不同純度花生紅衣原花青素的制備工藝研究

白歡歡，劉睿杰，王珊珊，李 秋，金青哲，王興國(guó)

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122； 2.山東魯花集團(tuán)有限公司，山東 煙臺(tái) 265200)

綜合利用

不同純度花生紅衣原花青素的制備工藝研究

白歡歡1，劉睿杰1，王珊珊2，李 秋2，金青哲1，王興國(guó)1

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122； 2.山東魯花集團(tuán)有限公司，山東 煙臺(tái) 265200)

研究了AB-8大孔吸附樹(shù)脂分離純化得到不同純度花生紅衣原花青素的制備工藝，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了HPLC-MS分析鑒定。結(jié)果表明：最佳分離純化條件為上樣流速0.5 mL/min、洗脫流速1.0 mL/min、洗脫液20%和40%乙醇溶液，解吸后得到的原花青素純度分別為98.7%和86.2%；此外，不同的收集方式也可得到不同純度的原花青素；經(jīng)AB-8大孔吸附樹(shù)脂分離得到的純化物均為低聚體原花青素，20%乙醇純化物的主要成分為A型原花青素二聚體和A型原花青素三聚體，40%乙醇純化物的主要成分為A型原花青素二聚體和A型原花青素四聚體。

花生紅衣；原花青素；大孔吸附樹(shù)脂；純度；低聚體

花生紅衣作為花生生產(chǎn)過(guò)程中價(jià)值極低的副產(chǎn)物，除了用于動(dòng)物飼料外，大部分被當(dāng)作廢棄物而造成資源浪費(fèi)[1]。近些年研究發(fā)現(xiàn)，花生紅衣中富含多酚類物質(zhì)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)和利用價(jià)值[2]。花生紅衣中多酚類物質(zhì)含量為90～125 mg/g，包括白藜蘆醇、原花青素、酚酸等物質(zhì)[3-4]，其中原花青素占花生紅衣總質(zhì)量的17%，約有50%為生物活性較高的低聚體。原花青素具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可作為防癌、防治心血管疾病藥物的主要有效成分，可用作安全無(wú)毒的新型天然抗氧化劑[5-6]。目前，市場(chǎng)上原花青素產(chǎn)品大部分是葡萄籽來(lái)源的原花青素，葡萄籽中只含有B型原花青素，其聚合度較高，平均聚合度可達(dá)14.3。近年來(lái)研究較多的花生紅衣富含A型原花青素，聚合度較低，平均聚合度為3.2[7]。研究發(fā)現(xiàn)只有低聚體原花青素(聚合度≤3)可以完全被胃腸道吸收，A型與B型原花青素在人體內(nèi)發(fā)揮的作用不同[8]。鑒于花生紅衣與葡萄籽來(lái)源的原花青素不同，有待于開(kāi)發(fā)花生紅衣來(lái)源的原花青素產(chǎn)品。

不同純度的原花青素在食品、保健品、藥品以及化妝品等領(lǐng)域有一定的應(yīng)用[9]，市場(chǎng)對(duì)其純度的需求也不同。目前分離純化方法主要有溶劑萃取法、層析法、液相制備色譜等，但大孔樹(shù)脂法應(yīng)用最為廣泛，其設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、便于工業(yè)化生產(chǎn)[10]。本文采用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)花生紅衣原花青素進(jìn)行分離純化，并用HPLC-MS對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

花生紅衣，山東魯花集團(tuán)有限公司提供；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品：天津尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)公司提供，純度98.5%；大孔吸附樹(shù)脂(AB-8、D101、HPD750、NKA-9)，天津浩聚樹(shù)脂科技有限公司。無(wú)水乙醇、甲醇、鹽酸、甲酸、香草醛，均為分析純；甲醇、乙腈，均為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BS-100A型自動(dòng)部分收集器，DHL-A電腦數(shù)顯型恒流泵，SHZ-3循環(huán)水多用真空泵，KH7200DB型數(shù)控超聲波清洗器，SHZ-8氣浴恒溫振蕩器，VDRTEX-5旋渦混合器，R-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，小型高速粉碎機(jī)，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，α-1500型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花生紅衣原花青素的提取

用小型高速粉碎機(jī)將花生紅衣粉碎至過(guò)40目篩，每千克花生紅衣采用10 L石油醚去除脂類物質(zhì)，于30℃恒溫水浴鍋中脫脂5 h，抽濾，濾渣置于通風(fēng)櫥中去除石油醚，保存在干燥器中備用。每千克脫脂花生紅衣采用10 L體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液提取，在超聲功率120 W、超聲溫度35℃的條件下，超聲提取10 min，相同條件下提取3次。合并過(guò)濾得到的濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到花生紅衣原花青素粗提物[11]。

1.2.2 大孔吸附樹(shù)脂純化花生紅衣原花青素

1.2.2.1 大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理

大孔吸附樹(shù)脂常含有一些單體、分散劑和致孔劑等，使用時(shí)需要除去這些有毒的有機(jī)殘留物，所以必須經(jīng)過(guò)預(yù)處理。預(yù)處理方法：無(wú)水乙醇浸泡24 h→用無(wú)水乙醇洗至流出液與水1∶5不渾濁→用去離子水洗至無(wú)醇味→5%HCl溶液浸泡2～4 h→用去離子水洗至流出液為中性→2%NaOH溶液浸泡2～4 h→去離子水洗至流出液為中性，備用。

1.2.2.2 大孔吸附樹(shù)脂的靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)

將經(jīng)預(yù)處理后的大孔吸附樹(shù)脂抽濾并吸干其表面水分，準(zhǔn)確稱取4種預(yù)處理后的樹(shù)脂1 g分別置于25 mL具塞錐形瓶中，各加入10 mL(質(zhì)量濃度為5.02 mg/mL)花生紅衣原花青素粗提液，搖勻，放入氣浴恒溫振蕩器中，振蕩速率為120 r/min，溫度為30℃。在0.5、1、2、3、4、5、6、12、18、24 h時(shí)吸取上清液，測(cè)定上清液中原花青素的含量，并以吸附量對(duì)時(shí)間作圖，得到各樹(shù)脂的吸附動(dòng)力學(xué)曲線。過(guò)濾吸附飽和的樹(shù)脂，分別加入20 mL 95%乙醇，在氣浴恒溫振蕩器中振蕩24 h，過(guò)濾解吸液，測(cè)定其中原花青素含量。按下式計(jì)算吸附率、吸附量和解吸率。

(1)

(2)

(3)

式中：C0為花生紅衣原花青素粗提液質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為經(jīng)樹(shù)脂吸附后上清液中原花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；C2為原花青素解吸液質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為經(jīng)樹(shù)脂吸附后上清液體積，mL；V2為原花青素解吸液體積，mL；m為干樹(shù)脂質(zhì)量，g。

1.2.2.3 大孔樹(shù)脂AB-8純化花生紅衣原花青素

稱取已處理的AB-8大孔吸附樹(shù)脂裝填入層析柱，將一定質(zhì)量濃度的花生紅衣原花青素粗提液(以澄清為好)上柱，柱溫為室溫；洗脫時(shí)首先用4BV蒸餾水洗去相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)；然后用4BV不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液將吸附在樹(shù)脂上的原花青素梯度洗脫下來(lái)，分批收集流出液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到原花青素純化物。接下式計(jì)算產(chǎn)物原花青素的純度和回收率。

純度=純化物中原花青素質(zhì)量/純化物質(zhì)量×100%

(4)

回收率=洗脫液體積×洗脫液中原花青素質(zhì)量濃度/(上樣液體積×上樣液中原花青素質(zhì)量濃度)×100%

(5)

1.2.3 原花青素的測(cè)定[11]

1.2.3.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取0.050 0g原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇溶解并定容至25mL，得到2.0mg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液(現(xiàn)配)。分別精確量取0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0mL原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度線，此時(shí)得到質(zhì)量濃度分別為0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mg/mL的工作溶液。再各取1mL工作溶液于10mL試管中，分別加入6mL0.04g/mL香草醛甲醇溶液，3mL濃鹽酸，搖勻，在(30±1)℃下恒溫水浴保持20min，取出，在500nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y=1.330 6X+0.066 4，R2=0.996 6。

1.2.3.2 花生紅衣原花青素的測(cè)定

取1mL稀釋了一定倍數(shù)的花生紅衣原花青素粗提液，分別加入6mL0.04g/mL香草醛甲醇溶液，3mL濃鹽酸，搖勻，在(30±1)℃下恒溫水浴保持20min，取出，在500nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程可計(jì)算樣品中原花青素的質(zhì)量濃度。

1.2.4HPLC-MS測(cè)定花生紅衣原花青素

將洗脫級(jí)分10mg分別溶于10mL色譜純甲醇中，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC-MS分析。

色譜條件：色譜柱為CSH柱(2.1mm×100mm，粒徑 1.9μm)；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液；柱溫45℃；進(jìn)樣量1μL；流動(dòng)相洗脫條件為0～0.1min，5%A；0.1～30min，5%～20%A；30～32min，20%～80%A；32～32.5min，80%～5%A；32.5～35min，5%A。

質(zhì)譜條件：ESI電離源，負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓3.0kV，錐孔電壓40.0V；離子源溫度100℃，脫溶劑溫度400℃；錐孔氣流速50.0L/h，脫溶劑氣流速700.0L/h；碰撞電壓6V；相對(duì)分子質(zhì)量掃描范圍(m/z)50～2 000。

2 結(jié)果與討論

2.1 4種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)花生紅衣原花青素的靜態(tài)吸附率和解吸率

大孔吸附樹(shù)脂是吸附性和分子篩原理相結(jié)合的分離介質(zhì)，其吸附力與吸附樹(shù)脂和吸附質(zhì)之間的范德華力和氫鍵作用有關(guān)。本試驗(yàn)所用大孔吸附樹(shù)脂包括極性樹(shù)脂(NKA-9)、中極性樹(shù)脂(HPD750)、弱極性樹(shù)脂(AB-8)和非極性樹(shù)脂(D101)，這4種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)花生紅衣原花青素的吸附與解吸性能如表1所示，靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線如圖1所示。

表1 4種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)花生紅衣原花青素的吸附與解吸性能比較

圖14種大孔吸附樹(shù)脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

由表1可知，NKA-9和AB-8大孔吸附樹(shù)脂對(duì)原花青素均有較大的吸附率，D101大孔吸附樹(shù)脂的吸附率低于其他大孔吸附樹(shù)脂。原花青素分子中含有多個(gè)酚羥基，可形成氫鍵，具有一定的親水性和極性，容易被極性、中極性和弱極性樹(shù)脂吸附。除此之外，大孔吸附樹(shù)脂的吸附能力還與其孔隙結(jié)構(gòu)、比表面積等有關(guān)。HPD750比表面積大，孔徑小，不利于原花青素分子通過(guò)樹(shù)脂的孔徑擴(kuò)散到其內(nèi)表面而被吸附。NKA-9表面極性大，對(duì)原花青素分子產(chǎn)生強(qiáng)烈吸附，會(huì)阻礙原花青素的解吸。大孔吸附樹(shù)脂的靜態(tài)動(dòng)力學(xué)曲線一般可以分為兩種類型：第1種是快速平衡型，其特征是在吸附的起始階段吸附量迅速增加，很快達(dá)到吸附平衡；第2種是慢速平衡型，起始階段吸附量較小，吸附量的上升速度緩慢，吸附平衡時(shí)間較長(zhǎng)。由圖1可以看出，AB-8、NKA-9、D101樹(shù)脂對(duì)原花青素的吸附屬于快速平衡型，而HPD750則屬于慢速平衡型。因此，綜合考慮樹(shù)脂吸附量、解吸率以及靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特征發(fā)現(xiàn)，AB-8大孔樹(shù)脂吸附量大、解吸容易并可以較快達(dá)到吸附平衡，故選用AB-8大孔吸附樹(shù)脂作為分離純化花生紅衣原花青素的吸附材料。

2.2 上樣流速對(duì)AB-8大孔吸附樹(shù)脂吸附原花青素的影響

上樣流速小，樣液中溶質(zhì)與樹(shù)脂接觸時(shí)間長(zhǎng)，其吸附較為完全；流速過(guò)大，溶質(zhì)分子來(lái)不及擴(kuò)散到樹(shù)脂的內(nèi)表面進(jìn)行吸附，導(dǎo)致吸附不充分，且浪費(fèi)了樣品[12]。因此，本試驗(yàn)研究上樣流速對(duì)AB-8大孔吸附樹(shù)脂吸附原花青素的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 上樣流速對(duì)AB-8大孔吸附樹(shù)脂吸附原花青素的影響

由圖2可以看出，上樣流速為0.25 mL/min和0.5 mL/min時(shí)，大孔樹(shù)脂對(duì)原花青素的吸附率比較高，泄漏時(shí)間分別出現(xiàn)在250 min和180 min。當(dāng)上樣流速為0.75 mL/min和1.0 mL/min時(shí)，泄漏時(shí)間出現(xiàn)較早，吸附過(guò)程不完全?？紤]到實(shí)際的生產(chǎn)情況，選取0.5 mL/min上樣流速較為合適。

2.3 洗脫流速對(duì)原花青素洗脫效果的影響

為了使洗脫液與AB-8大孔吸附樹(shù)脂所吸附的溶質(zhì)有充分的接觸時(shí)間，進(jìn)行有效地解吸，必須使洗脫液以合適的流速進(jìn)行洗脫，因此考察了洗脫流速對(duì)原花青素洗脫效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 洗脫流速對(duì)AB-8大孔吸附樹(shù)脂解吸原花青素的影響

由圖3可以看出，洗脫流速為0.5 mL/min和1.0 mL/min時(shí)，洗脫效果相差不大，而當(dāng)洗脫流速達(dá)到2.0 mL/min以上時(shí)，洗脫效果明顯變差，原花青素純度也呈下降趨勢(shì)。因此，選擇洗脫流速為1.0 mL/min，此時(shí)原花青素的解吸率為89.31%，純度為98.7%。

2.4 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)原花青素的洗脫效果

大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行分離純化時(shí)常用的洗脫劑為乙醇溶液，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液的極性不同，其對(duì)原花青素的洗脫能力也有所差異，因此本試驗(yàn)研究了不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液對(duì)原花青素的洗脫效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花生紅衣原花青素的洗脫曲線有很大的影響，其中40%乙醇溶液的洗脫曲線峰值最高，在0.8～2.5 BV范圍內(nèi)收集到的原花青素質(zhì)量濃度相對(duì)較高。20%乙醇溶液對(duì)原花青素的洗脫效果較好，洗脫曲線有明顯的峰值，稍有拖尾現(xiàn)象。10%和95%乙醇溶液對(duì)原花青素洗脫能力差，洗脫曲線無(wú)明顯峰值。因此，可以通過(guò)收集不同范圍內(nèi)的洗脫液來(lái)制備不同純度的原花青素。

圖4 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)原花青素的洗脫效果

2.5 洗脫方式或收集方式對(duì)原花青素解吸效果的影響

原花青素是由不同聚合度的兒茶素或表兒茶素組成的混合物，含有大量的酚羥基，樹(shù)脂吸附過(guò)程中極有可能發(fā)生氫鍵吸附，則不同聚合度的原花青素被吸附和解吸的過(guò)程和速度必然存在差異。因此，梯度洗脫極有可能獲得聚合度不同或純度不同的原花青素。表2列出不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫收集到4種原花青素的解吸效果。

表2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫的原花青素解吸效果

由表2可以看出，采用20%乙醇溶液進(jìn)行洗脫得到的原花青素的純度最高，采用40%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，原花青素的回收率最大。因此，選擇20%和40%乙醇作為制備原花青素的洗脫劑。

另將20%和40%乙醇的洗脫液分別收集，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 20%與40%乙醇洗脫的原花青素解吸效果

由表3可以看出，20%乙醇洗脫解吸得到的干重從多到少，純度從低到高再到低，在約2～3.5 BV收集到的洗脫液中原花青素純度最高，占總干重的23.4%；40%乙醇洗脫解吸得到的干重從多到少，純度從高到低，在約0～2 BV收集到的洗脫液中原花青素純度最高，占總干重的84.2%。

在工業(yè)生產(chǎn)中可根據(jù)產(chǎn)品要求選擇不同的洗脫方式或收集方式。當(dāng)用20%乙醇進(jìn)行洗脫時(shí)，收集2～3.5 BV洗脫液可得到純度大于98%的原花青素，收集0～4 BV洗脫液時(shí)可得到純度大于95%的原花青素；當(dāng)用40%乙醇洗脫時(shí)，收集0～2 BV洗脫液可得到純度85%～90%的原花青素，收集0～4 BV洗脫液可得到純度約為80%的原花青素。

2.6 HPLC-MS對(duì)花生紅衣原花青素純化物的分析結(jié)果

圖5和圖6分別是20%乙醇和40%乙醇洗脫液的總離子色譜圖，表4為兩種花生紅衣原花青素純化物的HPLC-MS分析[13]。由圖5、圖6、表4可以看出，經(jīng)AB-8大孔吸附樹(shù)脂分離得到的純化物均為低聚體原花青素，20%乙醇純化物的主要成分為A型原花青素二聚體和A型原花青素三聚體，40%乙醇純化物的主要成分為A型原花青素二聚體和A型原花青素四聚體。研究發(fā)現(xiàn)只有低相對(duì)分子質(zhì)量低聚體(聚合度≤3)可以完全被胃腸道吸收。因此，試驗(yàn)所制備的花生紅衣原花青素因其相對(duì)分子質(zhì)量小，易于被人體吸收，在人體內(nèi)可充分發(fā)揮其生理功能。

圖5 20%乙醇洗脫液的總離子色譜圖

圖6 40%乙醇洗脫液的總離子色譜圖

表4 對(duì)花生紅衣原花青素純化物的HPLC-MS分析

注：表中字母縮寫(xiě)為 (E)C代表(表)兒茶素；A代表A型鍵C4→C8，C2→0→C7；B代表B型鍵C4→C8。

3 結(jié) 論

研究了AB-8大孔吸附樹(shù)脂分離純化得到不同純度花生紅衣原花青素的制備工藝。最佳分離純化條件為：上樣流速0.5 mL/min，洗脫流速1.0 mL/min，洗脫液20%和40%乙醇溶液。解吸后得到20%乙醇純化物和40%乙醇純化物，20%乙醇純化物純度最高，可達(dá)98.7%，回收率較低，為29.41%，40%乙醇純化物純度為86.2%，回收率較高，為50.31%。通過(guò)不同的收集方式可得到不同純度的原花青素，因此在工業(yè)生產(chǎn)中可根據(jù)產(chǎn)品要求選擇不同的洗脫方式或收集方式。

由HPLC-MS分析可知，經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂分離得到的純化物均為低聚體原花青素，20%乙醇純化物的主要成分為A型原花青素二聚體和A型原花青素三聚體，40%乙醇純化物的主要成分為A型原花青素二聚體和A型原花青素四聚體。

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Preparationofprocyanidinsofdifferentpuritiesfrompeanutskins

BAI Huanhuan1, LIU Ruijie1, WANG Shanshan2, LI Qiu2, JIN Qingzhe1, WANG Xingguo1

(1.School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China; 2.Shandong Luhua Group Co., Ltd., Yantai 265200, Shandong, China)

The preparation process of procyanidins of different purities from peanut skins with AB-8 macroporous adsorption resin was studied and the product was analyzed by HPLC-MS. The results showed that the optimal separation and purification conditions were obtained as follows: flow rate of sample 0.5 mL/min, eluention flow rate 1.0 mL/min, 20% and 40% ethanol solution as eluent. Under these conditions, the procyanidins purities after desorption were 98.7% and 86.2% respectively. In addition, procyanidins of different purities were obtained by different collection methods. Purified products separated by AB-8 macroporous adsorption resin were oligomeric procyanidins. The main purified products of 20% ethanol were A-type dimers of procyanidins and A-type trimers of procyanidins, and the main purified products of 40% ethanol were A-type dimers of procyanidins and A-type tetramers of procyanidins.

peanut skin; procyanidins; macroporous adsorption resin; purity; oligomer

2016-10-18；

：2017-03-24

“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0401403)；江蘇省第五期“333工程”培養(yǎng)資金資助項(xiàng)目(BRA2016347)；煙臺(tái)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015NC044)

白歡歡(1992)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橛椭c植物蛋白(E-mail)bhh0210@163.com。

金青哲，教授，博士生導(dǎo)師(E-mail)jqzwuxi@163.com。

TS205；R284

：A

：1003-7969(2017)07-0074-06