貓胃腸道菌群的多樣性

李 楊1鄧家波2*牛李麗2余建秋2曾 燕1劉 倩1周 毅1熊律晨1倪學勤1**曾 東1**

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院動物微生態(tài)研究中心，成都611130；2.成都動物園，成都610081)

本試驗旨在研究小熊貓胃腸道菌群多樣性。采用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)-變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)結(jié)合條帶的克隆測序、聚類分析和主成分分析(PCA)檢測小熊貓胃腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性。結(jié)果表明：1)PCR-DGGE圖譜顯示小熊貓胃腸道中有大量菌群，且不同部位的菌群結(jié)構(gòu)存在一定的差異，相鄰腸段菌群結(jié)構(gòu)具有一定的相似性。結(jié)腸和糞便樣品的菌群多樣性較高，其次為胃和直腸樣品，而空腸和回腸樣品菌群多樣性較低。2)小熊貓胃腸道菌群PCR-DGGE圖譜中測序的條帶大多數(shù)歸為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroides)、變形菌門(Proteobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)，共性條帶主要是未培養(yǎng)擬桿菌門細菌(uncultured Bacteroidetes bacterium)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、未培養(yǎng)梭狀芽孢桿菌(unculturedClostridiumsp.)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)和食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)，其中厚壁菌門為優(yōu)勢菌群；特異性條帶主要是叢毛單胞菌(Comamonassp.)、梭菌屬(Clostridiumsp.)和Akkermansia。由此可見，小熊貓胃腸道中棲息著大量菌群，且其多樣性按照胃腸道由前至后的順序呈現(xiàn)高-低-高的趨勢。

小熊貓；胃腸道菌群；PCR-DGGE；多樣性；克隆測序

小熊貓(Ailrususfulgens)是喜馬拉雅-橫斷山脈特有的小型珍稀野生動物，僅分布于中國、尼泊爾、不丹、錫金、印度和緬甸北部地區(qū)，被列為國家二級保護動物。小熊貓是食肉目浣熊科，但具有與大熊貓極為相似的地理分布、生理結(jié)構(gòu)和行為生態(tài)，是高度特化的素食性食肉目動物，在分類、生態(tài)學等領(lǐng)域具有較高的科學研究價值[1]。但由于人類活動和棲息地的破壞，我國小熊貓的數(shù)量在過去的半個世紀已降低40%[2]。1936年我國動物園開始圈養(yǎng)和保護小熊貓，且隨著2003年小熊貓捕捉許可證的禁止發(fā)放及科學合理的保護，其繁殖和種群得到提高。近年來，越來越多的研究表明，動物的生理代謝和生長發(fā)育與其胃腸道的微生物密切相關(guān)[3]。同樣，小熊貓的腸道微生物在竹子的消化過程中扮演著重要角色[4]。目前，小熊貓的糞便菌群結(jié)構(gòu)及組成等信息已初步被報道和研究[4-6]，但其整個胃腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成的研究還未見報道，其中棲息的微生物及微生物的作用等信息大多仍處于未知狀態(tài)。目前，對野生動物胃腸道微生物的研究和利用已成為其繁殖及種群保護的重要措施[7]。因此，胃腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成的研究對小熊貓的飼養(yǎng)、疾病預防及種群保護具有重要的指導意義。

現(xiàn)代分子生物學技術(shù)為腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究提供了強有力的保障，其中，聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)-變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)作為一種快速可靠的比較菌群多樣性的指紋圖譜技術(shù)，自1993年被Muyzer等[8]首次報道后，已被廣泛應(yīng)用于動物胃腸道菌群多樣性的研究。因此，本研究采用PCR-DGGE技術(shù)結(jié)合條帶的克隆測序，分析小熊貓胃腸道菌群結(jié)構(gòu)及組成，為小熊貓的飼養(yǎng)管理、疾病預防及種群保護提供現(xiàn)實指導。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1 樣品采集

1.1.2 試驗試劑與儀器

1.2胃腸道細菌總DNA的提取

1.3細菌總DNA的16SrDNAV3區(qū)PCR擴增

使用大腸桿菌通用引物[8]對細菌的16S rDNA V3區(qū)序列進行PCR擴增。上游引物：5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGG

以Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量實驗為例，將全班學生分成6～8組，每組按大綱要求自主查閱文獻資料，制作PPT，教師提前發(fā)布關(guān)于原理和注意事項的課件以及微量移液器、721分光光度計的使用錄像，感興趣的學生也可參與實驗準備。正式實驗時，每組先由1名學生代表匯報，教師隨時點評匯報內(nèi)容和解答學生預習過程中的疑問，隨后分別進行實驗。如此，筆者在實驗結(jié)束批改報告時發(fā)現(xiàn)，和以往相比，學生直接抄書的現(xiàn)象基本沒有，實驗討論和結(jié)論部分的撰寫不再敷衍，盡可能體現(xiàn)自己的見解和創(chuàng)新。

CACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′(帶下劃線部分為“GC”夾子)；下游引物5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。反應(yīng)體系(25.0 μL)：2×Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，雙蒸水(ddH2O)9.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.4PCR-DGGE凝膠電泳及條帶克隆測序

1.5數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010、SPSS 19.0和NTSYS 2.1等軟件對PCR-DGGE圖譜進行菌群多樣性分析、主成分分析(PCA)和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1小熊貓胃腸道菌群的PCR-DGGE圖譜及聚類分析

PCR-DGGE圖譜中，顏色深的條帶代表優(yōu)勢菌群，條帶的數(shù)量和位置分布代表細菌菌群的豐富度和種類。小熊貓胃腸道樣品經(jīng)PCR-DGGE檢測分離出不同數(shù)量的條帶，且條帶的強度和位置存在一定差異(圖1)。PCR-DGGE圖譜顯示，來自胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸和糞便樣品的條帶數(shù)分別為15、10、6、13、19、16和17條；且胃腸道部位對菌群結(jié)構(gòu)及組成影響較大，來自結(jié)腸和糞便樣品的菌群多樣性較高，其次為胃和直腸樣品，而空腸和回腸樣品菌群多樣性較低。聚類分析(圖1)表明，小熊貓十二指腸和回腸樣品聚為一簇，其相似性系數(shù)較高，為0.76；來自結(jié)腸和直腸的樣品聚為一簇，相似性系數(shù)為0.68；而來自胃和糞便的樣品聚為一簇，相似性系數(shù)僅為0.53；小熊貓不同腸段樣品與糞便和胃的樣品分離開來，相似性系數(shù)僅為0.45，這表明小熊貓胃腸道不同部位菌群結(jié)構(gòu)存在一定的差異性。

帶箭頭的1～16為條帶編號。樣品編號中Sto、Duo、Jej、Ile、Col、Rec和Fae分別表示胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸和糞便樣品。下圖同。

1 to 16 with arrow are the bands No. Sto, Duo, Jej, Ile, Col, Rec and Fae stand for the samples from stomach, duodenum, jejunum, ileum, colon, rectum and faeces, respectively. The same as below.

圖1小熊貓胃腸道菌群的PCR-DGGE圖譜及聚類分析

Fig.1 PCR-DGGE profiles and cluster analysis of bacteria from gastrointestinal tract ofAilurusfulgens

2.2小熊貓胃腸道菌群PCR-DGGE圖譜的多樣性分析

由圖2可知，小熊貓胃腸道不同部位菌群多樣性存在差異，空腸樣品菌群的香農(nóng)多樣性指數(shù)、均勻度和豐富度最低，分別為2.20、0.60和9；結(jié)腸樣品菌群的多樣性、均勻度和豐富度最高，分別為3.09、0.84和22；胃、直腸及糞便樣品菌群的多樣性、豐富度和均勻度較為相似，分別為2.89、0.78和18，2.94、0.80和19及3.00、0.81和20；按照胃腸道由前至后的順序，腸道菌群多樣性呈現(xiàn)高-低-高的趨勢，這可能與胃腸道不同部位的消化功能及環(huán)境有關(guān)。因此，小熊貓的胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸和糞便樣品中，空腸樣品菌群的多樣性較低，結(jié)腸樣品菌群的多樣性較高，胃、直腸和糞便樣品的菌群多樣性較為相似，這與PCR-DGGE圖譜分析結(jié)果一致。

圖2 小熊貓胃腸道菌群的香農(nóng)多樣性指數(shù)、均勻度及豐富度

2.3小熊貓胃腸道菌群PCR-DGGE圖譜的PCA

PCR-DGGE圖譜的PCA(圖4)與聚類分析的結(jié)果一致。主成分因子1(PC1)的貢獻率為33.56%，主成分因子2(PC2)的貢獻率為24.70%。PC1明顯將糞便樣品與其他樣品分開，而PC2明顯將結(jié)腸、直腸和糞便樣品與其他樣品分開，表明小熊貓結(jié)腸、直腸和糞便樣品菌群結(jié)構(gòu)及組成與其他樣品存在較大差異；而胃、十二指腸、空腸和回腸樣品聚在一起，表明小熊貓胃腸道不同部位菌群結(jié)構(gòu)及組成存在一定的差異性，但相鄰部位樣品的菌群結(jié)構(gòu)及組成具有一定的相似性。

圖3 PCR-DGGE圖譜的PCA

2.4小熊貓胃腸道菌群PCR-DGGE圖譜的共性條帶和特異性條帶分析

從PCR-DGGE圖譜回收的16個條帶(圖1箭頭所指)測序比對結(jié)果見表1?？寺y序結(jié)果顯示(表2)，小熊貓胃腸道的分離鑒定的共性條帶主要來自厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroides)和變形菌門(Proteobacteria)，包括大量未培養(yǎng)擬桿菌門細菌(uncultured Bacteroidetes bacterium)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、未培養(yǎng)細菌(uncultured bacterium)、約翰遜不動桿菌(Acinetobacterjohnsonii)、未培養(yǎng)梭狀芽孢桿菌(unculturedClostridiumsp.)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)和食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)，其中有8株細菌屬于厚壁菌門(占總分離鑒定菌的比例為50.00%)，是小熊貓胃腸道中的優(yōu)勢菌群，腸球菌有3株(占總分離鑒定菌的比例為18.75%)，是厚壁菌門中的優(yōu)勢菌群；特異性條帶主要來自厚壁菌門、變形菌門和疣微菌門(Verrucomicrobia)，分別是叢毛單胞菌(Comamonassp.)、布勞特氏菌(Blautiasp.)、未培養(yǎng)細菌、梭菌屬(Clostridiumsp.)和Akkermansia。所有測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中微生物的相似性均不低于99%，說明試驗中測序的序列與數(shù)據(jù)庫中已鑒定的微生物的親緣性較高。

表1 PCR-DGGE圖譜的共性條帶和特異性條帶的基因片段比對結(jié)果

續(xù)表1條帶編號BandNo.長度Length/bpGenBank數(shù)據(jù)庫中最相近的菌種ClosestrelativesfoundintheGenBankdatabase登錄號AccessionNo.相似性Similarity/%備注Note11/k169未培養(yǎng)細菌H1-plate3_F11UnculturedbacteriumcloneH1-plate3_F11HQ176078.1100特異性條帶Specialband12/l175Akkermansia菌株YL44AkkermansiastrainYL44KR364731.199特異性條帶Specialband13/m195乳酸乳球菌菌株1.8.45Lactococcuslactisstrain1.8.45KX648807.1100共性條帶Commonband14/n194未培養(yǎng)細菌克隆FS2_SC_103UnculturedbacteriumcloneFS2_SC_103KC805571.1100共性條帶Commonband15/o194食竇魏斯氏菌Weissellacibariastrain3.8.19KX648910.1100共性條帶Commonband16/p169梭狀芽孢桿菌PT168Clostridiumsp.PT168KY124221.1100特異性條帶Specialband

表2 克隆測序條帶的分類及分布

表中字母為表1中條帶編號 Letters in table were the band No. in Table 1。

3 討 論

野生動物的種群繁殖及保護是目前全球科學家共同關(guān)注的核心問題[9]，而其胃腸道微生物的研究和利用已成為其繁殖及種群保護的重要措施[7]。盡管小熊貓與大熊貓在分類上屬于親緣關(guān)系較遠的2個物種，但全基因組的比較分析結(jié)果表明它們有與竹子生活方式相似的進化變化相關(guān)基因和酶類，使得它們適應(yīng)低營養(yǎng)的竹子食物[1]。而胃腸道共生微生物與宿主的消化和生理功能密切相關(guān)[10]。因此，本研究分析了小熊貓胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸和糞便樣品PCR-DGGE圖譜條帶的分布、數(shù)量及強度等信息，在分子水平上快速、直觀地反映了其胃腸道菌群的結(jié)構(gòu)特點及多樣性。PCR-DGGE圖譜(圖1)顯示小熊貓胃腸道中存在著大量的菌群，而這些菌群與宿主的關(guān)系仍需進一步研究。盡管野生動物因其保護特性和生存特點而難以采集并對其胃腸道微生物進行深入研究，但近年來越來越多的野生動物胃腸道微生物信息被陸續(xù)報道[11-12]，這些研究工作為全球野生動物的飼養(yǎng)管理和種群保護發(fā)揮了重要作用。

小熊貓胃腸道樣品PCR-DGGE圖譜的聚類分析結(jié)果(圖1)顯示，盡管十二指腸和回腸是非相鄰的腸段，但其樣品聚類在一起，且菌群結(jié)構(gòu)及組成相似性較高，可能與小熊貓小腸結(jié)構(gòu)特征及其食物的排空時間較短有關(guān)。小腸是消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要部位，小熊貓的小腸比較發(fā)達，長度可達350 cm，且無盲腸[13]，其消化道對食物的滯留時間在各種哺乳動物中最短[14]。PCR-DGGE圖譜的PCA(圖3)和菌群的多樣性指數(shù)分析結(jié)果(圖2)顯示，小熊貓結(jié)腸樣品菌群多樣性較高，且按照胃腸道由前至后的順序，樣品菌群的多樣性呈現(xiàn)高-低-高的趨勢，這可能與胃腸道不同部位的消化功能及高纖維飲食有關(guān)[13,15]。研究報道，動物腸道部位對菌群結(jié)構(gòu)和多樣性有較大影響[12,16]。本研究中，小熊貓胃和糞便樣品與其他腸段樣品分離開來。小熊貓胃的容量大，且胃上皮分泌功能較強，胃腺黏液細胞發(fā)達且胃壁肌層組織厚，這些都有利于小熊貓對竹子等高纖維飲食的消化和吸收[17]。因本研究中的小熊貓是成都動物園臨床死亡的動物，并未及時收集到其糞便樣品，而用同圈舍其他小熊貓糞便樣品替代分析菌群，且糞便樣品處于動物消化道的末端并暴露于環(huán)境中，因此其菌群結(jié)構(gòu)及組成與胃腸道的其他部位具有一定差異[18-19]。盡管如此，動物個體間及個體內(nèi)部的菌群結(jié)構(gòu)研究表明，同品種動物個體內(nèi)部菌群結(jié)構(gòu)差異大于個體間[20]，因此，同圈舍其他小熊貓的糞便樣品在一定程度能展現(xiàn)本研究中臨床死亡小熊貓的糞便菌群結(jié)構(gòu)信息。

PCR-DGGE圖譜條帶的克隆測序結(jié)果(表1)顯示，小熊貓胃腸道菌群主要來自厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門和疣微菌門，且優(yōu)勢菌群主要是來自厚壁菌門的糞腸球菌和食竇魏斯氏菌。其中，食竇魏斯氏菌可參與腸道中纖維性食物的消化和吸收[21]；糞腸球菌是哺乳動物腸道中主要的益生菌群，但其部分菌株仍具有致病性，這依賴于其菌株毒力島的檢測[22]。同樣，Williams等[6]利用16S焦磷酸測序研究大熊貓和小熊貓的糞便菌群，結(jié)果表明菌群主要來自厚壁菌門和變形菌門，且參與降解發(fā)酵纖維物質(zhì)產(chǎn)生丁酸的梭菌屬是小熊貓的主要優(yōu)勢菌群，其數(shù)量占75%；而Erysipelotrichaceae則是大熊貓的主要優(yōu)勢菌群，其數(shù)量占95%，這表明小熊貓和大熊貓利用不同的菌群進行纖維降解。而本研究中也僅在糞便中檢測到梭菌屬菌群，可能與小熊貓具有的無盲腸且結(jié)腸和直腸較短的大腸結(jié)構(gòu)特點有關(guān)[23]。同樣，Kong等[4]利用焦磷酸測序比較了野生和圈養(yǎng)小熊貓糞便菌群多樣性，發(fā)現(xiàn)野生小熊貓腸道菌群多樣性顯著高于圈養(yǎng)小熊貓，主要以厚壁菌門為主，且糞便中大部分細菌具有降解纖維的功能，其在小熊貓消化竹子過程中起到重要作用。盡管如此，小熊貓胃腸道與纖維降解相關(guān)的菌群信息仍處于未知狀態(tài)。本研究中，布勞特氏菌是小熊貓結(jié)腸中特有細菌，而結(jié)腸菌群在發(fā)酵飲食益生元生成短鏈脂肪酸及抗炎抗腫瘤中發(fā)揮重要作用[24]。而Akkermansia是小熊貓胃中特有細菌，該菌在改善肥胖和糖尿病方面具有重要作用[25]，因此該菌可能在小熊貓發(fā)酵纖維飲食方面具有重要作用，但該作用有待進一步進行深入的研究和證實。而條件致病菌大腸桿菌和約翰遜不動桿菌分別在小熊貓胃和回腸中檢測出，這2種菌在小熊貓健康狀態(tài)不佳的情況下可能會導致其胃腸道疾病的發(fā)生。對臨床感染犬瘟熱病毒(CDV)大熊貓糞便菌群的研究發(fā)現(xiàn)，其感染CDV后腸桿菌科菌群數(shù)量增加[11]。

本研究應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)首次直觀的展現(xiàn)了1只臨床死亡小熊貓胃腸道的菌群結(jié)構(gòu)及組成，但仍有大量未培養(yǎng)菌群，且其菌群功能及與宿主的關(guān)系仍需進一步深入的研究。盡管如此，本研究結(jié)果仍可為小熊貓的飼養(yǎng)管理及疾病預防提供基礎(chǔ)資料和現(xiàn)實指導。

4 結(jié) 論

① 小熊貓胃腸道中存在大量菌群且大部分與纖維消化相關(guān)，本研究分離鑒定的16株細菌主要來自厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門和疣微菌門，其中有8株細菌屬于厚壁菌門(占總分離鑒定菌的比例為50.00%)，是小熊貓胃腸道中的優(yōu)勢菌群，腸球菌有3株(占總分離鑒定菌的比例為18.75%)，是厚壁菌門中的優(yōu)勢菌群；與纖維消化相關(guān)的菌群有梭菌屬和食竇魏斯氏菌。

② 胃腸道不同部位菌群多樣性存在差異，按照胃腸道由前至后的順序，其多樣性呈現(xiàn)高-低-高的趨勢。

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*Contributed equally

**Corresponding authors: NI Xueqin, professor, E-mail: xueqinni@foxmail.com; ZENG Dong, professor, E-mail: zend@sicau.edu.cn

(責任編輯 菅景穎)

Bacteria Diversity in Gastrointestinal Tract of Ailurus fulgens Analyzed by Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Technology

LI Yang1DENG Jiabo2*NIU Lili2YU Jianqiu2ZENG Yan1LIU Qian1ZHOU Yi1XIONG Lyuchen1NI Xueqin1**ZENG Dong1**

(1. Institute of Animal Microecology College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; 2. Chengdu Zoo, Chengdu 610081, China)

This study aimed to evaluate the bacterial diversity in the gastrointestinal tract (GIT) ofAilurusfulgens. The polymerase chain reaction (PCR)-denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) technology combined with the cloning sequencing, cluster analysis and principal component analysis (PCA) of bands were used to detect the bacterial composition and diversity. The results showed as follows: 1) numerous bacteria were obtained from the GIT ofAilurusfulgensby using the PCR-DGGE profiles. There was a difference in each intestinal segment. However, there were some similarities between the adjacent intestinal segment. Samples from the colon and faeces had the higher bacterial diversity, the secondly for samples from stomach and rectum, and the samples from the jejunum and ileum had the lower bacterial diversity. 2) The sequencing results of PCR-DGGE profiles of bacteria from gastrointestinal tract ofAilurusfulgensshowed that most of the bacteria belonged to Firmicutes, Bacteroides, Proteobacteria and Verrucomicrobia. The common bands were mainly inclued uncultured Bacteroidetes bacterium,Enterococcusfaecalis, unculturedClostridiumsp.,LactococcuslactisandWeissellacibaria, and Firmicutes was the dominant bacterial. The specific bands wereComamonassp.,Clostridiumsp. andAkkermansia. In summary, a large amounts of bacteria exist in the GIT ofAilurusfulgens, and the diversity of bacteria shows a tendency of high-low-high according to the GIT from front to back.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(9)：3167-3174]

Ailurusfulgens; gastrointestinal tract bacteria; PCR-DGGE; diversity; cloning sequencing

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.09.019

2017-03-29

國家自然科學基金(31672318)；成都大熊貓繁育研究基金會項目

李 楊(1992—)，女，遼寧喀左人，碩士研究生，從事動物微生態(tài)研究。E-mail： liyang@ stu.sicau.edu.cn

：倪學勤，教授，博士生導師，E-mail: xueqinni@foxmail.com；曾 東，教授，博士生導師，E-mail:zend@sicau.edu.cn

S826

：A

：1006-267X(2017)09-3167-08

*同等貢獻作者

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