香丹注射液溶血檢查的實(shí)驗(yàn)方法探討

陸 駿林 芳

（1 江蘇省無錫藥品檢驗(yàn)所，江蘇 無錫 214000；2 無錫濟(jì)民可信藥業(yè)有限公司，江蘇 無錫 214000）

香丹注射液溶血檢查的實(shí)驗(yàn)方法探討

陸 駿1林 芳2

（1 江蘇省無錫藥品檢驗(yàn)所，江蘇 無錫 214000；2 無錫濟(jì)民可信藥業(yè)有限公司，江蘇 無錫 214000）

目的常規(guī)體外試管法與分光光度法在香丹注射液溶血檢查中的應(yīng)用比較。方法通過吸收波長(zhǎng)，試驗(yàn)恒溫時(shí)間及離心轉(zhuǎn)速的研究，建立了分光光度法測(cè)定溶血率的方法，并與常規(guī)體外試管法進(jìn)行了溶血試驗(yàn)的結(jié)果對(duì)比。結(jié)果常規(guī)體外試管法判斷沒有溶血或不明顯的結(jié)果，分光光度法均可測(cè)定出具體數(shù)值，且結(jié)果在溶血趨勢(shì)上具有一定的一致性。結(jié)論分光光度法更為方便，準(zhǔn)確。適用于香丹注射液的溶血監(jiān)測(cè)使用。

常規(guī)體外試管法；分光光度法；溶血率

分光光度法進(jìn)行溶血率測(cè)定的較多用于醫(yī)療器械[1-2]及包材[3]，根據(jù)紅細(xì)胞破裂釋放出來的血紅素在545 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，通過測(cè)定溶液的吸光度從而定量測(cè)定樣品的溶血率。本文采用2種溶血性試驗(yàn)方法（常規(guī)體外試管法和改進(jìn)的分光光度法）對(duì)不同廠家香丹注射液進(jìn)行對(duì)比考察，得出一些有益的結(jié)果，為臨床用藥安全提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器：紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，TU-1800spc）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市富華儀器 有限公司）；80-2型離心沉淀機(jī)（上海手術(shù)器械廠）。

1.2 材料：香丹注射液A（廠家1，批號(hào)14060611）；B（廠家2，批號(hào)20151001）；C（廠家3，批號(hào) 141014）；D（廠家4，批號(hào)1309104）；E（廠家4，批號(hào)1309233）。

1.3 動(dòng)物：新西蘭家兔[體質(zhì)量2.0～3.0 kg，雌雄不限，由無錫市惠山江南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物廠提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（蘇）2015-0004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)NO.201508591]。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 2%紅細(xì)胞混懸液的制備：選取健康家兔1只，注射器心臟取血約20 mL。將抽取的血液迅速轉(zhuǎn)移至已放入少量玻璃珠的潔凈燒杯中，輕輕不斷搖動(dòng)10 min。除去纖維蛋白原，吸取血液轉(zhuǎn)移至刻度離心管中，以約10倍量生理鹽水洗滌，充分搖勻離心沉淀，棄去上清液，重復(fù)上述步驟3次，直至離心后上清液透亮，取2 mL紅細(xì)胞，生理鹽水稀釋至100 mL，即成。當(dāng)天使用。

2.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定：取潔凈試管一支，加入5.0 mL新鮮蒸餾水，再加入5.0 mL 2%兔紅細(xì)胞混懸液，輕度振搖，充分混勻，試管置37 ℃水浴孵育2 h后，取出置離心機(jī)中離心5 min（2000 r/min），吸取上清液，波長(zhǎng)測(cè)量用紫外分光光度計(jì)在200～600 nm區(qū)域進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示樣品在545 nm處有最大吸收。

2.3 最佳離心速度與時(shí)間的選?。喝崈粼嚬?支，先在各管中加入0.9%氯化鈉注射液5.0 mL，再分別加入2%兔紅細(xì)胞混懸液5.0 mL。充分混勻，37 ℃水浴孵育30 min。轉(zhuǎn)速離心選取1000、2000、3000 r/min三個(gè)段位，離心時(shí)間分別選取5、10、15 min，分別取其上清液于545 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)轉(zhuǎn)速＜2000 r/min時(shí)溶液渾濁，部分紅細(xì)胞未達(dá)到完全沉降，當(dāng)離心速度為3000 r/min時(shí)，離心時(shí)因速度加速，部分藥物分子及附加劑與紅細(xì)胞發(fā)生碰撞的力量加大，導(dǎo)致溶血概率上升[4]，轉(zhuǎn)速離心以2000 r/min，5 min較為合適。

2.4 常規(guī)體外試管法檢查：選取12支潔凈試管，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)“4×3”（分為供試品組、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組，樣品底色組共4組。每組各3支試管）。Ⅰ組為供試品組，各加入2%紅細(xì)胞混懸液5.0 mL，樣品0.6 mL，0.9%氯化鈉注射液4.4 mL；Ⅱ組為陽(yáng)性對(duì)照組，各加入2%兔紅細(xì)胞混懸液5.0 mL和新鮮蒸餾水5.0 mL；Ⅲ組為陰性對(duì)照組，各加入2%兔紅細(xì)胞混懸液5.0 mL和0.9%氯化鈉注射液5.0 mL；Ⅳ組：樣品底色組[5]，0.9%氯化鈉注射液9.4 mL+樣品0.6 mL混勻。將加樣后的12支試管迅速放置37 ℃水浴，孵育2 h，觀察結(jié)果。

2.5 結(jié)果：供試品組—香丹注射液A：3支試管中，一支有血凝聚現(xiàn)象，振搖有血凝塊，多次振搖血凝塊消失。無溶血現(xiàn)象。其余廠家香丹注射液無溶血與凝聚現(xiàn)象發(fā)生。

2.6 分光光度法檢查：分別取“常規(guī)體外試管法檢查”項(xiàng)下孵育2 h的溶液12管，離心5 min（2000 r/min），上清液在545 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，每組測(cè)得3支管的吸收度取其均值。按公式“溶血率%=（AIAIII-AIV）/（AII-AIII）×100%”計(jì)算溶血率[6]。結(jié)果見表1。

3 討 論

3.1 本實(shí)驗(yàn)通過最大吸收波長(zhǎng)的選取，試驗(yàn)恒溫時(shí)間的研究和最適離心轉(zhuǎn)速的探索，采用香丹注射液體外溶血性試驗(yàn)分光光度法測(cè)定溶血率結(jié)果，與常規(guī)體外試管法進(jìn)行對(duì)比。數(shù)據(jù)表明，常規(guī)體外試管法肉眼觀察判斷結(jié)果其準(zhǔn)確性易受藥品本身顏色等因素影響。不同實(shí)驗(yàn)人員比對(duì)，主觀判斷差異較大[7]。試驗(yàn)時(shí)離心的速度[8]及溫度的控制在操作時(shí)應(yīng)多加注意，離心時(shí)因速度加速，部分藥物分子及附加劑與紅細(xì)胞發(fā)生碰撞的力量加大，導(dǎo)致溶血概率上升。

表1 分光光度法檢查結(jié)果

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明同一廠家的香丹注射液，不同批號(hào)所測(cè)得的溶血度也存在差異。這可能與該品種中含有的鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、葉綠素等雜質(zhì)的去除有關(guān)。該制劑的pH值、滲透壓等理化性質(zhì)及附加劑等也是產(chǎn)生溶血的因素。

3.3 試驗(yàn)中還采用了臨床常用濃度的供試液(靜脈滴注：一次10～20 mL，5%葡萄糖250～500 mL）稀釋后使用。此時(shí)藥液由于被稀釋13.5倍，顏色干擾小，可采用肉眼判斷。

3.4 中藥注射劑溶血反應(yīng)的特點(diǎn)體現(xiàn)在形成機(jī)制復(fù)雜[9]，發(fā)生范圍廣泛。采用體內(nèi)、外多個(gè)試驗(yàn)相結(jié)合綜合評(píng)價(jià)法，可能是一個(gè)有效的途徑。此外，因不同的中藥注射劑顏色及深淺不同，若色澤對(duì)血紅素的最大吸收有干擾[10]。因本品為有色液體，特設(shè)一底色組。在開展香丹注射液溶血性實(shí)驗(yàn)時(shí)，將紅細(xì)胞懸液和藥物一并置37 ℃水浴，孵育2 h，分別通過觀察上清液溶液的顏色肉眼判斷，分光光度法測(cè)定吸光度計(jì)算溶血率來定量。分光光度法更為方便，準(zhǔn)確。且結(jié)果與常規(guī)體外試管法在溶血趨勢(shì)上具有一定的一致性。

[1] 中國(guó)藥典.2015年版.一部[S].2015:附錄.

[2] GB/T14233.2-2005.醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢查方法.第二部分:生物試驗(yàn)方法[S].2005.

[3] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.藥包材檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)匯編[S].2003.

[4] 侯少貞,李耿.葛根素注射液體外溶血的實(shí)驗(yàn)研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2011,5(22):289-291.

[5] Xu F.Clinical use and the adverse reactions of sodium aescinate[J]. Dis Monitor Control,2011,5(2):123-124.

R-331 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1671-8194（2017）23-0025-02