柴繼寬,趙桂琴,孟麗娟
(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州730070)
紅三葉(Trifoliumpratense)是豆科蝶形花亞科三葉草屬多年生草本植物,又名紅車軸草、紅花荷蘭翹搖、金雀菜等[1],壽命較長(zhǎng),一般可以生存5~8年,甚至10年以上[2]。紅三葉草質(zhì)柔軟,葉量豐富,品質(zhì)優(yōu)良,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,各種家畜均喜食[3]。此外,紅三葉也因含有大量的異黃酮等物質(zhì)而頗受保健品和醫(yī)藥產(chǎn)品市場(chǎng)的青睞[4]。
我國(guó)紅三葉種質(zhì)資源比較匱乏,野生種僅見于新疆、貴州、云南等地[5]。上世紀(jì)70年代從美國(guó)、新西蘭和歐洲引進(jìn)了一批紅三葉優(yōu)良品種,目前在生產(chǎn)中使用的已經(jīng)很少。我國(guó)在紅三葉方面的研究主要側(cè)重于栽培技術(shù)[6],營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[7],轉(zhuǎn)基因[8],異黃酮含量[9]以及高富硒能力[10]等方面。有關(guān)刈割時(shí)間、次數(shù)[11]對(duì)紅三葉再生草生物學(xué)特性的影響以及施氮、磷肥和緩釋復(fù)合肥[12]對(duì)紅三葉營(yíng)養(yǎng)元素含量、草產(chǎn)量和品質(zhì)效應(yīng)方面的報(bào)道也比較多。
到目前為止,通過全國(guó)草品種審定委員會(huì)等級(jí)的紅三葉品種只有4個(gè),且都是地方品種。生產(chǎn)中使用的紅三葉品種主要來自國(guó)外。對(duì)引進(jìn)品種的深入研究是進(jìn)一步利用的基礎(chǔ)。由于地域差異,引進(jìn)種質(zhì)有時(shí)會(huì)表現(xiàn)出優(yōu)異的特性[13],但受環(huán)境條件的影響比較大。同一基因型在不同環(huán)境條件下表現(xiàn)不同,而相同的表型又可能具有不同的基因型[14]。紅三葉是異花授粉植物,單純通過表型性狀來研究其遺傳關(guān)系以及進(jìn)行種質(zhì)篩選,可靠性比較低。在研究多樣性時(shí),不僅要分析形態(tài)特征如外觀、葉型、株高、莖色、熟期等方面的差異,還需要分析其遺傳背景。因此,應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)尤其是分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)紅三葉的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行研究顯得尤為重要。
通過分子標(biāo)記不僅可以了解到植物遺傳背景信息,還可以深入研究其遺傳多樣性,可靠性比較高[15]。ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)分子標(biāo)記技術(shù)是一種基于PCR的新興DNA分子標(biāo)記技術(shù)。與其他分子標(biāo)記相比,ISSR分子標(biāo)記具有很大的優(yōu)越性,如試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、成本低、快速靈敏、穩(wěn)定性高、所需DNA量少等[16-17],而且不需要預(yù)先知道研究對(duì)象的基因組序列,大大減少了多態(tài)性分析的預(yù)備工作。近年來,ISSR分子標(biāo)記在牧草種質(zhì)資源的鑒定與評(píng)價(jià)中已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用。在苜蓿(MedicagoSativa)[18]、羊茅(FestucaOvina)[19]、雀麥屬(Bromus)[20]和鴨茅(Dactylis)[21-22]等種質(zhì)資源遺傳多樣性研究方面均有報(bào)道。三葉草方面的研究主要集中于白三葉。Sharmas等[23]利用形態(tài)學(xué)和RAPD分子標(biāo)記對(duì)引進(jìn)白三葉品種遺傳多樣性進(jìn)行了分析;George等[24]利用SSR標(biāo)記檢測(cè)了不同產(chǎn)地白三葉品種的遺傳多樣性。國(guó)內(nèi)李潤(rùn)芳[25]等、張婧源[26]等利用SRAP技術(shù)對(duì)白三葉種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行了研究。紅三葉方面,Dias等[27]利用形態(tài)學(xué)和SSR分子標(biāo)記對(duì)來自35個(gè)國(guó)家的80份紅三葉的遺傳多樣性進(jìn)行了分析;Camposs等[28]利用RAPD分子標(biāo)記對(duì)4組紅三葉優(yōu)異親本材料遺傳多樣性進(jìn)行了分析;Herrmann等[29]對(duì)紅三葉AFLP反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化并對(duì)紅三葉野生種和栽培種的遺傳多樣性做了分析;Paplauskiene等[30]利用ISSR-PCR分子標(biāo)記研究紅三葉品種的遺傳變異。目前國(guó)內(nèi)利用ISSR標(biāo)記研究紅三葉遺傳多樣性尚未見報(bào)道。
本研究擬利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù),從DNA分子水平上分析31份國(guó)外引進(jìn)紅三葉種質(zhì)間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性狀況,旨在為紅三葉種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)及合理利用提供科學(xué)依據(jù)。
試驗(yàn)材料為來自俄羅斯、加拿大和美國(guó)的31份紅三葉種質(zhì)材料(表1),均按10m2(2m×5m)的小區(qū)種植于甘肅省中部的榆中縣良種場(chǎng);于分枝期取樣,每份材料隨機(jī)取30個(gè)單株,從每個(gè)單株上采集基部剛展開的新葉2~3片,置于-80℃冰箱內(nèi)保存。
采用改良的CTAB法[31]提取紅三葉葉片總DNA,用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量,并用Gene Spec核酸檢測(cè)儀檢測(cè)DNA質(zhì)量濃度。最后將樣品稀釋為20ng·μL-1,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
表1 試驗(yàn)材料及來源Table 1 The materials and their source
基于ISSR 標(biāo)記在苜蓿[18]、扁蓄豆(Pocockia ruthenia(L.)Boiss.)[32]、豬屎豆(Crotalariamucronata)[33]等豆科植物的研究報(bào)道。本研究ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)提供的100個(gè)ISSR引物序列,選出20個(gè)引物進(jìn)一步篩選用于紅三葉ISSR-PCR反應(yīng),由上海生物工程有限公司合成。
利用正交設(shè)計(jì),從4個(gè)水平上對(duì)影響ISSRPCR反應(yīng)體系的主要因素(Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、引物)進(jìn)行篩選與優(yōu)化,建立了重復(fù)性好、反應(yīng)穩(wěn)定的紅三葉ISSR-PCR反應(yīng)體系。即25μL反應(yīng)體系中,包含40ng模板DNA,10×PCR-buffer 2.5μL,2.5mmol·L-1Mg2+,2.5U Taq DNA聚合酶,引物1μmol·L-1,0.2mmol·L-1dNTP。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,引物退火30s,72℃延伸1min,循環(huán)35次;72℃延伸7min,4℃保存。
PCR擴(kuò)增完成后,取8μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.7%的瓊脂糖凝膠上電泳,用DM2000作標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照,在1×TBE緩沖液中電泳約1h(電壓為100 V),檢測(cè)后置于UVP紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照。
根據(jù)電泳圖譜中清晰可辯的擴(kuò)增條帶在同一位置上的有無記數(shù),有記為“1”,無記為“0”,統(tǒng)計(jì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶總數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)。計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)比率P=i/j×100%,式中i為多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)目,j為統(tǒng)計(jì)出的位點(diǎn)總數(shù)。用POPGEN1.32軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)、Nei基因多樣性指數(shù)(H)、有效等位基因數(shù)(Ne)和Shannon多樣性信息指數(shù)(I)。用軟件NTYSYS-PC 2.10e計(jì)算遺傳相似系數(shù)(genetic similarity)GS=2Nij/(Ni+Nj),式中,Ni和Nj分別為i和j兩材料的擴(kuò)增條帶數(shù),Nij為i和j兩材料共有的擴(kuò)增條帶數(shù)。根據(jù)GS值按非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(UPMGA)進(jìn)行聚類分析,建立聚類圖。
將提取的31個(gè)供試材料的基因組DNA的質(zhì)量進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果如圖1所示。31份紅三葉種質(zhì)的基因組DNA都呈現(xiàn)清晰、可辨譜帶,無降解現(xiàn)象,無彌散的熒光出現(xiàn),加樣孔清晰,同時(shí)無RNA和其他非特異性DNA片段污染,因此保證了供試材料DNA進(jìn)行ISSR分析的有效性和準(zhǔn)確性。
圖1 31個(gè)紅三葉品系基因組DNA電泳圖Fig.1 Electrophoresis of genetic DNA for 31red clover accessions
利用兩個(gè)表型差異較大的材料對(duì)20個(gè)ISSR引物進(jìn)行篩選,淘汰擴(kuò)增效果差、帶型不易辨認(rèn)的引物,最終篩選出5個(gè)條帶清晰、穩(wěn)定性和重復(fù)性好且相對(duì)條帶較多的引物(表2)。利用這5個(gè)引物對(duì)所有31份紅三葉種質(zhì)基因組DNA進(jìn)行ISSR擴(kuò)增,共擴(kuò)增出61個(gè)DNA片段,其中多態(tài)性帶58個(gè),多態(tài)性比率高達(dá)95.08%。單條引物擴(kuò)增出的清晰條帶數(shù)在8~20條之間,平均每條引物擴(kuò)增出11.6條多態(tài)性條帶,其中引物850最多擴(kuò)增出20條多態(tài)性條帶;引物848最少能擴(kuò)增出4條多態(tài)性條帶。擴(kuò)增出的DNA片段集中在150~2000bp之間。其中,多態(tài)性百分率最高的為引物849,850和851,均為100%;最低的為引物841,為75%??梢奍SSR檢測(cè)紅三葉種質(zhì)資源遺傳多樣性的效率很高,也表明紅三葉種質(zhì)在分子水平上的遺傳多樣性是比較豐富的。引物851對(duì)31份紅三葉種質(zhì)基因組DNA的擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。
表2 供試材料的ISSR引物及擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Primers used in ISSR and amplification results of tested materials
圖2 UBC851對(duì)31份紅三葉種質(zhì)的ISSR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The amplification result of UBC851ISSR marker
等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon多樣性信息指數(shù)(I)和Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)都是衡量遺傳多樣性水平的常用指標(biāo)。有效等位基因數(shù)(Ne)和Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)是目前應(yīng)用較為廣泛的遺傳多樣性指數(shù),具有明顯的遺傳學(xué)意義。Shannon多樣性信息指數(shù)(I)本身沒有遺傳學(xué)意義,但方便與同類研究進(jìn)行比較[34]。通過 POPGENE1.32軟件分析,結(jié)果表明,31份紅三葉種質(zhì)材料的平均Na,Ne,H和I值分別為1.9508,1.3162,0.2092 和0.3427(表3)。
表3 31份紅三葉種質(zhì)材料遺傳多樣性指數(shù)Table 3 Genetic diversity indexes of 31red clover germplasm
遺傳相似系數(shù)是用來比較群體或個(gè)體間相似程度的度量參數(shù),遺傳相似系數(shù)值越大,說明材料間相似程度越大,遺傳背景一致性越強(qiáng)[35]。利用5個(gè)引物產(chǎn)生的標(biāo)記信息,經(jīng)POPGENE1.32分析軟件計(jì)算31份紅三葉種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)(GS),得到供試材料相似系數(shù)矩陣(表4)。遺傳相似系數(shù)值越大,說明材料間的親緣關(guān)系越近,反之,親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。由表4可知,31份紅三葉種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)在0.5902~0.9344之間,平均遺傳相似系數(shù)為0.7840。從表4可以看出,1號(hào)和2號(hào)、5號(hào)和6號(hào)、17號(hào)和18號(hào)種質(zhì)之間的遺傳相似系數(shù)最大(0.9344),說明他們之間的親緣關(guān)系最近,遺傳差異相對(duì)較??;16號(hào)和31號(hào)之間的遺傳相似系數(shù)最?。?.5902),說明二者的親緣關(guān)系最遠(yuǎn),遺傳差異相對(duì)較大。
表4 ISSR標(biāo)記的31份紅三葉材料之間的遺傳相似系數(shù)Table 4 Genetic similarity coefficient of 31red clover germplasm based on ISSR
為了確定各供試材料間的遺傳關(guān)系,通過NTSYS-PC 2.10e軟件,以31份紅三葉種質(zhì)材料和61個(gè)位點(diǎn)的譜帶數(shù)為原始矩陣,利用非加權(quán)平均距離法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析,構(gòu)建31個(gè)紅三葉種質(zhì)間的遺傳關(guān)系聚類圖(圖3)。從圖3可以看出,供試材料以遺傳相似系數(shù)0.806為閾值可以將31份紅三葉種質(zhì)聚為5類。第Ⅰ類由來自俄羅斯的10份紅三葉種質(zhì)材料組成;第Ⅱ類包括11份種質(zhì)材料,其中有來自俄羅斯的9份種質(zhì)和加拿大的2份種質(zhì);第Ⅲ類由來自加拿大的2份紅三葉種質(zhì)組成;第Ⅳ類是來自加拿大的24號(hào)種質(zhì);第Ⅴ類包括7份種質(zhì)材料,包括加拿大的2份種質(zhì)和美國(guó)的5份種質(zhì)。
遺傳多樣性是生物所攜帶的遺傳信息總和,是每種生物所固有的特性,也是其生存、發(fā)展和進(jìn)化的基礎(chǔ)[36]。一個(gè)種群遺傳多樣性越高或越豐富,在環(huán)境發(fā)生變化時(shí)生存下來的可能性就越大,越容易擴(kuò)展其分布范圍和開拓新環(huán)境,可見物種或種群進(jìn)化潛力和適應(yīng)環(huán)境的能力取決于遺傳多樣性的大?。?7]。分子標(biāo)記能從DNA水平上檢測(cè)遺傳變異,是進(jìn)行物種遺傳多樣性、分類和親緣關(guān)系分析等方面研究的有力工具。ISSR標(biāo)記是一種基于PCR的分子標(biāo)記,結(jié)合了RAPD標(biāo)記技術(shù)和SSR標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),大多為顯性標(biāo)記,符合孟德爾遺傳規(guī)律,多態(tài)性很高,而且引物具有通用性,可以在多種植物中通用[38-39],是一種重復(fù)性好、效率高的分子標(biāo)記,近年來在遺傳多樣性分析領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[40-41]。ISSR比RAPD能檢測(cè)到更多的信息位點(diǎn),更適用于紅三葉的遺傳多樣性分析。本研究利用ISSR技術(shù)對(duì)31份紅三葉種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行分析,從20條ISSR引物中篩選出5條多態(tài)性高、反應(yīng)穩(wěn)定的引物,共擴(kuò)增出61條帶,平均每條引物能擴(kuò)增出12.2條帶,其多態(tài)位點(diǎn)百分率(P)高達(dá)95.08%,Shannon信息指數(shù)(I)為0.3427,有效等位基因數(shù)(Ne)為1.3162,Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)為0.2092,都反映出紅三葉種質(zhì)很高的遺傳多樣性。
圖3 31份紅三葉種質(zhì)基于ISSR的遺傳相似性UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA cluster analysis based on ISSR genetic identities among 31red clover germplasm
從相似系數(shù)看,31份紅三葉種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)分布在0.5902~0.9344之間,表明紅三葉的遺傳多樣性是比較豐富的,這與Ulloa等[42]利用RAPD標(biāo)記技術(shù)的研究結(jié)果相似。這種多態(tài)性將為紅三葉種質(zhì)資源異地保存、鑒定、適應(yīng)性評(píng)價(jià)以及生態(tài)型研究奠定可靠、穩(wěn)定的基因基礎(chǔ)。基于ISSR標(biāo)記,31份紅三葉種質(zhì)材料以遺傳相似系數(shù)0.806為分類界限,可以聚為5大類。從聚類圖上看,大多數(shù)來源地相同的紅三葉種質(zhì)資源聚在一起,如第Ⅰ類的材料全部來自加拿大,說明其親緣關(guān)系較近;李紅等[43]在研究苜蓿遺傳多樣性時(shí)也得到了相似的結(jié)論,即來自不同地區(qū)的種質(zhì),大部分可按地理來源聚為一類。但也存在部分同一來源地的種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)差異較大無法聚為一類的情況,如來自加拿大的24號(hào)種質(zhì)材料單獨(dú)聚為一類。與其他種質(zhì)材料的遺傳距離較遠(yuǎn),這與其獨(dú)特的表型相符,24號(hào)種質(zhì)材料具有葉片大、再生速度快、干草產(chǎn)量高等優(yōu)異特性。
作者對(duì)31份紅三葉種質(zhì)的形態(tài)特征和農(nóng)藝性狀也進(jìn)行了研究[44],發(fā)現(xiàn)來自美國(guó)的材料葉片大、節(jié)間長(zhǎng)、干草產(chǎn)量高、再生速度快、種子千粒重;俄羅斯的種質(zhì)普遍分枝數(shù)多、葉片小、節(jié)間短、干草產(chǎn)量較低、種子也較小。根據(jù)形態(tài)特征的聚類結(jié)果把31個(gè)紅三葉種質(zhì)分成4類,表現(xiàn)優(yōu)良的23號(hào)和24號(hào)種質(zhì)聚為同一類。ISSR分子標(biāo)記將31份紅三葉種質(zhì)在遺傳相似系數(shù)0.806處聚為5類,24號(hào)種質(zhì)材料單獨(dú)聚為一類,與其他材料遺傳距離較遠(yuǎn)。雖然兩種聚類分析都可將大部分地理來源相近的種質(zhì)聚在一起,但I(xiàn)SSR標(biāo)記聚類的結(jié)果與基于形態(tài)特征聚類的結(jié)果仍然存在一些差別。這可能是由于ISSR標(biāo)記體現(xiàn)的是種質(zhì)材料間分子水平上的差異,而表型性狀的差異是基因與環(huán)境共同作用的結(jié)果,因此,檢測(cè)出的遺傳差異并不都與所觀測(cè)的表型差異相一致。作為傳統(tǒng)分類的補(bǔ)充,ISSR分子標(biāo)記可減少由形態(tài)描述和環(huán)境條件產(chǎn)生的誤差,從分子水平鑒定種質(zhì)資源之間的差異[45],不受取材、時(shí)間及人為等因素的影響[46],更容易把不同的種質(zhì)材料區(qū)分開。因此,ISSR標(biāo)記在一定程度上能更本質(zhì)地反映出紅三葉種質(zhì)資源間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。在實(shí)際應(yīng)用中可將ISSR分析結(jié)果直接應(yīng)用于品種選育,選擇遺傳距離較大、親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的材料做親本,以增加后代的遺傳重組,提高雜種優(yōu)勢(shì)。