Box—Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化黃精多糖酶法提取工藝

楊德++薛淑靜++黃蕾++郭鵬++高虹++史德芳++李露++陳曉春

摘要：采用響應(yīng)面法，以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)酶解溫度、酶添加量、酶解時(shí)間、料液比4個(gè)影響因素進(jìn)行考察，優(yōu)化酶法提取黃精多糖的提取工藝，另以Design-Expert 8.05軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，最優(yōu)工藝為酶添加量3%、酶解溫度54.8 ℃、酶解時(shí)間99 min、料液比1∶22.4（g/mL），經(jīng)驗(yàn)證黃精多糖提取率為11.22%。利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選的黃精多糖酶法提取工藝穩(wěn)定可行，可用于黃精多糖的提取。

關(guān)鍵詞：黃精；多糖；響應(yīng)面

中圖分類號(hào)：R284.2；TQ461 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）16-3121-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.16.031

Optimization of Enzymatic Extraction of Polysaccharide from Ploygonatum by Box-Behnken Design and Response Surface Methodology

YANG De1，XUE Shu-jing1，HUANG Lei2，GUO Peng1，GAO Hong1，SHI De-fang1，LI Lu1，CHEN Xiao-chun3

（1.Research Institute of Agricultural Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology， Wuhan 430064，China；

2.College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070，China；

3.Yuan Hui Technology Development Co.，Ltd.， Enshi 445000，Hubei，China）

Abstract：To optimize the processing of enzymatic extraction of polysaccharide from Ploygonatum. Box-Behnken response surface methodology was used to optimize different enzyme dosage，reaction temperature and reaction time by using Design-Expert 8.05 software for data analysis and processing. According to Box-Behnken response，the best extraction conditions for the polysaccharide from Ploygonatum were as follows：the amount of enzyme complex was 3%，hydrolysis temperature was 54.8 ℃，and reaction time was 99 min，ratio of solid to liquid 1∶22.4（g/mL）. In accordance with the above process，the polysaccharide yield was 11.22%. Box-Behnken response surface methodology is used to optimize the enzymatic extraction process for the polysaccharide in this study，which is effective，stable and feasible.

Key words： ploygonatum； polysaccharide； response surface methodology

黃精為百合科植物黃精（Polygonatum sibiricum Redoute）的根莖，其味甘、性平，有補(bǔ)中益氣、潤(rùn)心肺、強(qiáng)筋骨的功能[1，2]。研究表明，黃精多糖是黃精主要功能成分之一，具有延長(zhǎng)果蠅壽命、改善老齡大鼠老化相關(guān)酶的活性及對(duì)老齡大鼠明顯的促智作用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其活性成分最主要為黃精多糖（Polygonatum Sibiricum Polysaccharides，PSP），其具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖血脂、調(diào)節(jié)免疫等生理功能[3，4]，因此黃精多糖的提取工藝研究對(duì)黃精的開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

黃精，市售，采購(gòu)于藥店。纖維素酶（15 000 U/g），國(guó)藥集團(tuán)有限公司。所用試劑均為分析純。恒溫水浴鍋，TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），中藥切片機(jī)，分析天平（0.001 g）。

1.2 試驗(yàn)方法

原料處理：取無(wú)霉變的黃精塊莖，切成厚度4 mm左右薄片，然后60 ℃烘干，萬(wàn)用粉碎機(jī)粉碎，然后過(guò)40目篩，備用。脫脂：將原料置于濾紙筒中，放于索氏抽提器內(nèi)，石油醚脫脂，然后烘干。水提：將脫脂后的原料裝入三角瓶，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行多糖提取。

1.2.1 單因素試驗(yàn) ①纖維素酶添加量對(duì)黃精多糖提取率的影響。在55 ℃酶解溫度下，調(diào)料液比為 1∶20（g∶mL，下同），pH為5.5，調(diào)整酶添加量為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%，酶解90 min，離心，取上清液0.5 mL，用3倍體積95%乙醇沉淀一夜，然后離去上清液，不溶物用1.5 mL水溶解，吸取0.1 mL待測(cè)。②酶解溫度對(duì)黃精多糖提取率的影響。在最佳酶添加量的條件下，稱取5 g樣品，在45、50、55、60、65 ℃酶解溫度下，調(diào)料液比為1∶20，pH為5.5。然后調(diào)整酶添加量為3%，酶解90 min，后續(xù)步驟同上。③酶解時(shí)間對(duì)黃精多糖提取率的影響。最佳酶添加量的條件下，稱取5 g樣品，在55 ℃酶解溫度下，調(diào)料液比為1∶20，pH為5.5。然后調(diào)整酶添加量為3%，酶解30～150 min，后續(xù)步驟同上。④料液比對(duì)黃精多糖提取率的影響。在最佳酶添加量，最佳提取時(shí)間和最佳酶解溫度的條件下，稱取5 g樣品，在55 ℃酶解溫度下，調(diào)料液比為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，pH為5.5。然后調(diào)整酶添加量為3%，后續(xù)步驟同上。endprint

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，選擇酶解溫度、酶添加量、酶解時(shí)間和料液比4個(gè)因素，以黃精多糖提取率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化黃精多糖提取條件。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

多糖測(cè)定：吸取5 mL提取液用3倍體積的95%的乙醇混合，靜置一夜以沉淀粗多糖，然后于4 000 r/min離心20 min，棄去上清液，不溶物用蒸餾水洗滌溶解，定容至50 mL，用蒽酮比色法測(cè)定多糖含量[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶添加量對(duì)黃精多糖提取率的影響 由圖1可知，隨酶添加量增加，黃精多糖提取率先增加后下降，添加量為3%時(shí)提取率最高，達(dá)到11.6%，添加過(guò)量的酶反而降低了黃精多糖提取率，可能與酶對(duì)多糖的降解有關(guān)。由圖2可知，纖維素酶酶解提取黃精多糖最適溫度為55 ℃，溫度不同黃精多糖提取率不同，可能與不同溫度下酶的溫度有關(guān)，纖維素酶活性受溫度影響較大，在一定溫度范圍內(nèi)，纖維素酶活性與溫度呈正相關(guān)，超過(guò)一定溫度范圍由于蛋白質(zhì)變性，酶活性降低直至消失。由圖3可知，酶解時(shí)間90 min時(shí)多糖提取率最高，120 min和150 min時(shí)提取率降低。由圖4可知，料液比為1∶20時(shí)黃精多糖提取率最高，達(dá)9.12%，因此選擇料液比1∶20作為最適料液比。

2.2 黃精多糖提取響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)考察的基礎(chǔ)上，選擇影響多糖得率的4個(gè)因素，即酶解溫度（A）、酶添加量（B）、酶解時(shí)間（C）、料液比（D），采用Design-Expert軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，將4個(gè)因素作為因變量，多糖得率作為響應(yīng)值進(jìn)行考察。設(shè)計(jì)因素及水平見(jiàn)表1，共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2 模型的擬合 應(yīng)用Design-expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出多糖得率與酶解溫度（A）、酶添加量（B）、酶解時(shí)間（C）、料液比（D）之間的回歸方程：Y=-102.129 78+3.609 99A+0.624 38B+0.050 75C+0.146 59D+0.017 113AB+9.358 83×10-4AC+4.525 30×10-3AD-0.016 252BC+0.149 30BD+3.947 78×10-4CD-0.035 258A2-0.368 63B2-3.134 57×10-4C2-0.019 661D2（R2=0.938 8，P<0.01）。方差分析結(jié)果表明，擬合得到的回歸方程P<0.01，表示該模型在本試驗(yàn)研究范圍內(nèi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由表3可知，因素B、C、D、A2、C2、D2對(duì)多糖得率有顯著影響（P<0.05），A、AB、AC、AD、CD、B2因素影響不顯著（P>0.05），因素BC、BD交互作用有顯著影響（P<0.05），AB、AC、AD、CD交互作用無(wú)顯著影響（P>0.05），各因素對(duì)提取率影響排序?yàn)锽>C>D>A。本試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合極顯著（P<0.01），失擬項(xiàng)P>0.05，說(shuō)明數(shù)學(xué)模型具有較好的預(yù)測(cè)性。

2.2.3 效應(yīng)曲面分析 圖5-圖10為經(jīng)Design-Expert軟件分析得到的酶解溫度、料液比、酶解時(shí)間、酶添加量4個(gè)因素對(duì)于響應(yīng)值的三維曲面圖。表明酶添加量和料液比交互作用、料液比和酶解時(shí)間交互作用對(duì)黃精多糖提取率影響較顯著，其他因素交互作用影響相對(duì)不顯著。通過(guò)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)計(jì)算分析結(jié)果表明，酶法提取黃精多糖最優(yōu)工藝為酶解溫度54.8 ℃，酶添加量3%，酶解時(shí)間99 min，料液比 1∶22.4，此時(shí)理論上黃精多糖提取率可達(dá)11.38%。

3 小結(jié)與討論

通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)分析，結(jié)果表明，酶法提取黃精多糖最優(yōu)工藝為酶解溫度54.8 ℃，酶添加量3%，酶解時(shí)間99 min，料液比1∶22.4，為方便實(shí)際操作可行性，將參數(shù)修正為酶解溫度55 ℃，酶添加量3%，酶解時(shí)間100 min，料液比1∶22，經(jīng)驗(yàn)證黃精多糖提取率為11.22%，與理論預(yù)測(cè)值11.38%基本吻合。因此，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化黃精多糖酶法提取工藝得到的黃精多糖提取工藝參數(shù)真實(shí)可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

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