兔出血癥病毒研究進(jìn)展

鄒秋萍

（安陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南安陽(yáng)455000）

兔出血癥病毒研究進(jìn)展

鄒秋萍

（安陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南安陽(yáng)455000）

兔出血癥病毒（RHDV），為嵌杯病毒科兔病毒屬成員，能引起3月齡以上青年或成年兔的兔出血癥（RHD）。RHD是兔的一種急性、烈性、高度傳染性和高度死亡性疾病，曾給世界養(yǎng)兔業(yè)帶來(lái)了非常嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。1984年2月，該病在中國(guó)無(wú)錫首次暴發(fā)，并迅速傳播至全國(guó)各地，其典型的病理變化是呼吸系統(tǒng)出血、肝壞死、出血，實(shí)質(zhì)器官水腫、出血、淤血。鑒于RHD的嚴(yán)重危害性，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將RHD正式列為“國(guó)際動(dòng)物保健編目”B類傳染病，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也將其列為動(dòng)物二類疾病。RHDV病毒粒子呈球形，二十面體對(duì)稱，無(wú)囊膜，病毒粒子由180個(gè)相同的蛋白分子（VP60，58～60 kDaa）包裹。研究表明，作為RHDV的主要衣殼蛋白，VP60是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的重要成分，在RHDV診斷和疫苗制備中有著重要的作用。為梳理國(guó)內(nèi)外近期在RHDV研究的主要進(jìn)展，該文就VP60誘導(dǎo)抗體制備，抗原表位鑒定及RHDV變異進(jìn)化方面進(jìn)行了概述。

1 vp60基因及VP60蛋白的結(jié)構(gòu)和功能

RHDV病毒基因組為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)7 437 nt，基因組5’端沒(méi)有帽狀結(jié)構(gòu)而是以共價(jià)結(jié)合的方式與感染性相關(guān)的VPg蛋白（viral protein genome-linked）相連，3’端具有一個(gè)短的Poly（A）尾。電鏡下，RHDV病毒粒子呈球形，無(wú)囊膜，直徑約為35～40 nm，二十面體對(duì)稱，表面有32個(gè)高5～6 nm的圓柱狀殼粒，具有嵌杯樣病毒典型的杯狀結(jié)構(gòu)，此外電鏡下還可見(jiàn)少數(shù)無(wú)核酸的病毒空衣殼。病毒粒子的衣殼厚4～6 nm，主要由分子量為60 kDa的結(jié)構(gòu)蛋VP60聚合而成。三維結(jié)構(gòu)分析表明，RHDV衣殼除具有杯狀病毒典型的結(jié)構(gòu)特征外，還有其獨(dú)特結(jié)構(gòu)，五鄰體和六鄰體殼粒之間由一條窄的蛋白密度帶連接，這在其他杯狀病毒中還未曾發(fā)現(xiàn)。病毒基因組含有兩個(gè)重疊的開(kāi)放閱讀框（ORF）：ORF1、ORF2：ORF1編碼一個(gè)分子量約257 kDa的多聚蛋白前體，經(jīng)酶解加工后形成7種非結(jié)構(gòu)蛋白A（包括聚合酶、螺旋酶、6T和蛋白酶等）和主要結(jié)構(gòu)蛋白VP60；ORF2編碼小結(jié)構(gòu)蛋白VP10。RHDV VP60的氨基酸序列與其他嵌杯病毒相同，分為A（1-21）、B（22-300）、C（329-343）、E（344-434）和F（435-579）等六個(gè)區(qū)域。VP60由三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：NTA（N-terminal arm）、S結(jié)構(gòu)域（S domian）、P結(jié)構(gòu)域（P domain），P結(jié)構(gòu)域又可以進(jìn)一步分為P1亞結(jié)構(gòu)域（P1 sub-domian）和P2亞結(jié)構(gòu)域（P1sub-domian）。S結(jié)構(gòu)域包埋在衣殼內(nèi)部由VP60的N端（66～230 aa）組成，保護(hù)病毒的基因組，含有抗原表位，具有一定的免疫原性。P結(jié)構(gòu)域由VP60的C端（238～579 aa）組成，暴露在衣殼外部，而P2亞結(jié)構(gòu)域在衣殼的最外面，具有較大的遺傳變異性，也是抗原表位的聚集區(qū)。金明蘭等對(duì)分離到的YL毒株VP60基因進(jìn)行擴(kuò)增分析發(fā)現(xiàn)，VP60蛋白A、B、D、F區(qū)變異相對(duì)較低，C、E區(qū)變異較高，因而推測(cè)A、B、D、F區(qū)在衣殼蛋白中執(zhí)行更多的生物學(xué)功能。VP60參與完成病毒顆粒的包裝，能與組織血型抗原（HBGAs）結(jié)合在感染過(guò)程中維持病毒的感染性，VP60還是病毒的免疫保護(hù)性抗原，在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗病毒感染的免疫反應(yīng)中起重要的作用。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外已主要著眼于VP60蛋白基因工程疫苗的研究，現(xiàn)已在大腸桿菌、釀酒酵母及昆蟲(chóng)細(xì)胞等多種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了VP60蛋白，所有這些表達(dá)產(chǎn)物都可以保護(hù)免疫兔抵抗RHDV的致死攻擊。體外真核系統(tǒng)表達(dá)的VP60可以自我裝配成病毒樣顆粒（VLPs），其形態(tài)大小和抗原性均與天然病毒粒子相似，免疫后可以激發(fā)免疫保護(hù)反應(yīng)。孫飛研究組通過(guò)對(duì)RHDV衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析以及不同病毒株的序列比對(duì)，找到一段RHDV與抗體結(jié)合起關(guān)鍵作用的loop區(qū)（304～314 aa）。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了一段包含此loop區(qū)的多肽（300～318 aa），受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明該多肽可以和兔的組織細(xì)胞結(jié)合，且中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該多肽能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫以有效防御RHDV的感染。孟春春等將VP60兩個(gè)抗原優(yōu)勢(shì)區(qū)（31～250 aa和477～579 aa）串聯(lián)通用Th細(xì)胞表位的融合蛋白作為免疫原，可以激發(fā)機(jī)體抗RHDV感染的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。有別于傳統(tǒng)的大腸桿菌、酵母和昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的亞單位疫苗，還出現(xiàn)了利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)VP60疫苗的新途徑。Castanon等將RHDV AST/89株VP60基因克隆到植物表達(dá)載體PK2，構(gòu)建了表達(dá)載體PK2-VP60和雙重載體PROK3，重組載體轉(zhuǎn)化馬鈴薯葉片外植體，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯表達(dá)的蛋白與天然VP60相似，免疫試驗(yàn)證明表達(dá)物質(zhì)具有良好的免疫保護(hù)效果。但鑒于VP60在植物細(xì)胞中的表達(dá)量較少，所以如何提高疫苗蛋白在植物中的表達(dá)量是未來(lái)的研究方向。Gil F等成功研制出轉(zhuǎn)基因植物可飼RHD疫苗。原冬偉等以表達(dá)VP60蛋白的真核表達(dá)載體pcDNA-VP60作為新型DNA疫苗，免疫后在兔體內(nèi)產(chǎn)生了針對(duì)RHDV的免疫保護(hù)性反應(yīng)。鑒于VP60在RHDV生物學(xué)和激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)中的重要作用，還常被選作目標(biāo)分子開(kāi)發(fā)疫苗和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析世界各地RHDV毒株的變異情況。

2 RHDV抗體制備和抗原表位鑒定

單克隆抗體是一種常用的檢測(cè)工具，也是探索細(xì)胞和大分子物質(zhì)的工具。抗體在RHDV檢測(cè)，分析VP60蛋白結(jié)構(gòu)功能和RHDV遺傳進(jìn)化分析中起著重要的作用。迄今為止，以純化的RHDV病毒粒子和體外表達(dá)的VP60蛋白為免疫原制備的抗體在國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道。抗原表位是免疫原中誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體的關(guān)鍵部位，分為構(gòu)象表位和線性表位。鑒定RHDV抗體的抗原表位，對(duì)了解單克隆抗體的生物學(xué)特性以及分析病毒抗原位點(diǎn)的差異、病毒的分型、疾病的鑒別診斷和治療等有重要意義。Viaplana E等用大腸桿菌表達(dá)了5個(gè)VP60的相互重疊的片斷，經(jīng)純化后分別與自然感染的血清和疫苗免疫血清反應(yīng)，研究這些片斷的抗原性，結(jié)果表明，VP60 N端的前175個(gè)氨基酸殘基與血清反應(yīng)最強(qiáng)烈。根據(jù)這一研究結(jié)果推測(cè)，VP60 C端的抗原結(jié)構(gòu)主要是構(gòu)象依賴的B細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)，而N端含有連續(xù)抗原決定簇，在感染和疫苗免疫中誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答。Laurent等以RHDV病毒粒子為免疫原制備了6株RHDV單抗，并研究了6株單抗的識(shí)別特征，根據(jù)6株單抗識(shí)別表位的不同將RHDV抗原表位分為表面線性表位、表面構(gòu)象表位和內(nèi)部線性表位3類。Martinez-Torrecuadrada等借助由桿狀病毒表達(dá)的RHDV重組病毒樣顆粒制備了11株單抗與在大腸桿菌中表達(dá)了VP60蛋白的12個(gè)相互重疊片段反應(yīng)，鑒定出了兩段主要的抗原決定區(qū)：一段在VP60 N端的31至250位氨基酸殘基之間，另一端在VP60 C端的477至579位氨基酸殘基之間。但是能夠識(shí)別C端主要抗原區(qū)的單抗不能識(shí)別由完整的VP60蛋白質(zhì)裂解而成的主要產(chǎn)物，表明RHDV最主要的抗原可能位于VP60蛋白的N端。Laurent S等的研究表明，識(shí)別RHDV構(gòu)象表位的E3單抗可以識(shí)別VP60的C端區(qū)域，能結(jié)合內(nèi)部隱藏表位A47單抗可以識(shí)別VP60的N端區(qū)域。pGEX表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)一步確定單抗A47表位位于VP60 N端的129和160殘基之間。楊廷亞等以針對(duì)RHDV的A3c單抗株作為靶物質(zhì)應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選的抗原表位集中在VP60 N端的25至38位氨基酸殘基之間，其中核心氨基酸基序位于N端的29至33位氨基酸之間。宋艷華等以純化的RHDV病毒樣顆粒為免疫原得到了9株單抗，通過(guò)與截短的VP60反應(yīng)鑒定出這9株單抗的抗原表位均在VP60蛋白的P結(jié)構(gòu)域?？椎律纫约兓腞HDV病毒粒子為免疫原制備了6株單抗，經(jīng)鑒定其中有4株識(shí)別的為構(gòu)象表位，其余2株識(shí)別的為構(gòu)象表位，并鑒定出這2株的抗原表位在VP60的C端。隨后，孔德生等又以原核表達(dá)的VP60為免疫原篩選出針對(duì)不同亞型的RHDV型特異性單抗，并鑒定了這些RHDV型特異性單抗的抗原表位，結(jié)果表明，RHDV型特異性單抗的抗原表位均分布在VP60蛋白的P結(jié)構(gòu)域。根據(jù)這些研究結(jié)果推測(cè)VP60的N端包裹在衣殼內(nèi)部，C端暴露在外部且主要為抗原表位的分布區(qū)域。

3 RHDV遺傳變異與進(jìn)化

RHDV雖然是RNA病毒，遺傳變異性卻很低。1984年，RHD首次在江蘇無(wú)錫等地區(qū)暴發(fā)，隨后，朝鮮也暴發(fā)該病。所分離的RHDV毒株在遺傳性和抗原性上都極其穩(wěn)定，似乎均為同一血清型。通過(guò)比較不同地區(qū)RHDV分離株的全基因序列發(fā)現(xiàn)同源性都很高，氨基酸序列改變很少。VP60蛋白的N端高度保守，而C端尤其是VP60的C區(qū)（301～328 aa）和E區(qū)（344～434 aa）高度變異。鑒于C區(qū)和E區(qū)暴露于衣殼蛋白的最表面，所受的免疫壓力較大，可能是高度變異的原因。20世紀(jì)90年代以來(lái)報(bào)道了有個(gè)別毒株在不同溫度下其血凝性與常規(guī)毒株不同。1995年，Chasey在英國(guó)分離到了一株只能在4℃條件下才能凝集人的“O”型紅細(xì)胞的特殊病毒株。1996年，Capucci在英國(guó)也分離到了一株無(wú)血凝型，無(wú)毒力的與RHDV相關(guān)的新的兔杯狀病毒，稱為兔杯狀病毒（RCV），且表明RCV刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體對(duì)RHDV有交叉保護(hù)作用。RCV在病原性、組織親嗜性、VP60序列等方面均與RHDV毒株不同。隨后，在其他地域也有分離RCV的報(bào)道。RCV無(wú)致病性，在腸道中而不是在肝臟中增值，病毒滴度較低。Strive等發(fā)現(xiàn)澳大利亞RCV-A1毒株刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體對(duì)RHDV具有部分交叉保護(hù)作用且使兔群免于發(fā)病，說(shuō)明RCV能保護(hù)澳大利亞兔群抵抗RHDV的感染。1998年，Capucci等分離到兩株與RHDV參考毒株Bs89抗原性不同的新毒株，這兩株毒株與1H8單抗株無(wú)反應(yīng)，與感染Bs89參考株恢復(fù)期兔子的血清也無(wú)反應(yīng)，將其命名為RHDVa。研究表明RHDVa與野生型的RHDV有著不同的遺傳特性和抗原性，但具有相同的致病性。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析RHDVa雖為一個(gè)獨(dú)立的基因群，但在RHDV和RHDVa之間幾乎有完全的交叉保護(hù)作用。德國(guó)、法國(guó)、美國(guó)、伊利比亞半島也相繼報(bào)道分離出了RHDVa?；赗HDVa特異性識(shí)別單抗所建立的夾心ELISA可以用來(lái)快速鑒別RHDVa和RHDV。Lavazza等用夾心ELISA對(duì)近幾年來(lái)意大利RHDVa的流行情況分析發(fā)現(xiàn)，在1997年RHD僅由9%的RHDVa引起，而到2003年這一比例增加到了80%，說(shuō)明RHDVa的流行正在逐步取代RHDV。有學(xué)者認(rèn)為，RHDVa變異株的出現(xiàn)是由于疫苗免疫的選擇壓力引起的。此后，根據(jù)VP60的不同將RHDV分為6株不同的亞基因型：G1～G5和抗原變異株RHDVa即G6亞基因型。2001年，美國(guó)密歇根州報(bào)道了一種被稱為密歇根兔杯狀病毒（MRCV）的新型兔杯狀病毒，其基因組與RHDV的同源性平均為79%。相比RHDV之間衣殼蛋白98%的同源性，不同MRCV衣殼蛋白之間的同源性僅介于89.8%～91.3%。MRCV主要引起亞臨床感染，被認(rèn)為只有在特定環(huán)境條件才能誘發(fā)兔出血癥樣的疾病。2010年在法國(guó)的家兔和野兔中發(fā)現(xiàn)了一種新型的RHDV突變體，并命名為RHDV2。RHDV2在病程、死亡率等方面均與RHDV不同，臨床表現(xiàn)亞急性或慢性型癥狀高發(fā)。RHDV2和RHDV-RHDVa有著不同的抗原性和遺傳特性，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，RHDV2為一個(gè)獨(dú)立的分支，可能為兔病毒屬的一個(gè)新的成員。分子流行病學(xué)分析表明，在法國(guó)首次報(bào)道RHDV2的一年里，RHDV2已經(jīng)擴(kuò)散到了法國(guó)各地并幾乎全部代替了RHDV毒株。隨后RHDV2波及德國(guó)、意大利等國(guó)家，英國(guó)的康沃爾、諾丁漢郡、薩利郡和威爾士也有檢測(cè)到RHDV2的報(bào)道。RHDV2與RHDV-RHDVa核苷酸相似性平均為82.4%，氨基酸相似性平均為88.8%。所以，針對(duì)RHDV的多抗或有共同位點(diǎn)的單抗均能識(shí)別RHDV和RHDV2。目前，中國(guó)還沒(méi)有RHDV2型病毒的報(bào)道，但已有RHDV型特異性單抗制備的報(bào)道。

4 展望

兔病毒性出血病是在20世紀(jì)末期暴發(fā)的兔急性烈性傳染病，嚴(yán)重危害養(yǎng)兔業(yè)。RHDV還不能在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，這在一定程度上阻礙了對(duì)RHDV的進(jìn)一步研究。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，一些新的研究方法正應(yīng)用在RHDV的研究上并取得了一定的成果。VP60蛋白在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫，RHDV病毒粒子的組裝和RHDV的遺傳進(jìn)化方面有著重要的作用。越來(lái)越多針對(duì)VP60蛋白的單抗為我們了解RHDV的抗原性和解析VP60的結(jié)構(gòu)和功能提供了工具。線性表位或構(gòu)象表位的鑒定明確了RHDV抗原位點(diǎn)的差異，為鑒別診斷、治療提供了依據(jù)。RHDV進(jìn)化的速度雖然很慢，但新型病毒已經(jīng)出現(xiàn)，并正逐漸代替?zhèn)鹘y(tǒng)病毒的流行，這為新形勢(shì)下RHD的防控帶來(lái)挑戰(zhàn)，并促使我們更加深入地研究RHD及RHDV。□