楊德++薛淑靜++黃蕾++郭鵬++高虹++史德芳++李露++陳曉春
摘要:采用響應(yīng)面法,以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)酶解溫度、酶添加量、酶解時(shí)間、料液比4個(gè)影響因素進(jìn)行考察,優(yōu)化酶法提取黃精多糖的提取工藝,另以Design-Expert 8.05軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明,最優(yōu)工藝為酶添加量3%、酶解溫度54.8 ℃、酶解時(shí)間99 min、料液比1∶22.4(g/mL),經(jīng)驗(yàn)證黃精多糖提取率為11.22%。利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選的黃精多糖酶法提取工藝穩(wěn)定可行,可用于黃精多糖的提取。
關(guān)鍵詞:黃精;多糖;響應(yīng)面
中圖分類號(hào):R284.2;TQ461 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2017)16-3121-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.16.031
Optimization of Enzymatic Extraction of Polysaccharide from Ploygonatum by Box-Behnken Design and Response Surface Methodology
YANG De1,XUE Shu-jing1,HUANG Lei2,GUO Peng1,GAO Hong1,SHI De-fang1,LI Lu1,CHEN Xiao-chun3
(1.Research Institute of Agricultural Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology, Wuhan 430064,China;
2.College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070,China;
3.Yuan Hui Technology Development Co.,Ltd., Enshi 445000,Hubei,China)
Abstract:To optimize the processing of enzymatic extraction of polysaccharide from Ploygonatum. Box-Behnken response surface methodology was used to optimize different enzyme dosage,reaction temperature and reaction time by using Design-Expert 8.05 software for data analysis and processing. According to Box-Behnken response,the best extraction conditions for the polysaccharide from Ploygonatum were as follows:the amount of enzyme complex was 3%,hydrolysis temperature was 54.8 ℃,and reaction time was 99 min,ratio of solid to liquid 1∶22.4(g/mL). In accordance with the above process,the polysaccharide yield was 11.22%. Box-Behnken response surface methodology is used to optimize the enzymatic extraction process for the polysaccharide in this study,which is effective,stable and feasible.
Key words: ploygonatum; polysaccharide; response surface methodology
黃精為百合科植物黃精(Polygonatum sibiricum Redoute)的根莖,其味甘、性平,有補(bǔ)中益氣、潤(rùn)心肺、強(qiáng)筋骨的功能[1,2]。研究表明,黃精多糖是黃精主要功能成分之一,具有延長(zhǎng)果蠅壽命、改善老齡大鼠老化相關(guān)酶的活性及對(duì)老齡大鼠明顯的促智作用,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其活性成分最主要為黃精多糖(Polygonatum Sibiricum Polysaccharides,PSP),其具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖血脂、調(diào)節(jié)免疫等生理功能[3,4],因此黃精多糖的提取工藝研究對(duì)黃精的開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。
1 材料與方法
1.1 材料與設(shè)備
黃精,市售,采購(gòu)于藥店。纖維素酶(15 000 U/g),國(guó)藥集團(tuán)有限公司。所用試劑均為分析純。恒溫水浴鍋,TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司),中藥切片機(jī),分析天平(0.001 g)。
1.2 試驗(yàn)方法
原料處理:取無(wú)霉變的黃精塊莖,切成厚度4 mm左右薄片,然后60 ℃烘干,萬(wàn)用粉碎機(jī)粉碎,然后過(guò)40目篩,備用。脫脂:將原料置于濾紙筒中,放于索氏抽提器內(nèi),石油醚脫脂,然后烘干。水提:將脫脂后的原料裝入三角瓶,按試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行多糖提取。
1.2.1 單因素試驗(yàn) ①纖維素酶添加量對(duì)黃精多糖提取率的影響。在55 ℃酶解溫度下,調(diào)料液比為 1∶20(g∶mL,下同),pH為5.5,調(diào)整酶添加量為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%,酶解90 min,離心,取上清液0.5 mL,用3倍體積95%乙醇沉淀一夜,然后離去上清液,不溶物用1.5 mL水溶解,吸取0.1 mL待測(cè)。②酶解溫度對(duì)黃精多糖提取率的影響。在最佳酶添加量的條件下,稱取5 g樣品,在45、50、55、60、65 ℃酶解溫度下,調(diào)料液比為1∶20,pH為5.5。然后調(diào)整酶添加量為3%,酶解90 min,后續(xù)步驟同上。③酶解時(shí)間對(duì)黃精多糖提取率的影響。最佳酶添加量的條件下,稱取5 g樣品,在55 ℃酶解溫度下,調(diào)料液比為1∶20,pH為5.5。然后調(diào)整酶添加量為3%,酶解30~150 min,后續(xù)步驟同上。④料液比對(duì)黃精多糖提取率的影響。在最佳酶添加量,最佳提取時(shí)間和最佳酶解溫度的條件下,稱取5 g樣品,在55 ℃酶解溫度下,調(diào)料液比為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30,pH為5.5。然后調(diào)整酶添加量為3%,后續(xù)步驟同上。endprint
1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Design-Expert軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)方法,選擇酶解溫度、酶添加量、酶解時(shí)間和料液比4個(gè)因素,以黃精多糖提取率為指標(biāo),設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn),優(yōu)化黃精多糖提取條件。
1.3 指標(biāo)測(cè)定
多糖測(cè)定:吸取5 mL提取液用3倍體積的95%的乙醇混合,靜置一夜以沉淀粗多糖,然后于4 000 r/min離心20 min,棄去上清液,不溶物用蒸餾水洗滌溶解,定容至50 mL,用蒽酮比色法測(cè)定多糖含量[5]。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素試驗(yàn)
2.1.1 酶添加量對(duì)黃精多糖提取率的影響 由圖1可知,隨酶添加量增加,黃精多糖提取率先增加后下降,添加量為3%時(shí)提取率最高,達(dá)到11.6%,添加過(guò)量的酶反而降低了黃精多糖提取率,可能與酶對(duì)多糖的降解有關(guān)。由圖2可知,纖維素酶酶解提取黃精多糖最適溫度為55 ℃,溫度不同黃精多糖提取率不同,可能與不同溫度下酶的溫度有關(guān),纖維素酶活性受溫度影響較大,在一定溫度范圍內(nèi),纖維素酶活性與溫度呈正相關(guān),超過(guò)一定溫度范圍由于蛋白質(zhì)變性,酶活性降低直至消失。由圖3可知,酶解時(shí)間90 min時(shí)多糖提取率最高,120 min和150 min時(shí)提取率降低。由圖4可知,料液比為1∶20時(shí)黃精多糖提取率最高,達(dá)9.12%,因此選擇料液比1∶20作為最適料液比。
2.2 黃精多糖提取響應(yīng)面優(yōu)化
2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)考察的基礎(chǔ)上,選擇影響多糖得率的4個(gè)因素,即酶解溫度(A)、酶添加量(B)、酶解時(shí)間(C)、料液比(D),采用Design-Expert軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)方法,將4個(gè)因素作為因變量,多糖得率作為響應(yīng)值進(jìn)行考察。設(shè)計(jì)因素及水平見(jiàn)表1,共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。
2.2.2 模型的擬合 應(yīng)用Design-expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得出多糖得率與酶解溫度(A)、酶添加量(B)、酶解時(shí)間(C)、料液比(D)之間的回歸方程:Y=-102.129 78+3.609 99A+0.624 38B+0.050 75C+0.146 59D+0.017 113AB+9.358 83×10-4AC+4.525 30×10-3AD-0.016 252BC+0.149 30BD+3.947 78×10-4CD-0.035 258A2-0.368 63B2-3.134 57×10-4C2-0.019 661D2(R2=0.938 8,P<0.01)。方差分析結(jié)果表明,擬合得到的回歸方程P<0.01,表示該模型在本試驗(yàn)研究范圍內(nèi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由表3可知,因素B、C、D、A2、C2、D2對(duì)多糖得率有顯著影響(P<0.05),A、AB、AC、AD、CD、B2因素影響不顯著(P>0.05),因素BC、BD交互作用有顯著影響(P<0.05),AB、AC、AD、CD交互作用無(wú)顯著影響(P>0.05),各因素對(duì)提取率影響排序?yàn)锽>C>D>A。本試驗(yàn)?zāi)P蛿M合極顯著(P<0.01),失擬項(xiàng)P>0.05,說(shuō)明數(shù)學(xué)模型具有較好的預(yù)測(cè)性。
2.2.3 效應(yīng)曲面分析 圖5-圖10為經(jīng)Design-Expert軟件分析得到的酶解溫度、料液比、酶解時(shí)間、酶添加量4個(gè)因素對(duì)于響應(yīng)值的三維曲面圖。表明酶添加量和料液比交互作用、料液比和酶解時(shí)間交互作用對(duì)黃精多糖提取率影響較顯著,其他因素交互作用影響相對(duì)不顯著。通過(guò)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)計(jì)算分析結(jié)果表明,酶法提取黃精多糖最優(yōu)工藝為酶解溫度54.8 ℃,酶添加量3%,酶解時(shí)間99 min,料液比 1∶22.4,此時(shí)理論上黃精多糖提取率可達(dá)11.38%。
3 小結(jié)與討論
通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)分析,結(jié)果表明,酶法提取黃精多糖最優(yōu)工藝為酶解溫度54.8 ℃,酶添加量3%,酶解時(shí)間99 min,料液比1∶22.4,為方便實(shí)際操作可行性,將參數(shù)修正為酶解溫度55 ℃,酶添加量3%,酶解時(shí)間100 min,料液比1∶22,經(jīng)驗(yàn)證黃精多糖提取率為11.22%,與理論預(yù)測(cè)值11.38%基本吻合。因此,利用Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化黃精多糖酶法提取工藝得到的黃精多糖提取工藝參數(shù)真實(shí)可靠,具有實(shí)用價(jià)值。
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