20個高羊茅品種鎘耐性評價及富集特征

王寶媛，濮陽雪華，宋桂龍＊，周述瓊，趙克奇，蔣 凱

（1.北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所，北京100083；2.深圳市鐵漢生態(tài)環(huán)境股份有限公司，深圳518040）

生活垃圾、化肥和農(nóng)藥的使用以及化工、醫(yī)藥、 制造及開采業(yè)的發(fā)展等，造成了土壤重金屬的污染［1］。鎘是化學(xué)活性和生物毒性較強(qiáng)的重金屬元素，長期存留在土壤中，極易被植物吸收積累進(jìn)入食物鏈，是對人類健康威脅最嚴(yán)重的重金屬之一［2］。因此必須采取有效的技術(shù)和措施將其固定或提取。植物修復(fù)具有成本低、可持續(xù)和原位無污染等特點，是治理鎘污染土壤的重要手段。但是現(xiàn)有的鎘超富集植物普遍存在生物量小，繁殖性差等缺點，很難在鎘污染地治理的實際中應(yīng)用。因此，抗鎘、富集鎘、生物量大、可多次收獲的植物材料對于生態(tài)修復(fù)尤為重要。

高羊茅（Festucaarundinacea）作為優(yōu)良的冷季型草坪草，生物量較大，可多次修剪，觀賞性強(qiáng)，對重金屬有一定的吸收和耐受能力，為其用于修復(fù)重金屬污染的土壤以及恢復(fù)土壤生態(tài)系統(tǒng)的自凈功能提供了可能［3］。相關(guān)研究表明，植物在耐受和富集重金屬能力上，不僅表現(xiàn)出顯著的種間差異，也表現(xiàn)出了顯著的種內(nèi)差異即基因型差異［4］。研究發(fā)現(xiàn)不同高羊茅品種在Cd2+脅迫下，植株生物性狀指標(biāo)與生理指標(biāo)變化程度均存在很大差異［5］，相對存活率也存在顯著差異［6］，說明不同品種的抗性能力和抗性機(jī)制存在差異。基于此，本文采用溫室水培試驗法，對Cd2+脅迫下20個高羊茅品種的形態(tài)及生理指標(biāo)變化進(jìn)行綜合評價，并測量其Cd2+累積量，旨在篩選出對重金屬鎘吸收和耐受能力較好的品種，從而為進(jìn)一步研究高羊茅的耐鎘機(jī)理和高羊茅在生態(tài)修復(fù)實踐中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以國內(nèi)收集到的20個高羊茅品種（表1）為試驗材料。品種發(fā)芽率為90%～95%，純度為95%～98%。

1.2 試驗設(shè)計

育苗基質(zhì)采用蛭石和草炭以1∶1比例混合，種子萌發(fā)7d后，將長勢一致的幼苗用去離子水反復(fù)清洗，移入到裝有1/2Hoagland營養(yǎng)液的水培容器（44cm×33cm×21cm的塑料箱）中，適應(yīng)7d后進(jìn)行Cd2+處理，Cd2+濃度為10μM（以CdCl2·2.5 H2O形態(tài)加入），處理30d后收獲。營養(yǎng)液用0.1 M NaOH或0.3MHCI調(diào)節(jié)pH為弱酸性（5.8～6.0）。處理設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)30株，每7d換一次營養(yǎng)液。試驗于溫室內(nèi)進(jìn)行，溫室條件為：白天/黑夜溫度為25/20°C，相對濕度60%～70%，光照/黑暗時間為14/10h。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 株高與根長的測定 高羊茅根系用20 mmol·L-1Na2-EDTA溶液浸泡30min，然后用蒸餾水沖洗數(shù)次，測量株高和根長，每個處理下不同品種各測10次重復(fù)，取平均值。

1.3.2 生物量的測定 高羊茅根系用20mmol·L-1Na2-EDTA溶液浸泡30min，用蒸餾水沖洗數(shù)次后將其根系和莖葉分離，烘箱105℃殺青半小時，65℃烘至恒重，分別稱量莖葉干重與根系干重，每個處理下不同品種各測10次重復(fù)，取平均值。

1.3.3 光合色素含量的測定 根據(jù)張志良的方法［7］，稍有改動。稱新鮮葉片0.05～0.08g，記下具體質(zhì)量，剪碎后置于離心管中，加入8mL 95%的乙醇，室溫下避光靜置48h；于665nm，649nm，470 nm測定其吸光值。

根據(jù)公式計算：

1.3.4 Cd2+含量的測定 烘干樣使用粉碎機(jī)粉碎，過60 目（0.3mm）篩后稱重 0.50g，采取HNO3-HClO4（4+1）混合酸濕法消化，使用儀器為Hanon220s石墨消解儀，消化完全后定容于25mL容量瓶，采用原子吸收分光光度計（Varian Spectrum AA220）火焰吸收法測定Cd2+含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

考查植物在逆境脅迫下的耐受能力，通常用到的參數(shù)是耐性指數(shù)，一般情況下，是處理組的株高或根長與對照組株高或根長的比值。耐性指數(shù)越高表明植物耐受能力就越強(qiáng)，反之越弱。計算公式如下：

耐性指數(shù)=處理值/對照值［8］

隸屬函數(shù)值計算公式［9］：

反隸屬函數(shù)值計算公式

式中Xi為指標(biāo)測定值，Xmin，Xmax為所有參試材料某一指標(biāo)的最小值和最大值。

“眼睛周圍的藍(lán)色當(dāng)然是因為涂藍(lán)色眼影而已啊?！鄙玳L說，“這題的答案只分正常和不正常兩種，涂藍(lán)色眼影之外的答案都是不正常?！?/p>

用Microsoft Excel 2013記錄所有數(shù)據(jù)，制作相關(guān)圖表，SPSS 20.0進(jìn)行方差、相關(guān)和聚類等分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd2+處理下20個高羊茅品種耐性差異

為了更加準(zhǔn)確地顯示高羊茅對鎘脅迫的耐受能力，將與逆境脅迫處理相關(guān)的株高、根長、生物量（根系和地上部）和光合色素含量（葉綠素和類胡蘿卜素）等指標(biāo)相應(yīng)的耐性指數(shù)一一計算、整合，用以綜合評價不同品種高羊茅對鎘脅迫的耐受能力，同時對各個指標(biāo)的耐性指數(shù)加以排序，具體結(jié)果如表2所示。

表2 Cd2+處理下20個高羊茅品種6個指標(biāo)的耐性指數(shù)Table 2 Tolerance index for six indicators of tall fescue varieties under Cd2+stress

2.1.1 Cd2+脅迫下20個高羊茅品種株高與根長差異Cd2+脅迫下20個品種的株高變化如圖1（A）所示。在10μM Cd2+濃度下，20個高羊茅品種的株高均受到了顯著抑制（P＜0.05），其中18號受抑制最嚴(yán)重，僅為對照的48.94%。由表2可知，株高的耐性指數(shù)差異性較明顯，范圍在0.490～0.905之間，15號植株長勢相對較好，其耐性指數(shù)最大為0.905，5號次之。

圖1（B）顯示20個高羊茅品種的根系長度均受到顯著抑制（P＜0.05），抑制長度范圍為13.90～24.37cm，其中耐性指數(shù)較高的品種為2號和5號，分別是0.533和0.450，12號根長受抑制最嚴(yán)重，耐性指數(shù)僅為0.185，降幅達(dá)到85.51%。

從植株整體看，株高抑制程度低于根系，且表現(xiàn)出地上地下抑制的一致性，如5號在株高和根長上表現(xiàn)均較好，12號根系和株高抑制都很嚴(yán)重，但也有個別品種表現(xiàn)出根系抑制明顯，而地上抑制較輕，如15號、19號、20號。從株高和根長來看，5號耐性最好，12號最為敏感。

圖1 Cd2+處理對不同高羊茅品種株高和根長的影響Fig.1 Effect of Cd2+treatment on shoot and root length of different tall fescue varieties

圖2 Cd2+處理對不同高羊茅品種地上生物量和地下生物量的影響Fig.2 Effect of Cd2+treatment on above ground and under ground biomass of different tall fescue varieties

2.1.2 Cd2+脅迫下20個高羊茅品種生物量差異 20個高羊茅品種Cd2+處理下地上生物量（A）和地下生物量（B）差異如圖2所示。由圖2（A）可知，Cd2+脅迫下，20個高羊茅品種地上生物量均有一定程度的下降，耐性指數(shù)差異較大，下降幅度范圍為3.8%～64.8%，其中15號耐性最好，耐性指數(shù)達(dá)到0.962，與對照組差異不顯著，8號次之，而3號受抑制比較明顯，耐性指數(shù)僅為0.352。

如圖2（B）所示，根系生物量最大的是8號，耐性指數(shù)為0.952，與對照組差異不顯著。其他品種均顯著降低（P＜0.05），12號受到明顯抑制，降幅達(dá)到81.3%。僅從單個植株生物量來看，8號對Cd2+的耐性最強(qiáng)，3號和12號則比較敏感。

2.1.3 Cd2+脅迫下20個高羊茅品種光合色素差異 由圖3可知，與對照組相比，20個高羊茅品種葉綠素含量和類胡蘿卜素含量均表現(xiàn)出一定程度的降低，下降幅度分別在0.57%～48.2%和2%～37.5%之間。Cd2+處理對12號葉綠素含量的影響最小，耐性指數(shù)達(dá)到0.943。7號和10號的類胡蘿卜素含量與對照無顯著差異，表現(xiàn)較好，16號耐性指數(shù)最低，只有0.625。

圖3 Cd2+處理對不同高羊茅品種葉綠素含量和類胡蘿卜素含量的影響Fig.3 Effect of Cd2+treatment on chlorophyll content and carotenoid content of different tall fescue varieties

2.2 Cd2+處理下各指標(biāo)耐性指數(shù)的隸屬函數(shù)值

20個高羊茅品種在生長和生理指標(biāo)上對Cd2+脅迫響應(yīng)差別很大，很難用某一指標(biāo)評價其耐鎘性。為了全面且精確地評價高羊茅對Cd2+脅迫的耐受能力，通過模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)對20個高羊茅品種的6個指標(biāo)的耐性指數(shù)的隸屬函數(shù)值進(jìn)行綜合評價，結(jié)果如表3所示，品種8號耐性最強(qiáng)，2號次之，16號最弱。

表3 不同高羊茅品種耐性指數(shù)的隸屬函數(shù)值及綜合排序Table 3 Subordinate function values of tolerance index and comprehensive ranking of tall fescue varieties

20個品種耐性指數(shù)的隸屬函數(shù)值相關(guān)性分析結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，各指標(biāo)耐性指數(shù)的隸屬函數(shù)值與總隸屬函數(shù)值均表現(xiàn)為極顯著相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.769＊＊，0.664＊＊，0.774＊＊，0.716＊＊，0.587＊＊，0.686＊＊。因此，以下6個指標(biāo)對于耐鎘強(qiáng)弱的篩選均有意義。

表4 Cd2+處理下不同高羊茅品種耐性指數(shù)的隸屬函數(shù)值的相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficients of subordinate function values of tolerate index of different tall fescue varieties under Cd2+treatment

2.3 20個高羊茅品種Cd2+吸收特征

2.3.1 Cd2+吸收量 20個高羊茅品種Cd2+濃度和累積量如表5所示。20個高羊茅品種地上部和根系都富集了不同濃度Cd2+，且地上部Cd2+濃度均大于100mg·kg-1，其中最高濃度為150.97mg·kg-1。此外，根系Cd2+濃度最高值為290.69mg·kg-1。冠根濃度比（S/R，地上與地下部Cd2+濃度比）顯示了Cd2+由根系向地上部轉(zhuǎn)運的能力。20個高羊茅品種的冠根濃度比范圍在0.43～0.73之間，可見不同品種對Cd2+的運輸能力也存在較大差異。Cd2+累積量代表了植物吸入體內(nèi)并富集在體內(nèi)的儲存能力，在用植物進(jìn)行污染土壤修復(fù)時，這個指標(biāo)很大程度上反映了植物的修復(fù)效果。試驗中總累積量最高值為6.87 μg·株-1，最低值為2.75μg·株-1。綜合來看，8號和15號在Cd2+吸收和累積上表現(xiàn)較好；部分冠根濃度比較高的品種吸收量也較好，如10號，15號；但是也有個別品種冠根濃度比較高，吸收量卻較差，如4號；而3號，12號的轉(zhuǎn)運能力和累積能力均較弱。

表5 不同高羊茅品種的Cd2+含量及累積量Table 5 Cd2+content and accumulation of different tall fescue varieties

2.3.2 高羊茅Cd2+累積總量與耐性指數(shù)的隸屬函數(shù)的聚類分析 為了在高羊茅Cd2+耐性基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選到Cd2+高吸收的品種，以Cd2+累積總量與各個耐性指標(biāo)的耐性隸屬函數(shù)值為指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，將20個品種劃分為4種類型，第一種定義為高耐性高吸收型，特點是耐性很強(qiáng)，且Cd2+吸收能力也很強(qiáng)，共8個品種，分別是1號，2號，8號，9號，10號，11號，15號，20號，占總數(shù)的40%。第二種定義為高耐性低吸收型，特點是耐性較強(qiáng)，但是Cd2+累積能力偏弱，分別是5號，7號，14號，17號。第三種定義為低耐性高吸收型，特點是耐性較弱，吸收能力較強(qiáng)，包括13號和19號。第四種定義為低耐性低吸收型，特點是耐性較差，吸收能力較弱，共計有6個品種被劃入此類型，分別是3號，4號，6號，12號，16號，18號。各個類型的Cd2+累積總量和耐性隸屬函數(shù)值覆蓋的范圍如表6所示。

表6 高羊茅Cd2+累積總量與Cd2+耐性指數(shù)隸屬函數(shù)的聚類分析Table 6 Cluster analysis of Cd2+accumulation and subordinate function values of tolerance index of tall fescue varieties

3 討論

重金屬鎘是一種有毒的非必需元素，易于被植物吸收、富集，過量的Cd2+會影響植物的正常生長發(fā)育［10］，導(dǎo)致植物產(chǎn)生外觀毒害癥狀包括葉片萎黃、葉片壞疽、根系壞死、生長受到抑制以及產(chǎn)量下降等［11-14］。本試驗選擇10μM作為脅迫濃度，利用耐性指數(shù)對高羊茅的生長指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果表明20個高羊茅品種的生長發(fā)育均受到了一定程度的抑制，各指標(biāo)耐性指數(shù)均小于1。

利用不同指標(biāo)評價不同植物對重金屬的耐受程度可能得到不盡相同的結(jié)果［15］，本研究中不同高羊茅品種各指標(biāo)耐性指數(shù)存在明顯差異，有些品種如‘Commander’和‘Gold Crown’的地上和地下部分均表現(xiàn)出較高的耐性，品種‘Super Watchdog’地上和地下部的耐性均較弱，‘Arid 3’和‘Extreme’的耐性主要表現(xiàn)在地下部分，而‘Red Start’的地上部分耐性表現(xiàn)更強(qiáng)。綜合來看，根系長度和地下生物量兩個指標(biāo)的下降幅度分別為46.7%～81.5%和4.8%～81.3%。株高和地上生物量的下降幅度分別為9.5%～51%和3.8%～64.8%，說明植物在受到Cd2+脅迫時，地下部分（地下生物量和根長）對Cd2+脅迫的敏感度明顯高于地上部分（地上生物量和株高），受到的傷害相對更大，這與王曉桐的研究結(jié)果一致［16］。進(jìn)一步分析表明，在Cd2+脅迫下，抗性強(qiáng)的品種地下部分所受影響較小，如‘Arid 3’，‘Extreme’和‘Gold Crown’等，而抗性弱的品種地下部分所受影響較大，如品種‘Essential’，‘Super Watchdog’等。在葉綠素含量和類胡蘿卜素含量這兩個指標(biāo)上，品種‘Super Watchdog’和‘Justice’表現(xiàn)較好，均與對照組差異不顯著。單一指標(biāo)難以全面準(zhǔn)確地反映植物對重金屬的耐受性強(qiáng)弱，隸屬函數(shù)值法既可消除個別指標(biāo)帶來的片面性，又使材料耐性差異具有可比性［17］。本試驗利用隸屬函數(shù)將20個品種各個指標(biāo)的耐性指數(shù)進(jìn)行綜合分析，總隸屬函數(shù)值最高的品種為‘Commander’，耐鎘性最強(qiáng)，‘Extreme’次之，‘Gram villa’表現(xiàn)最差。

用于土壤修復(fù)的理想植物應(yīng)該具有高生物量，生長快速，在收獲部位能忍耐并累積一定量的重金屬等特征，高羊茅具備高生物量和快速生長的優(yōu)點，但是僅僅篩選出耐鎘品種還是不夠的，還要進(jìn)一步對其吸收特征進(jìn)行研究以獲得高耐性和高吸收的品種，所以本研究對高羊茅品種累積總量進(jìn)行測定。試驗結(jié)果顯示，20個高羊茅品種的地上部和根系都累積了大量的Cd2+。有研究表明，Cd2+超積累植物蒲公英（Taraxacummongolicum）在100mg·kg-1Cd2+處理下其根系和地上部的Cd2+濃度分別達(dá)到了41.9和57.2mg·kg-1［18］。新發(fā)現(xiàn)的Cd2+超積累植物錦葵（MalvasinensisCavan）在200 mg·kg-1處理下其根系和地上部的Cd2+濃度分別為92.2和154.3mg·kg-1［29］。而在本研究中，20個高羊茅品種經(jīng)過Cd2+處理30d后，在保持良好的生長狀態(tài)的情況下，根系和地上部Cd2+濃度分別達(dá)到了180.39～290.69和106.66～150.97mg·kg-1，達(dá)到了超富集植物的標(biāo)準(zhǔn)（地上部Cd2+濃度大于100mg·kg-1）［20］。由此可見，高羊茅在較短的時間內(nèi)，能夠在體內(nèi)富集較高濃度的Cd2+，且Cd2+分布格局呈現(xiàn)為根部＞地上部，表明Cd2+大部分被累積在植物的根部，這與王凱榮［21］等的研究結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

20個高羊茅品種各指標(biāo)耐性指數(shù)的隸屬函數(shù)值與總隸屬函數(shù)值均表現(xiàn)出極顯著相關(guān)水平（P＜0.01），說明6個指標(biāo)在植物耐性篩選上均有意義。因此在對高羊茅耐鎘性進(jìn)行初步鑒定時，株高、根長，生物量和光合色素均可作為評價鑒定參考指標(biāo)。

通過綜合評價分析，最終將20個品種分為4種類型，分別是高耐高吸收型：‘Arid 3’，‘Extreme’，‘Commander’，‘Escalade’，‘Ecological King’，‘Ky-32’，‘Red Start’，‘Green Label’；高耐低吸收型：‘Gold Crown’，‘Justice’，‘Honky Tonk’，‘Aries’；低耐高吸收型：‘RubyⅡ’，‘Coronado TDH’；低耐低吸收型：‘K31’，‘Crossfire III’，‘Essential’，‘Super Watchdog’，‘Gram villa’，‘Dynamic II’。其中高耐性高吸收型的8個品種更適合用于Cd2+污染的植物修復(fù)。這為進(jìn)一步研究高羊茅種內(nèi)耐性及吸收差異奠定了良好的基礎(chǔ)，也為生產(chǎn)實踐中品種的選擇提供了理論依據(jù)。