畜禽干擾素—γ研究進展

葉繁翔++譚佳麗++何錦艷+葉丹+徐紅貞+歐陽婧

摘要：干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）是一種具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，主要由活化的T細(xì)胞和自然殺傷（Natural killer）細(xì)胞產(chǎn)生。干擾素因其重要的免疫調(diào)節(jié)功能而被廣泛地應(yīng)用于疾病的診斷及治療過程。本研究主要對干擾素-γ誘生、作用機制、生物學(xué)活性、畜禽IFN-γ基因多態(tài)性與疾病的關(guān)系以及畜禽干擾素開發(fā)等的研究現(xiàn)狀進行綜述，以期為畜禽干擾素-γ的深入研究及其在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：干擾素-γ（interferon-γ）；基因多態(tài)性；抗病

中圖分類號：S852.4 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）16-3001-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.16.001

Research Progress of Interferon-γ in Livestock and Poultry

YE Fan-xiang， TAN Jia-li， HE Jin-yan， YE Dan， XU Hong-zhen， OU-YANG Jing

（College of Life Science of Jiangxi Science and Technology Normal University/Jiangxi Key Laboratory of Bioprocess，Nanchang 330013，China）

Abstract： Interferon-γ （IFN-γ） is a kind of cytokine which is mainly produced by activated T cells and natural killer cells. It has the functions of antiviral， anti-tumor and immune regulation. Interferon is widely used in the diagnosis and treatment of diseases due to its important immune regulatory function. This article mainly summarized interferon-γin following aspects including the production， mechanism of action， biological activity， the relationship between gene polymorphisms and diseases， and interferon development， in order to provide insight into further studies of poultry interferon-γand its application in poultry production.

Key words： interferon-γ； gene polymorphism； disease resistance

20世紀(jì)30年代，許多病毒學(xué)家在研究兩種病毒感染同一宿主細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)存在兩種病毒相互拮抗的現(xiàn)象，由此提出了病毒間相互干擾的概念。當(dāng)Isaacs等[1]在1957年進行雞胚細(xì)胞流感病毒感染試驗時首次發(fā)現(xiàn)了一種能干擾和抑制病毒復(fù)制的細(xì)胞分泌物，故將其取名為“干擾素”。隨后的1970年又因發(fā)現(xiàn)γ干擾素具有更強的免疫調(diào)節(jié)功能將其命名為“免疫干擾素”。Lin等[2]研究發(fā)現(xiàn)，來自淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中存在一種IFN，但抗原性不同于以往發(fā)現(xiàn)的IFN，遂又將其區(qū)別于IFN-α和IFN-β等Ⅰ型IFN命名為Ⅱ型IFN。1980年國際干擾素委員會定義了干擾素，認(rèn)為干擾素是一類在同種細(xì)胞上具有抗病毒活性的蛋白質(zhì)，其活性的發(fā)揮又受細(xì)胞基因組的調(diào)節(jié)和控制，涉及RNA和蛋白質(zhì)的合成。IFN-γ主要由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，能夠激活巨噬細(xì)胞分泌抗炎癥因子、刺激MHCⅡ分子的表達，能夠促進B細(xì)胞分化、產(chǎn)生抗體及免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換[3，4]。自發(fā)現(xiàn)以來，干擾素的研究是細(xì)胞因子研究當(dāng)中最為活躍、進展最快的領(lǐng)域之一，也是分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)和腫瘤學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點[5]，同時畜禽干擾素-γ研究也備受關(guān)注。

1 干擾素-γ的誘生

干擾素是誘生蛋白，自然狀態(tài)下干擾素基因處于沉默狀態(tài)，只有經(jīng)過刺激后才表達。故將能使干擾素表達的物質(zhì)稱為“干擾素誘生劑”，常見的干擾素誘生劑包括以下四類：①病毒[6]、細(xì)菌等病原體；②細(xì)菌內(nèi)外毒素、放線菌酮等分泌物質(zhì)；③細(xì)菌脂多糖（LPS）、植物血凝素（PHA）、刀豆素（ConA）[7]等有絲分裂原；④人工合成的梯洛龍、聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸（PolyI：C）等藥物制劑[8]。

2 干擾素的作用機制

干擾素并不直接作用于效應(yīng)分子的基因上進行調(diào)控，而是通過受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)引發(fā)一系列的生化反應(yīng)，最終使效應(yīng)分子基因表達，即干擾素通過與細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合，引發(fā)級聯(lián)性的信號放大過程，并最終將信號傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，對系列相關(guān)基因的表達進行調(diào)控[9]。

INF作用于細(xì)胞的經(jīng)典JAK-STAT信號通路為，首先INF與細(xì)胞上的受體結(jié)合，與受體相聯(lián)的JAKs對STATS磷酸化，STATS中的特異酪氨酸殘基被JAKs磷酸化激活后，與磷酸化酪氨酸的Sre同源區(qū)2（SH2）相互作用形成同體或異體二聚體；然后STAT二聚體結(jié)合到基因的γ-激活序列（Gamma-activated sequence，GAS）上驅(qū)使臨近基因的表達；不同的GAS偏好不同的STAT二聚體建立特異性反應(yīng)；此外，STATI-2異體二聚體和STAT1同體二聚體都可以結(jié)合到一種干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factor，IRF）家族成員p48上，組成一個三體結(jié)構(gòu)物；STATI-2異體二聚體與p48結(jié)合而成的三體結(jié)構(gòu)稱INF激活的基因因子3（IFN-stimulated gene factor3，ISGF3），它同一個結(jié)構(gòu)上與GAS完全不同的IFN激活的調(diào)節(jié)序列（IFN-Stimulated regulatory elements，ISREs）結(jié)合[10-12]。endprint

繼JAK-STAT信號通路被發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)干擾素γ引發(fā)的各種細(xì)胞反應(yīng)后，研究人員在此基礎(chǔ)上獲得了一些新的發(fā)現(xiàn)，原來除了STAT1依賴途徑外，還有不依賴STAT1途徑，且兩種途徑在IFN-γ介導(dǎo)的各種生物學(xué)反應(yīng)達到平衡[13]。近年來有研究表明IFN-γ引發(fā)的信號通路除了JAK-STAT信號通路外，還有一些其他的物質(zhì)，諸如MAP激酶、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3-K）、鈣離子/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶（CaMKII）和核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（NF-κB）同樣參與了JAK-STAT信號通路，或者形成一些新的信號通路發(fā)揮作用[14，15]。

3 干擾素的生物學(xué)活性

Ⅰ型干擾素主要包括α型和β型，IFN-α及IFN-β共用同一類受體，對病毒感染進行免疫應(yīng)答并產(chǎn)生免疫抗體蛋白，而Ⅱ型干擾素只包含一種，即IFN-γ，其作用與Ⅰ型干擾素不同，除產(chǎn)生一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)外，還具有免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的功能，其抗病毒活性不是殺滅病毒而是抑制病毒的活性。因其既對DNA病毒有抑制作用又對RNA病毒有抑制作用，故將其稱為“廣譜病毒抑制劑”。除此之外，IFN-γ還可以與細(xì)胞外基質(zhì)相連的形式存在，通過旁鄰方式控制細(xì)胞的生長，進而起到抑制腫瘤生長的作用[16]。

3.1 抗病毒作用

抑制病毒的繁殖和生長是干擾素的基本功能之一，干擾素對高等生物的生存至關(guān)重要，因為它們?yōu)榭褂《镜那趾μ峁┝说谝坏婪谰€，比免疫反應(yīng)要早幾小時至幾天的時間。干擾素受體缺損的小鼠對病毒的感染特別敏感，由此可看出干擾素抗病毒作用的重要性。干擾素抗病毒具有廣譜性，但對細(xì)胞抗病毒作用是間接的，而且是非特異性的。當(dāng)干擾素與細(xì)胞表面的干擾素受體結(jié)合后，可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生有酶活性的抗病毒蛋白（AVP）。已知的AVP至少有3種，蛋白激酶、磷酸二酯酶和2-5A合成酶，前2種能破壞細(xì)胞核糖體轉(zhuǎn)譯病毒蛋白質(zhì)，后一種降解mRNA，有的AVP還能抑制轉(zhuǎn)錄酶的活性，阻止mRNA的形成，還有的能抑制病毒DNA和RNA的合成。因此可以說干擾素是通過AVP間接地抑制病毒復(fù)制而達到抗病毒作用的[17]。

3.2 干擾素抗腫瘤功能

研究表明MHC在腫瘤免疫方面起著重要作用，惡性腫瘤細(xì)胞常有MHC表達降低或丟失的現(xiàn)象。腫瘤細(xì)胞MHC抗原的丟失是腫瘤細(xì)胞逃避機體免疫監(jiān)視的原因之一。而近來研究發(fā)現(xiàn)INF能誘導(dǎo)細(xì)胞MHCⅠ、Ⅱ類抗原的表達，并能使MHC表達降低或丟失的惡性腫瘤細(xì)胞MHC表達增強，也可使MHC表達無降低或丟失的惡性腫瘤細(xì)胞的MHC表達進一步增強，從而增強腫瘤的免疫原性及T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別能力，增強對腫瘤抗原的提呈作用，激活機體免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞[18]。

IFN調(diào)節(jié)MHC表達主要在轉(zhuǎn)錄水平上，其可加速MHC轉(zhuǎn)錄過程，并增強其表達。Michael等[19]通過檢測去除IFN作用后轉(zhuǎn)錄下降速率、穩(wěn)定狀態(tài)下的mRNA水平及細(xì)胞膜表面蛋白表達水平的高低。證明IFN-γ誘導(dǎo)MHCⅡ類抗原表達主要是作用于轉(zhuǎn)錄水平，而不是轉(zhuǎn)錄后水平。因Ⅰ型干擾素及Ⅱ型干擾素受體不同，且對MHC啟動子的要求也不同，因而IFN對MHC的誘導(dǎo)表達作用有強弱。

3.3 IFN-γ的免疫調(diào)節(jié)作用

Ⅰ型干擾素可增強主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ（MHCⅠ）類分子表達，而強烈抑制MHCⅡ類分子表達，而Ⅱ型干擾素可促進MHCⅡ類分子表達，兩類干擾素的協(xié)同調(diào)節(jié)作用，使機體處于最佳免疫應(yīng)答狀態(tài)。此外INF-γ的生成可促進Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，而抑制Th2細(xì)胞的生成，由于Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞分別介導(dǎo)機體細(xì)胞免疫和體液免疫，因此 INF-γ可根據(jù)不同病原感染，與其他細(xì)胞因子（如IL-4等）共同作用對機體進行免疫干預(yù)，實現(xiàn)免疫系統(tǒng)防御功能[20]。

IFN-γ能刺激MHCⅠ及MHCⅡ表達上調(diào)，并通過抗原呈遞細(xì)胞（Antigen-presenting cells，APCs）提高抗原呈遞效率。除此之外，IFN-γ還參與淋巴細(xì)胞的成熟及分化過程。并且還能增強自然殺傷細(xì)胞的活力、調(diào)控B細(xì)胞分泌抗體[21]。

4 畜禽IFN-γ基因多態(tài)性與疾病發(fā)生的相關(guān)研究

有關(guān)人IFN-γ基因多態(tài)性方面的研究較多，而畜禽IFN-γ基因多態(tài)性與綜合抗病力報道較少，中國農(nóng)大張勤等人采用全基因組關(guān)聯(lián)性分析方法（Genome-wide association study，GWAS）對豬種的細(xì)胞活性因子及免疫球蛋白G等免疫相關(guān)性狀做了一系列的分析，其中包括利用豬SNP 60K芯片發(fā)現(xiàn)了62 163個單核苷酸多態(tài)性位點（Single nucleotide polymorphism，SNP），接著采用單個位點回歸模型篩選出了46 079個單核苷酸多態(tài)性位點。最后找出了與免疫性狀相關(guān)的32個顯著性SNP位點，其中與IFN-γ水平顯著性相關(guān)的SNP 有6個，17個SNP位于之前報道過的免疫相關(guān)QTL（Quantative Trait Loci）區(qū)域，此項研究為探究影響豬免疫力性狀的因果突變位點奠定了基礎(chǔ)[22]。此外該課題組還發(fā)現(xiàn)IRF1（Interferon regular factor 1）及IRF2基因的SNP與血清中IFN-γ的表達量顯著相關(guān)，認(rèn)為其是與豬免疫力性狀相關(guān)的候選基因[23，24]。

王大力等[25]采用PCR-SSCP技術(shù)和最小二乘法對豬IFN-γ基因多態(tài)性及部分免疫指標(biāo)進行了關(guān)聯(lián)分析，其試驗結(jié)果顯示，豬IFN-γ基因的內(nèi)含子1內(nèi)T825C位點多態(tài)性對血清IgG含量有著顯著影響，且3種基因型間AB-型要高于AA-型，并達到了顯著水平，BB-型高于AA-型但差異不顯著；而T2370C位點對Ig M含量的影響CC-型顯著高于CD-型和DD-型；G5301A位點多態(tài)性對IgG含量的影響EE-型顯著高于EF-型。云南農(nóng)業(yè)大學(xué)冀斌[26]對紅原雞IFN-γ啟動子多態(tài)性及MHC單倍型對禽流感免疫效果的影響進行了研究。研究表明該實驗所取的兩類基因均有豐富的多態(tài)性，其中IFN-γ-316A/G基因型與高致病性禽流感病毒HPAIV特異性抗體水平存在關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示A等位基因攜帶個體可能具有較強的HPAIV抗病力。endprint

5 畜禽干擾素-γ開發(fā)的相關(guān)研究

目前國內(nèi)外對于畜禽干擾素開發(fā)應(yīng)用研究主要是利用基因工程的技術(shù)手段構(gòu)建表達載體，并導(dǎo)入受體細(xì)胞或者基因工程菌中以獲得其蛋白產(chǎn)物作疫苗佐劑用，下面主要以豬、雞、鴨干擾素研究為例進行闡述。

5.1 豬干擾素-γ開發(fā)

中國是世界養(yǎng)豬大國，在豬的養(yǎng)殖過程中易受流感病毒、口蹄疫病毒等的感染，使養(yǎng)殖業(yè)遭受巨大的損失，因此開發(fā)出高效的干擾素疫苗是當(dāng)務(wù)之急。潘曉梅等[27，28]將豬IFN-γ基因克隆至原核表達載體pET-30a，構(gòu)建PET-30a-pIFN-γ重組表達載體，導(dǎo)入寄主菌BL21（DE3）后用IPTG誘導(dǎo)表達，將表達后產(chǎn)物使用鎳親和層析柱純化，純化后的產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE及Western blot分析證實為高純度的重組pIFN-γ，經(jīng)過一系列生物活性實驗發(fā)現(xiàn)重組pIFN-γ能有效抑制偽狂犬病毒和口蹄疫病毒的復(fù)制，并在高濃度時可誘導(dǎo)傳代細(xì)胞凋亡。趙偉鴿等[29，30]采用同樣的技術(shù)路線純化獲得了高純度重組IFN-γ蛋白。其研究為豬IFN-γ相關(guān)的基因工程生物制品的開發(fā)奠定了可靠的基礎(chǔ)。

雖然IFN-γ干擾素疫苗在對抗病毒方面取得了一定的效果，但畢竟其抗病毒能力不及IFN-α及IFN-β，故Kim等[31]將豬α干擾素及γ干擾素基因一起剪接到腺病毒DNA上形成能夠分泌α干擾素及γ干擾素的重組腺病毒，此法得到的重組腺病毒能快速、高效獲得干擾素蛋白以對抗手足口病病毒的感染。

5.2 禽類干擾素的開發(fā)

近年來禽流感蔓延世界各地，不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失，而且還威脅人的生命。因此研發(fā)高效的禽類干擾素是未來干擾素開發(fā)的發(fā)展方向?？v觀國內(nèi)外禽類干擾素的開發(fā)，主要集中在雞和鴨的干擾素上，對重組鴨IFN-γ的生物活性分析顯示，其對機體的刺激作用遠遠低于重組雞IFN-γ的作用，僅為其活性的1/16，造成刺激作用差別如此之大的具體原因尚未知，推測可能與干擾素的結(jié)構(gòu)和作用機制有關(guān)[32]。

目前重組干擾素-γ在雞和鴨中抗病毒研究效果很好，Sawant等[33]將雞IFN-γ基因及IL-4（interleukin-4）基因連接到pVIVO2載體上，然后通過RT-PCR體外檢測IFN-γ基因及IL-4（interleukin-4）基因的表達，將重組DNA導(dǎo)入到雞受體細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生對抗新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）的抗體。而且IFN-γ基因重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后細(xì)胞免疫反應(yīng)增強。

當(dāng)前鴨IFN-γ的主要應(yīng)用體現(xiàn)在對鴨乙型肝炎病毒和H11N9 AIV的防治上。鴨IFN-γ具有較好的治療鴨乙型肝炎治療效果，且鴨肝炎治療模型有著作為人類乙肝治療模型的開發(fā)潛力。Saade等[34]為提高基因疫苗的效力，將IL-2及IFN-γ兩種細(xì)胞活性因子基因分別連接到質(zhì)粒上與DHBV疫苗混合后后將其注射到新生鴨體內(nèi)，在第21周的時候發(fā)現(xiàn)注射了鴨IFN-γ的新生鴨乙肝病毒數(shù)明顯減少，并且注射了鴨IFN-γ及IL-2的鴨子分別有57%和25%個體已經(jīng)檢測不到病毒DNA的存在了。研究者由此得出結(jié)論IFN-γ基因與DNA疫苗共同作用可以提高疫苗的效力，有助于對抗鴨乙型肝炎病毒。

研究人員通過克隆分析鴨IFN-γ基因序列，發(fā)現(xiàn)鴨與雞的IFN-γ核苷酸序列有著80%的同源性，而與其他哺乳動物的同源性只有21%～34%，這說明了禽類γ-干擾素基因有效編碼區(qū)是高度保守的，為今后制備通用型的禽類Ⅱ型干擾素提供了基礎(chǔ)條件[35]。

6 展望

目前國內(nèi)外學(xué)者對畜禽干擾素-γ的各種機理及其在畜禽抗病中的應(yīng)用開展了許多卓有成效的研究，但目前尚未真正揭示畜禽干擾素-γ的作用機理，畜禽干擾素-γ在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用也尚需時日。但隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，尤其是現(xiàn)代組學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)等新型技術(shù)的使用，相信畜禽干擾素-γ的各種機理將得到很好地解析，同時結(jié)合現(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù)的使用也必將使畜禽干擾素-γ造福于畜禽生產(chǎn)實踐。

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