春柴胡HPLC法指紋圖譜的研究

鄭 正 汪海宣 苗仁華 蔣 菲

（合肥市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 合肥 230001）

春柴胡HPLC法指紋圖譜的研究

鄭 正 汪海宣 苗仁華 蔣 菲

（合肥市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 合肥 230001）

目的建立春柴胡的HPLC法指紋圖譜，為科學(xué)評(píng)價(jià)與有效控制春柴胡的質(zhì)量提供快捷、有效的方法。方法采用HPLC法測定10批不同產(chǎn)地春柴胡樣品。色譜條件：MERK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85），流速1.0 mL/min，檢測波長256 nm，柱溫為35 ℃。結(jié)果本研究建立的分析方法有良好的重復(fù)性，操作簡便、快速，結(jié)果客觀、準(zhǔn)確。結(jié)論能較全面的反映出春柴胡中所含成分的種類和數(shù)量，能更好的表明其的內(nèi)在質(zhì)量，可作為其產(chǎn)品質(zhì)量控制的有效手段。

春柴胡；指紋圖譜；HPLC

春柴胡為傘形科（Umbelliferae）植物狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd．的干燥帶根全草。主產(chǎn)于江蘇大部分地區(qū)和安徽東部一帶，由于春季采收，故習(xí)稱“春柴胡”。為我國傳統(tǒng)中藥，苦、微寒，具有和解表里，退熱疏肝、升舉陽氣等功效[1-3]。其主要化學(xué)活性成分為皂苷類、黃酮類、揮發(fā)油類等成分。目前，春柴胡的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)較少，僅有《江蘇省中藥材標(biāo)準(zhǔn)1989年版》和《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范2005年版》分別對(duì)春柴胡藥材及飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制，且只有外觀形狀等項(xiàng)目，較難客觀的控制其質(zhì)量。中藥材中含有多種化學(xué)組分，其多數(shù)成分含量相對(duì)于主要活性成分較低，且藥理作用不是非常明確。為了開發(fā)利用其資源，完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更好的對(duì)春柴胡的質(zhì)量進(jìn)行控制，采用中藥指紋圖譜的方法來對(duì)市場上不同產(chǎn)地的春柴胡進(jìn)行研究；建立HPLC法指紋圖譜測定條件并進(jìn)行一系列方法學(xué)考察，對(duì)春柴胡中各主要成分的指紋圖譜進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，建立春柴胡在一定處理和分析條件下的對(duì)照指紋圖譜，為春柴胡的質(zhì)量控制研究開辟一個(gè)新思路。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：Thermofisher U3000高效液相色譜儀，DAD檢測器；IKA研磨粉碎機(jī)，F(xiàn)isher超聲波清洗器；電子天平（METTLER，XP205）。所有計(jì)量儀器和量具均經(jīng)檢定和校正。

1.2 試劑與試藥：蕓香苷對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院；批號(hào)：100080-201408；含量：92.8%）；乙腈為色譜純，重蒸水。10批藥材來源見表1。

以上藥材經(jīng)合肥市食品藥品檢驗(yàn)中心劉業(yè)飛主任中藥師鑒定均為正品。

1.3 指紋圖譜相似度計(jì)算軟件：國家藥典委員會(huì)開發(fā)的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（版本號(hào)2012.130723）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：參照相關(guān)文獻(xiàn)[4]，摸索春柴胡色譜條件，確定測定色譜柱為Thermo C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85）；流速：1.000 mL/min，柱溫：35℃，進(jìn)樣量：5 μL。測定波長：經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在波長為256 nm下，春柴胡藥材中的蕓香苷和其他一些化學(xué)組分均能較好的響應(yīng)，蕓香苷成分是此條件下響應(yīng)最大的物質(zhì)，且各峰分離度和峰形均良好，理論板數(shù)高，因此確定256 nm為春柴胡藥材指紋圖譜的檢測波長，見圖1、圖2。

表1 春柴胡產(chǎn)地

圖3 10批春柴胡批疊加HPLC色譜圖

圖4 春柴胡藥材對(duì)照指紋圖譜

圖5 10批春柴胡藥材指紋圖譜

圖1 春柴胡藥材樣品色譜圖

圖2 蕓香苷參照物色譜圖

根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)照，可指認(rèn)春柴胡藥材指紋圖譜中的主要色譜峰；其中色譜圖中保留時(shí)間約為17 min峰為蕓香苷，其他峰為在該指紋圖譜測定條件下所測得的能夠明確反映春柴胡藥材的主要成分。

2.2 參照物溶液的制備：研究發(fā)現(xiàn)，春柴胡藥材中含有蕓香苷，具有較高的含量且成分比較穩(wěn)定，蕓香苷在該色譜系統(tǒng)條件下響應(yīng)較高，所以選擇蕓香苷作為參照物。精密稱取蕓香苷對(duì)照品制成0.25 mg/mL的參照物溶液。見圖3。

2.3 供試品溶液的制備：參照中國藥典2015年版一部柴胡藥材標(biāo)準(zhǔn)[1]，確定春柴胡的主要成分提取方法為：取春柴胡藥材，研磨粉碎，過40目篩，取粉末約0.25 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇70 mL，浸泡2 h，超聲處理30 min，放冷，加甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm的濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 精密度試驗(yàn)：取春柴胡藥材（產(chǎn)地：句容），照2.3項(xiàng)下方法制備樣品，依法測定記錄色譜圖，用第一次進(jìn)樣所得色譜圖中蕓香苷峰等5個(gè)成分峰作為校正峰，計(jì)算6份色譜圖的相似度，其結(jié)果均不小于0.987，均達(dá)到中藥色譜指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（≥0.950），結(jié)果本方法精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)：取春柴胡藥材（產(chǎn)地：句容），照2.3項(xiàng)下方法制備樣品6份，依次測定記錄色譜圖，用第一份樣品的色譜圖中蕓香苷峰等5個(gè)成分峰作為校正峰，計(jì)算5份樣品色譜圖的相似度，結(jié)果均不小于0.999，均達(dá)到中藥色譜指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（≥0.950），結(jié)果本方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取春柴胡藥材（產(chǎn)地：句容），照2.3項(xiàng)下方法制備樣品，放置0、2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣，記錄色譜圖，用0 h進(jìn)樣的色譜圖中蕓香苷峰等5個(gè)成分峰作為校正峰，用軟件計(jì)算6份色譜圖的相似度，結(jié)果均不小于0.994，均達(dá)到中藥色譜指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（≥0.950），表明該方法制備所得樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 春柴胡藥材主要成分對(duì)照指紋圖譜生成：按2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，對(duì)10批不同產(chǎn)地春柴胡藥材的測定，記錄色譜圖，生成疊加液相色圖譜（圖4），以產(chǎn)地為句容樣品色圖譜作為參照?qǐng)D譜模板，導(dǎo)出cdf色譜文件，時(shí)間窗設(shè)置為0.1，以蕓香苷峰等5個(gè)成分峰作為校正峰，用導(dǎo)入指紋圖譜相似度計(jì)算軟件，以這10批樣品色譜圖為基礎(chǔ)生成一個(gè)對(duì)照指紋圖譜，此圖譜即為對(duì)照指紋圖譜。

2.8 10批不同產(chǎn)地的春柴胡藥材指紋圖譜相似度計(jì)算：計(jì)算相似度，獲得結(jié)果顯示各指紋圖譜的相似度均＞0.994。見圖5。

3 結(jié)果與討論

3.1 目前，中藥材及飲片的鑒別、分類和質(zhì)量評(píng)定的采用的方法一般是經(jīng)驗(yàn)鑒別、顯微鑒別等表觀分析，缺乏從統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)中獲得統(tǒng)一的評(píng)價(jià)依據(jù)。中藥色譜指紋圖譜相似度軟件計(jì)算方法使得數(shù)據(jù)處理過程方便、快速，能較全面的反映出春柴胡中所含成分的類別和含量，能更好的表明其的內(nèi)在質(zhì)量可作為其產(chǎn)品質(zhì)量控制的有效依據(jù)。

3.2 本方法簡單操作方便，實(shí)驗(yàn)表明，各地產(chǎn)的春柴胡真品質(zhì)量差異較小，在指紋圖譜中反映相似度比較高，但我們僅僅初步研究了甲醇提取物的指紋圖譜，不能系統(tǒng)的反應(yīng)藥品質(zhì)量，只能對(duì)春柴胡的初步質(zhì)量控制。

3.3 研究中發(fā)現(xiàn)春柴胡和柴胡的指紋圖譜相似程度差異較大，所以入藥時(shí)春柴胡是不是能和柴胡混用還待進(jìn)一步研究探討。

[1] 中華人民共和國藥典委員會(huì).中國藥典2015年版一部[M].北京:化學(xué)化工出版社,2015:158-159.

[2] 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院.中藥志[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1959:366-374.

[3] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì).中國植物志(第27卷)[M].北京:科學(xué)出版社,1979:51.

[4] 韋英杰,王茉,寧青,等.HPLC法同時(shí)測定柴胡與春柴胡中皂苷類及黃酮類成分的含量[J].藥物分析雜志,2011,31(5):879-883.

R282.710.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1671-8194（2017）23-0027-02