新輔助化療對(duì)胃癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及核基質(zhì)結(jié)合區(qū)結(jié)合蛋白質(zhì)1表達(dá)的影響

朱旭升， 吳曉宇

論 著

新輔助化療對(duì)胃癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及核基質(zhì)結(jié)合區(qū)結(jié)合蛋白質(zhì)1表達(dá)的影響

朱旭升， 吳曉宇

目的探討新輔助化療對(duì)胃癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響與對(duì)胃癌組織中核基質(zhì)結(jié)合區(qū)結(jié)合蛋白質(zhì)1(Special AT rich sequence binding protein 1，SATB1)表達(dá)的關(guān)系。方法對(duì)2013年12月至2015年12月江蘇省中醫(yī)院消化系腫瘤外科60例進(jìn)展期胃癌患者術(shù)后癌組織進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察，60例中40例行新輔助化療，其中20例用介入途徑(介入組)，20例用靜脈途徑(靜脈組)，另20例直接行手術(shù)治療為對(duì)照組。同時(shí)檢測(cè)新輔助化療前、后胃癌組織及癌旁組織SATB1的免疫組化表達(dá)。結(jié)果對(duì)化療敏感的病例癌細(xì)胞的細(xì)胞器嚴(yán)重?fù)p傷，包括核固縮、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹；對(duì)化療不敏感的病例癌細(xì)胞的細(xì)胞器未受破壞或僅輕度損傷，其中介入組細(xì)胞損傷程度高于靜脈組(P=0.047)。在癌細(xì)胞損傷明顯的病例中，SATB1的表達(dá)更加明顯(P=0.035)。結(jié)論介入法新輔助化療對(duì)胃癌細(xì)胞的損傷作用更大。SATB1的表達(dá)與胃癌細(xì)胞損傷程度相關(guān)，可作為評(píng)估新輔助化療療效新的標(biāo)志物。

胃腫瘤； 顯微鏡檢查，電子，透射； 核基質(zhì)附著區(qū)結(jié)合蛋白質(zhì)1； 新輔助化療

胃癌患者在就診時(shí)多數(shù)已為進(jìn)展期，Ⅲ、Ⅳ期占50%～60%。研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)展期胃癌獲得根治性切除的比例少，術(shù)后局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高，5年生存率低[1]。近年來，國內(nèi)外臨床研究表明，新輔助化療可以降低腫瘤的分期，提高胃癌患者的根治性切除率，減少術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，提高生存率[2-4]。本文從超微結(jié)構(gòu)及核基質(zhì)結(jié)合區(qū)結(jié)合蛋白質(zhì)1(special AT-rich sequence binding protein 1,SATB1)的表達(dá)，來闡述新輔助化療對(duì)胃癌細(xì)胞的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

對(duì)江蘇省中醫(yī)院消化系腫瘤外科2013年12月至2015年12月收治的60例行胃癌根治術(shù)的患者進(jìn)行分組觀察。其中男33例，女27例；年齡25～75歲，平均年齡57歲；均經(jīng)胃鏡明確診斷為胃腺癌；通過全腹CT、MRI或超聲內(nèi)鏡對(duì)腫瘤分期，cTNMⅡ期23例、Ⅲ期37例；KPS評(píng)分>60分，凝血、肝、腎功能等基本正常。40例術(shù)前行新輔助化療，其中20例采用介入法給藥(介入組)，20例采用靜脈法給藥(靜脈組)，另20例直接手術(shù)為對(duì)照組。3組年齡、性別、cTNM分期、病理類型等比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)(表1)。

表1 介入組、靜脈組和對(duì)照組患者一般資料比較

病理學(xué)類型：1為高分化腺癌，2為中分化腺癌，3為低分化腺癌，4為印戒細(xì)胞癌

1.2 化療方法及方案

介入組采用Seldinger法。經(jīng)一側(cè)股動(dòng)脈插管，導(dǎo)管插入腹腔動(dòng)脈起始部，注入造影劑，根據(jù)腫瘤顯影情況判斷血供來源，選擇插管部位。若腫瘤顯影不明顯，則根據(jù)腫瘤所在部位，超選擇插管：腫瘤位于賁門和胃體部者選擇胃左動(dòng)脈或腹腔動(dòng)脈插管；腫瘤位于胃竇部者，選擇性插入肝總動(dòng)脈或胃十二指腸動(dòng)脈。靜脈組選擇周圍靜脈滴注化療。

化療方案均為順鉑60 mg/m2，紫杉醇135 mg/m2。持續(xù)滴注2 h。兩組病例均化療1次，術(shù)前常規(guī)預(yù)防性使用地塞米松，化療當(dāng)天給予水化和利尿措施以減少毒性反應(yīng)?；熀蟮?天復(fù)查血常規(guī)、肝功能，第7～14天進(jìn)行手術(shù)。

1.3 觀察項(xiàng)目

1.3.1 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化 用電鏡觀察術(shù)后病理切片中癌細(xì)胞與癌旁正常胃黏膜細(xì)胞的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核、核膜、核仁等超微結(jié)構(gòu)的損傷程度。根據(jù)細(xì)胞器上述受損項(xiàng)評(píng)價(jià)，0～1項(xiàng)為無損傷，2～3項(xiàng)為輕度損傷，4～5項(xiàng)為中度損傷，>5項(xiàng)變化為重度損傷。

1.3.2 SATB1的表達(dá) 取胃癌及癌旁組織蠟塊，行鏈霉親和素-過氧化物酶法(streptavidin-perosidase，SP)檢測(cè)SATB1表達(dá)情況，按免疫反應(yīng)評(píng)分(immunoreactivity score，IRS)評(píng)估，IRS=染色程度×陽性細(xì)胞百分率。染色程度評(píng)分：細(xì)胞核無染色、弱染色、中等染色、強(qiáng)染色分別計(jì)為0分、1分、2分、3分。染色細(xì)胞百分率評(píng)分：1個(gè)視野內(nèi)著色細(xì)胞1%～10%計(jì)1分；11%～50%計(jì)2分；51%～75%計(jì)3分；>75%計(jì)4分；陰性計(jì)0分。IRS值滿3分為弱陽性；4分為陽性；≥5分為強(qiáng)陽性。取陽性及強(qiáng)陽性作為比較值，陰性及弱陽性不作參考。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞與正常胃黏膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的差異

胃癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(圖1)相比正常胃黏膜細(xì)胞(圖2)，細(xì)胞形狀不規(guī)則；細(xì)胞膜可見微絨毛，核體積增大，核膜內(nèi)陷增多，核仁增大，核內(nèi)可見核內(nèi)小體及假性包含物；細(xì)胞質(zhì)相對(duì)減少，線粒體數(shù)量較多且形態(tài)不規(guī)則，游離核糖體增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器減少。

圖1 胃癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(2 μm)圖2 正常胃黏膜細(xì)胞

2.2 新輔助化療對(duì)胃癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

在化療組患者術(shù)后病理標(biāo)本中可見：對(duì)化療反應(yīng)好者可見癌細(xì)胞大量壞死、崩解，大量細(xì)胞碎片，溶酶體增多，單核細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞增生，出現(xiàn)纖維化反應(yīng)；對(duì)化療反應(yīng)較好者可見細(xì)胞碎片，有些細(xì)胞的核仁出現(xiàn)固縮、分裂，核內(nèi)出現(xiàn)空泡，線粒體破壞明顯，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，但仍有未壞死癌細(xì)胞；對(duì)化療反應(yīng)差者可見癌細(xì)胞細(xì)胞器基本無損傷，或僅見細(xì)胞核固縮及核膜皺縮，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度腫脹，線粒體腫脹，嵴減少(圖3～圖4)。

圖3 介入組胃癌細(xì)胞線粒體腫脹，異染色質(zhì)比例降低，個(gè)別線粒體呈空泡狀，核膜破壞，核固縮且出現(xiàn)分裂，核仁固縮(A，2 μm)；單核細(xì)胞浸潤及纖維化反應(yīng)(B，5 μm) ×1000

圖4 靜脈組胃癌細(xì)胞腫脹，但細(xì)胞核改變較少，核仁較大(A，1 μm；B，2 μm)

2.3 新輔助化療不同方式對(duì)胃癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)影響

通過電鏡下觀察統(tǒng)計(jì)各組術(shù)后標(biāo)本發(fā)生胃癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化的例數(shù)及占比(表2)，結(jié)果可見，介入組對(duì)胃癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響明顯大于靜脈組(P<0.05)。

表2 術(shù)后3組胃癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變病例數(shù)(%)比較

注：表中χ2值與P值是介入組與靜脈組比較，未比較手術(shù)組

2.4 新輔助化療不同方式對(duì)胃癌細(xì)胞損傷程度比較

通過電鏡下觀察介入組與靜脈組術(shù)后標(biāo)本胃癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)受損項(xiàng)評(píng)分例數(shù)的統(tǒng)計(jì)(表3)，結(jié)果可見介入組導(dǎo)致癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷程度(5項(xiàng)以上者)高于靜脈組(χ2=7.943，P=0.047)。

表3 不同化療方式對(duì)胃癌細(xì)胞損傷程度的比較

2.5 胃癌細(xì)胞細(xì)胞器損傷與SATB1表達(dá)的關(guān)聯(lián)性

免疫組化結(jié)果顯示(圖5)，60例胃癌患者術(shù)前的癌組織中SATB1表達(dá)結(jié)果顯示陰性，而術(shù)后結(jié)果顯示弱陽性9例，陽性18例，強(qiáng)陽性33例。在癌旁組織SATB1表達(dá)結(jié)果顯示陰性。在胃癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變明顯的病例中，SATB1的表達(dá)水平高，出現(xiàn)強(qiáng)陽性的概率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.035)，見表4及圖6～圖7。

表4 SATB1與胃癌細(xì)胞細(xì)胞器損傷[例(%)]

3 討論

目前，進(jìn)展期胃癌術(shù)后5年生存率僅為30%～50%[5]。因此，尋求有效治療方法、提高手術(shù)切除率及降低術(shù)后復(fù)發(fā)率至關(guān)重要。術(shù)前化療即新輔助化療的臨床應(yīng)用近年來發(fā)展迅速，其能夠控制原發(fā)病灶，降低臨床分期，利于手術(shù)治療。

圖5 免疫組化SATB1表達(dá)(SP法 ×200)A：弱陽性表達(dá)；B：陽性表達(dá)；C：強(qiáng)陽性表達(dá)；D：陰性表達(dá)

目前電鏡的研究主要應(yīng)用于觀察腸黏膜形態(tài)及腎臟、血腦屏障及細(xì)胞株的超微結(jié)構(gòu)變化，對(duì)胃癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的研究和報(bào)道甚少，同時(shí)缺少相應(yīng)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。本研究用超微結(jié)構(gòu)對(duì)比觀察不同化療方式對(duì)胃癌細(xì)胞的損傷程度及療效，結(jié)果顯示，癌細(xì)胞大量壞死、崩解，大量細(xì)胞碎片，溶酶體增多，單核細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞增生，出現(xiàn)纖維化反應(yīng)；對(duì)化療反應(yīng)較好者可見細(xì)胞碎片，有些細(xì)胞的核仁出現(xiàn)固縮、分裂，核內(nèi)出現(xiàn)空泡，線粒體破壞明顯，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹。同時(shí)，不同化療方式對(duì)胃癌細(xì)胞在超微結(jié)構(gòu)下顯示的的細(xì)胞結(jié)構(gòu)損壞程度有不同，介入組在細(xì)胞器的損傷程度上明顯重于靜脈組(P<0.01)。

本研究中發(fā)現(xiàn)，存在化療耐受的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，化療反應(yīng)差者可見癌細(xì)胞器基本無損傷，或僅見細(xì)胞核固縮及核膜皺縮，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度腫脹，線粒體腫脹，嵴減少。這類病例對(duì)化療的敏感性較差，往往會(huì)增加不良反應(yīng)發(fā)生率，影響整體治療效果。以下問題值得研究：①是否存在化療敏感性的預(yù)測(cè)方法？②是否能在減少化療劑量的同時(shí)不降低臨床療效？我們認(rèn)為，預(yù)測(cè)敏感性更為重要，可以判斷胃癌對(duì)于化療是否敏感，選擇合理的治療方法，避免過度治療。

SATB1是一種核基質(zhì)結(jié)合區(qū)組織特異性表達(dá)的結(jié)合蛋白[6]，通過與位于BCL-2基因3'端非翻譯區(qū)主要斷裂區(qū)結(jié)合，調(diào)節(jié)BCL-2基因的轉(zhuǎn)錄活性發(fā)揮作用[7]。Han等[8]研究發(fā)現(xiàn)，SATB1可限定多個(gè)基因組的位點(diǎn)和補(bǔ)充染色質(zhì)修飾酶來調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)，對(duì)乳腺癌的生長轉(zhuǎn)移起到重要作用。SATB1基因在結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中過表達(dá)，并能調(diào)節(jié)多個(gè)腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)移[9-11]。正常胃黏膜組織中STAB1的表達(dá)陽性率明顯低于胃癌組織，SATB1的表達(dá)與腫瘤的侵犯深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度相關(guān)[12-13]，SATB1的上調(diào)表達(dá)可能促進(jìn)胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，新輔助化療后，超微結(jié)構(gòu)改變明顯的胃癌細(xì)胞中，SATB1的表達(dá)水平高于超微結(jié)構(gòu)改變不明顯的，出現(xiàn)強(qiáng)陽性的概率更高，表明SATB1的表達(dá)與胃癌細(xì)胞損傷程度有關(guān)，但具體原因尚待進(jìn)一步研究。

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AdvancedgastriccancercellultrastructurechangeafterneoadjuvantchemotherapyandcanceroustissueSATB1expression

ZHUXusheng1,WUXiaoyu2.

(1.DepartmentofGeneralSurgery,NanjingGaochunHospitalofTCM,Nanjing211300,China; 2.DepartmentofDigestiveTumorSurgery,JiangsuProvinceHospitalofTCM,Nanjing210029,China)

ZHUXusheng,Email：2758966243@qq.com

ObjectivePhase by observing the progress of the changes of the ultrastructure of gastric cancer cells after neoadjuvant chemotherapy and carcinoma tissue SATB1 expression, and to explore new adjuvant chemotherapy for gastric cancer cell damage mechanism, and the relationship between the ultrastructural changes and SATB1.MethodsFrom December 2013 and December 2015, 60 patients with advanced gastric cancer were enrolled in Department of Digestive Tumor Surgery; Jiangsu Province Hospital of TCM, including 20 cases who accepted interventional chemotherapy and intravenous chemotherapy to the 20 cases, direct surgical treatment as control group 20 cases. SATB1 immunohistochemical expression of gastric cancer tissues and tissues adjacent to carcinoma were detected before and after the new adjuvant chemotherapy.ResultsIn cases where chemotherapy was sensitive, the organelles of cancer cells were severely damaged, including pyknosis, mitochondria, and endoplasmic reticulum swelling. In cases where chemotherapy was not sensitive, the organelles of cancer cells were not destroyed or only mildly damaged. The injury degree of the interventional group was higher than that of the intravenous group (P=0.047). The expression of SATB1 was more significant in the cases with obvious cancer damage (P=0.035).ConclusionsInterventional neoadjuvant chemotherapy has more damage to gastric cancer cells. SATB1 expression is related to tumor infiltrating degree, and SATB1 can be used as a new marker to evaluate the efficacy of neoadjuvant chemotherapy.

Stomach neoplasms; Cells; Microscopy, electron, transmission; Matrix attachment region binding proteins 1; Neoadjuvant chemotherapy

211300 江蘇 南京， 南京市高淳中醫(yī)院 普外科(朱旭升)； 210029 江蘇 南京，江蘇省中醫(yī)院 消化系腫瘤外科(吳曉宇)

朱旭升，Email：2758966243@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2017.04.009

1674-4136(2017)04-0239-04

2017-01-18][本文編輯：欽嫣]