桃兒七莖葉組織內(nèi)生真菌多樣性

寧 祎,李艷玲,李 媛,周國英,楊路存,徐文華,*

1 中國科學(xué)院西北高原生物研究所,西寧 810001 2 中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049 3 中國科學(xué)院藏藥研究重點實驗室,西寧 810001 4 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,北京 100085

桃兒七莖葉組織內(nèi)生真菌多樣性

寧 祎1,2,李艷玲1,4,李 媛1,2,周國英1,3,楊路存1,3,徐文華1,3,*

1 中國科學(xué)院西北高原生物研究所,西寧 810001 2 中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049 3 中國科學(xué)院藏藥研究重點實驗室,西寧 810001 4 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,北京 100085

通過用兩種傳統(tǒng)培養(yǎng)基(PDA、SDA)分離方法對5個自然野生分布的桃兒七群落(分布于青海省、甘肅省和四川省)莖葉組織內(nèi)的內(nèi)生真菌多樣性進行研究,并用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)的方法鑒定菌株。實驗結(jié)果顯示,720個莖葉組織塊中共分離到141株內(nèi)生真菌。依據(jù)真菌在培養(yǎng)基上的形態(tài)初步劃分為52個分類單元,經(jīng)鑒定歸屬于19屬,其中莖組織中16屬>葉組織中6屬,桃兒七莖葉組織中的真菌優(yōu)勢屬為擬青霉屬,相對分離頻率為26.34%。5個采樣點間內(nèi)生真菌的香濃維納多樣性指數(shù)為0.71—1.41,Sorenson相似性系數(shù)為0.13—0.50,定殖率為14.58%—28.47%。通過對PDA、SDA兩種培養(yǎng)基以及莖、葉組織的定殖率進行統(tǒng)計,結(jié)果顯示： PDA(17.50%)葉(9.44%)。研究結(jié)果表明,桃兒七莖葉組織中內(nèi)生真菌的多樣性較低,不同采樣點間宿主植物內(nèi)內(nèi)生真菌群落的相似性較低,真菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。研究為進一步擴大從桃兒七中篩選產(chǎn)鬼臼毒素等活性物質(zhì)內(nèi)生真菌提供了一種新的思路。

桃兒七；內(nèi)生真菌；多樣性；定殖率；真菌群落結(jié)構(gòu)

植物內(nèi)生真菌是指其生活史的一定階段或全部階段定殖在宿主植物體內(nèi),而不引起植物發(fā)生明顯病變的一類真菌總稱[1]。早在19世紀(jì)中期,科學(xué)界就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些健康的植物組織中有微生物的存在,但對于這些微小生物體在植物中所發(fā)揮的作用卻不得而知?，F(xiàn)代研究表明,內(nèi)生真菌定殖在植物體內(nèi)是自然界長期進化選擇的結(jié)果,兩者形成一種共生或互生關(guān)系。其相互作用受到內(nèi)部因子(宿主植物種類)和外部因子(氣候條件、地理位置、溫度、濕度、海拔高度等)因素的影響[2]。許多植物內(nèi)生真菌具有重要的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)功能,如產(chǎn)生生物活性物質(zhì)、抗逆促生、抗病抗蟲、降解凋落物等[3- 6],有的研究還表明植物內(nèi)生真菌能夠影響中藥藥材的道地性,能夠提高藥用植物對某些次級代謝產(chǎn)物的累積[7- 8]。

桃兒七(Sinopodophyllumhexandrum(Royle) Ying)又名鬼臼、小葉蓮等,屬小檗科(Berberidaceae)桃兒七屬(Sinopodophyllum)多年生草本植物,是我國重要的傳統(tǒng)中藥材。桃兒七生長于海拔2700—4300 m的林下或灌叢中,在我國主產(chǎn)于青海、甘肅、四川西部、西藏、云南西北部、陜西等地[9]。桃兒七用藥部位主要為果實、根及根狀莖,藏醫(yī)體系以果實入藥,可調(diào)經(jīng)活血、保胎、消腫、止痛等治療婦科疾病,中醫(yī)體系以根及根狀莖入藥,具有祛痰止咳、抗腫瘤、抗免疫等作用[10],現(xiàn)代醫(yī)學(xué)以提取根及根莖中的鬼臼毒素為原料用于抗病毒(治療尖銳濕疣)及抗腫瘤藥物的合成(VP- 16、VM- 26、NK61等)[11]。由于近年來市場對鬼臼毒素化合物需求急劇增長,導(dǎo)致老百姓大規(guī)模無序采挖桃兒七地下部位,造成桃兒七野生資源急劇銳減,加之藏醫(yī)以其果實入藥,更加削弱了桃兒七群體的天然繁殖能力。早在1992年桃兒七植物已被列入《中國珍稀瀕危保護植物名錄》,為國家三級保護植物,因此轉(zhuǎn)移依靠桃兒七植物資源獲取天然藥物來源方式勢在必行。目前,利用植物內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物篩選生物活性物質(zhì)的研究非常引人關(guān)注。

研究認(rèn)為,從植物產(chǎn)天然化合物的組織部位提取分離的內(nèi)生真菌,其次生代謝產(chǎn)物與宿主植物產(chǎn)的天然藥物相同或化學(xué)結(jié)構(gòu)式相近的概率較大[12]。目前,有關(guān)桃兒七植物內(nèi)生真菌的研究均集中于根部內(nèi)生真菌的分離研究,分離到能產(chǎn)鬼臼毒素的內(nèi)生真菌[13- 18],但這些真菌中沒有一株產(chǎn)量能夠達到工業(yè)生產(chǎn)水平的要求。究其原因,一是可供開發(fā)利用的菌種種類太少,為誘變育種和基因工程育種增加了難度。二是分離內(nèi)生真菌的部位局限于根部,導(dǎo)致菌種中DSE(深色有隔內(nèi)生真菌類群)內(nèi)生真菌較多[19],不利于菌種的擴大篩選。研究表明鬼臼毒素在桃兒七中的分布具有一定的規(guī)律性,在根及根莖中含量最高,莖葉次之[20]。另有研究表明,桃兒七植物不同產(chǎn)地、不同營養(yǎng)器官中鬼臼毒素的含量差異較大,某些地區(qū)莖中鬼臼毒素含量高于根中[21]。由此可見,對于桃兒七植物除了研究根部還應(yīng)研究莖葉組織等不同器官,擴大菌株篩選部位,為進一步擴大篩選有價值菌種奠定基礎(chǔ)。

鑒于此,本研究對桃兒七莖葉組織中的內(nèi)生真菌多樣性展開研究。采集青藏高原東緣桃兒七生長最適宜區(qū)的青海、甘肅和四川境內(nèi)5個自然野生分布點的桃兒七莖葉組織,研究莖葉組織內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)的多態(tài)性,探討不同產(chǎn)地桃兒七莖葉組織中的菌群結(jié)構(gòu)差異,以期掌握桃兒七莖葉組織內(nèi)生真菌資源狀況,為后續(xù)研究內(nèi)生真菌對桃兒七道地性的影響提供理論依據(jù)；同時,分離、保存獲得的內(nèi)生真菌菌株,為進一步擴大篩選產(chǎn)鬼臼毒素活性物質(zhì)的菌種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2014年9月初,樣品分別采自青海省、甘肅省和四川省境內(nèi)的5個桃兒七自然分布點。其中,青海省3個采樣點,甘肅省和四川省各一個采樣點(表1)。采樣時每個采樣點選取成年健康植株3株,根據(jù)隨機取樣原則,取樣的株距在30—50 m之間,所有樣品共15株。樣品采集后裝入干凈塑料袋,置入便攜式保溫箱中,編號、標(biāo)記后帶回實驗室備用。實驗室內(nèi)所有樣品的處理時間不超過48 h。

表1 桃兒七采樣地點

1.2 分離純化內(nèi)生真菌

新鮮樣品采回后,洗凈桃兒七莖葉表面泥土,自來水沖洗30 min,取出樣品置于無菌燒杯中用無菌水漂洗3次,置于無菌操作臺中。無菌操作臺中的樣品表面滅菌過程具體方法如下[16]：將樣品浸入70%酒精1 min,再浸入5%的次氯酸鈉5 min,最后無菌水漂洗3次。在超凈工作臺中用無菌吸水紙吸取表面多余水分后,將材料剪切成約1 cm×1 cm小圓片,置于直徑為90 mm的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)的平板中(莖和葉共720個組織塊),于25℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)4周。每隔1d檢查培養(yǎng)基內(nèi)有無真菌長出,若有真菌長出及時將真菌轉(zhuǎn)接至新的PDA培養(yǎng)基中,純化兩次,直至獲得單菌落。為保證外植體表面滅菌徹底,將第3次漂洗過組織的無菌水抽取1 mL平板涂布在PDA培養(yǎng)基上,此外,將漂洗干燥后的外植體輕壓在PDA培養(yǎng)基上20 min后取出。兩組無菌對照在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng),培養(yǎng)4周后培養(yǎng)基內(nèi)無真菌長出,說明材料外植體表面滅菌徹底。

1.3 內(nèi)生真菌的鑒定

分離出的單菌落真菌通過分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)相結(jié)合的方法予以鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：表面刮取純化后的單菌落真菌菌絲體至無菌的1.5 mL離心管中,編號。用液氮研磨收集的各菌株菌絲體,采用OMEGA公司生產(chǎn)的真菌提取試劑盒提取真菌的總基因組DNA。用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3′) 擴增真菌的ITS序列。PCR反應(yīng)體系為25 μl,反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性3 min,95℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸45 s,共35個循環(huán),72℃延伸7 min。將PCR反應(yīng)得到的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,擴增出的ITS序列送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序后獲得的序列,拷貝校正后,采用Blast程序在NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源性對比,使用Clustal X 1.83軟件進行多序列比較, 然后用MEGA 5.0軟件構(gòu)建Neighbor-Joining 系統(tǒng)發(fā)育樹,將內(nèi)生真菌鑒定到屬[22]。

形態(tài)學(xué)觀察鑒定：根據(jù)菌落的在PDA培養(yǎng)基上不同階段生長的菌落形態(tài)、顏色、菌體延伸及生長狀況等特征,依據(jù)《真菌鑒定手冊》[23]和《中國真菌志》[24]并結(jié)合分子生物學(xué)鑒定結(jié)果最終確定真菌類群。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

為了評價青藏高原東緣桃兒七莖葉組織內(nèi)優(yōu)勢類內(nèi)生真菌組成、組織塊中內(nèi)生真菌的豐富程度和每個組織塊受多重侵染的發(fā)生頻率。分別統(tǒng)計內(nèi)生真菌的相對分離頻率(IF)和定殖率。

相對分離頻率(%) =(樣本中分到的某種內(nèi)生真菌的菌株數(shù)/分到的總菌株數(shù))×100%

定殖率= (有內(nèi)生真菌侵染的組織塊數(shù)/實驗供試的總組織塊數(shù))

不同地域內(nèi)生真菌群落的多樣性分析根據(jù)Shannon-Wiener指數(shù)(H′)來計算。

H′=-∑(Pi)(lnPi)

式中,Pi為分離到的某種內(nèi)生真菌的菌株數(shù)占分離到的全部內(nèi)生真菌菌株數(shù)的百分?jǐn)?shù)。為了比較不同采樣地之間內(nèi)生真菌群落組成的相似程度,采用Sorenson(Cs)相似性系數(shù)進行比較。

CS=2j/(a+b)

式中,j為兩個采樣地間共有的內(nèi)生真菌種類數(shù),a表示為一個采樣地中分離到的內(nèi)生真菌種類數(shù),b表示為另一個采樣地中分離到的內(nèi)生真菌種類數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 桃兒七莖葉組織內(nèi)生真菌的組成

從青藏高原東緣3個省份的5個采樣點采集的桃兒七莖葉720個組織塊中,共分離到141株內(nèi)生真菌,依據(jù)生長形態(tài)初步分為52個分類單元,經(jīng)分子生物學(xué)結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定最終可歸為19屬(表2,圖1)。5個采樣點中除若爾蓋縣采樣點分離的10個屬真菌之外,其余4個采樣點間分離的內(nèi)生真菌屬數(shù)較為接近。具體為大通6屬、樂都6屬、湟中5屬和夏河5屬。綜合5個采樣點的結(jié)果來看,桃兒七莖葉組織內(nèi)生真菌群落中的優(yōu)勢類真菌為擬青霉屬和小球腔菌屬,相對分離頻率分別為26.24%和14.89%(表2)。

表2 桃兒七莖葉內(nèi)生真菌的群落組成及分離頻率

圖1 桃兒七莖葉內(nèi)生真菌18S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖Fig.1 Phylogenetic tree of 18S rDNA ITS sequences of the endophytic fungi isolated from S. hexandrum

在門水平上,子囊菌門占絕對優(yōu)勢,有18個屬為子囊菌門,1個屬為擔(dān)子菌門。而在綱的分類水平上,優(yōu)勢類真菌分別為座囊菌綱和散囊菌綱,各占9個屬和6個屬；在目的分類水平上,優(yōu)勢類真菌為叢梗孢目Moniliales(31.58%)；在科的水平上,叢梗孢科Moniliaceae(26.32%)為優(yōu)勢類真菌；屬的水平上以擬青霉屬Paecilomyces和小球腔菌屬Leptosphaeria為優(yōu)勢屬內(nèi)生真菌,分別占到分離內(nèi)生真菌總數(shù)的26.24%和14.89%。分離結(jié)果還顯示,內(nèi)生真菌在桃兒七莖葉組織中的分布是不同的,莖和葉組織中共有的內(nèi)生真菌有3屬,分別為擬青霉屬、小球腔菌屬和曲霉屬,而殼針孢屬、葡萄孢屬和枝霉屬真菌只存在于葉中,其余的真菌如短梗霉屬等13個屬真菌只存在于莖組織中。

2.2 不同采樣地內(nèi)生真菌定殖率的比較

圖2 內(nèi)生真菌的定殖率Fig.2 Colonization rates of endophytic fungi(a)表示為不同采樣點間內(nèi)生真菌的定殖率；(b)表示為桃兒七地上部分莖和葉內(nèi)生真菌定殖率的差異；(c)表示為不同采樣點間內(nèi)生真菌定殖率對不同培養(yǎng)基類型的響應(yīng)

由實驗結(jié)果可得,桃兒七莖葉組織內(nèi)生真菌定殖率相對較低(19.58%)。5個采樣點間內(nèi)生真菌的定殖率存在差異,其中四川省若爾蓋縣采樣點的定殖率最大(28.47%),青海省湟中縣境內(nèi)的定殖率最小14.58%(圖2a)。定殖率在莖葉組織間的分布為莖(29.72%)>葉(9.44%),不同采樣點間莖的定殖率表現(xiàn)為：四川若爾蓋(48.61%)>青海樂都(38.89%)>青海大通(31.94%)>青海湟中(18.06%)>甘肅夏河(11.11%),葉的定殖率表現(xiàn)為：甘肅夏河(25.00%)>青海湟中(11.11%)>四川若爾蓋(8.33%)>青海樂都(2.78%)>青海大通(0)。從采樣點間來看,除甘肅夏河之外,其余四個采樣點均為莖組織內(nèi)生真菌的定殖率高于葉組織,而青海大通采樣點葉組織中沒有分離到內(nèi)生真菌(圖2b)。研究結(jié)果顯示,不同的培養(yǎng)基類型對于內(nèi)生真菌定殖率的影響不同?？偟膩碚f,SDA培養(yǎng)基上內(nèi)生真菌的定殖率(21.67%)要高于PDA培養(yǎng)基(17.50%),但是不同的采樣點對不同的培養(yǎng)基類型偏好性不同,位于青海省境內(nèi)的3個采樣點均偏好于PDA培養(yǎng)基,而位于甘肅省境內(nèi)和四川省境內(nèi)的采樣點卻偏好于SDA培養(yǎng)基(圖2c)。

2.3 不同采樣地內(nèi)生真菌的多樣性和相似性

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)分析結(jié)果如表3所示,5個采樣點內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)較低,分布在0.71—1.41之間。多樣性最高的采樣點為若爾蓋,而多樣性最低的為夏河。不同采樣點間的相似性指數(shù)分布在0.13—0.50之間,其中青海省境內(nèi)的樂都和大通兩個采樣點間的相似性最高,為0.50,而青海省境內(nèi)的湟中與四川省境內(nèi)的若爾蓋相似性最低,為0.13?？偟膩碚f,不同采樣地之間桃兒七莖葉內(nèi)生真菌的相似性較低,說明不同采樣地間菌群組成具有較大的差異。

表3 采樣點間內(nèi)生真菌的相似性和多樣性

2.4 不同采樣地內(nèi)生真菌的組成

對不同采樣地分離出的內(nèi)生真菌種群進行分析可得,夏河、大通和樂都以擬青霉屬為優(yōu)勢屬,所占頻率分別為42.31%,56.52%和33.33%,若爾蓋以小球腔菌屬為優(yōu)勢屬,占該地內(nèi)生真菌總數(shù)的26.83%,而湟中的優(yōu)勢屬則為殼針孢屬,占該地內(nèi)生真菌總數(shù)的38.10%(表4)。

表4 不同采樣地分離的內(nèi)生真菌菌株數(shù)

此外,本研究中沒有發(fā)現(xiàn)某一類內(nèi)生真菌能夠同時出現(xiàn)在5個采樣點中,分離頻率最高的內(nèi)生真菌擬青霉屬只存在于除四川若爾蓋采樣點之外的其余4個采樣點中(表4)。某些類群的內(nèi)生真菌只存在于一個采樣點中,如若爾蓋桃兒七莖組織中的核座孢屬、木霉屬、小鬼傘屬、根球蟲屬及葉組織中的葡萄孢屬,湟中采樣點中的錐毛殼屬和背芽突霉屬,大通采樣點中的莖點霉屬和座囊菌屬,樂都采樣點中的球囊菌屬,夏河采樣點中的枝孢屬。這表明內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)與宿主植物桃兒七所處的生境有關(guān),外部環(huán)境條件決定了一些特有的真菌類群的定殖。

3 討論

3.1 內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)與生境相關(guān)性

本研究對青藏高原東緣3個省份,5個采樣點的桃兒七莖葉組織內(nèi)生真菌進行分離研究。結(jié)果顯示,優(yōu)勢屬真菌為擬青霉屬,但各采樣點間優(yōu)勢屬真菌不完全相同,夏河、大通和樂都以擬青霉屬為優(yōu)勢屬,而若爾蓋和湟中則分別以小球腔菌屬和殼針孢屬為優(yōu)勢屬。對比前人對桃兒七根莖組織內(nèi)生真菌研究：如李海燕等[25]對云南中甸縣桃兒七地下莖內(nèi)生真菌進行分離,結(jié)果分離內(nèi)生真菌28株,可歸屬為5目、6科、9屬,優(yōu)勢屬真菌為叢梗孢屬；張琨等[17]對陜西太白山桃兒七地下莖內(nèi)生真菌進行研究,分離內(nèi)生真菌菌株20株,歸屬于2目、3屬,優(yōu)勢屬為毛霉屬；畢江濤等[26]從寧夏涇源縣桃兒七根、莖、葉中分別分離到內(nèi)生真菌 22株、18株和9株,歸屬于2目、3科、9屬,其中梭孢霉屬為優(yōu)勢屬真菌；祝英等[27]從甘肅興隆山桃兒七地下莖中分離內(nèi)生真菌20株,優(yōu)勢屬真菌為曲霉屬、Eucasphaeria、白僵菌屬和鐮刀菌屬?？梢?不同采樣地桃兒七內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬真菌差別明顯,內(nèi)生真菌的群落組成也存在著較大差異。本研究中,除不同采樣地優(yōu)勢屬真菌不完全相同外,內(nèi)生真菌的群落相似性同樣較低。這些結(jié)果表明,內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)與宿主植物所處的生境密切相關(guān),局部微環(huán)境是影響桃兒七內(nèi)生真菌種群形成的主要原因。有研究認(rèn)為影響植物內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)的主因在于根系周圍的土壤微生物,認(rèn)為土壤中的真菌入侵植物組織內(nèi)部造成群落結(jié)構(gòu)各有不同[28]。也有研究認(rèn)為區(qū)域的植被類型和氣候特征是造成內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)差異的主要因素[29]?？傊?宿主植物生境的不同決定著定殖在植物體內(nèi)內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu),至于何種生境因子起關(guān)鍵作用還需要系統(tǒng)、全面的深入研究。

此外,本研究中內(nèi)生真菌定殖率為14.58%—28.47%,多樣性指數(shù)為0.71—1.41。研究結(jié)果與同處于相近緯度或熱帶地區(qū)維管植物內(nèi)生真菌的定殖率和多樣性指數(shù)相比較低。前人研究表明,陸生植物地上部分定殖率在11%—100%之間[6,30],如Huang等[31]對中國不同地域29種傳統(tǒng)藥用植物內(nèi)生真菌進行研究,結(jié)果顯示內(nèi)生真菌的定殖率在36.7%—100%之間。Sun等[30]對北京植物園內(nèi)的6種藥用植物莖葉組織內(nèi)生真菌進行研究,結(jié)果顯示內(nèi)生真菌的定殖率在6種植物間為47.9%—63.1%之間。定殖率和多樣性代表著植物中內(nèi)生真菌的豐富程度,本研究中內(nèi)生真菌的多樣性和定殖率較低可能和所處的青藏高原特殊地理氣候有關(guān),青藏高原是世界上海拔最高、面積最大的高原,高海拔、強輻射、晝夜溫差大和寒冷是這一地區(qū)的普遍特征[32]。內(nèi)生真菌的定殖率和多樣性會隨著宿主植物所處環(huán)境的海拔、濕度、降雨量和溫度的不同呈現(xiàn)明顯的變化[2]。

3.2 桃兒七莖葉內(nèi)生真菌的應(yīng)用潛力

5個采樣地中的15株桃兒七植株莖葉組織采用兩種培養(yǎng)基共分離出19屬內(nèi)生真菌。其中,交鏈孢屬[13]、青霉屬[14]均是已被證明過的能夠產(chǎn)生鬼臼毒素的自桃兒七中分離到的內(nèi)生真菌。本研究中,這些真菌均不是優(yōu)勢屬真菌,它們在真菌群落所占頻率較低,但鑒于它們有產(chǎn)生鬼臼毒素的研究歷史,這兩類真菌將是我們此后篩選產(chǎn)生鬼臼毒素內(nèi)生真菌的首要研究對象。此外,研究還發(fā)現(xiàn),某些內(nèi)生真菌首次作為桃兒七內(nèi)生真菌被報道,如優(yōu)勢屬真菌擬青霉屬和小球腔菌屬等13屬真菌,這些真菌均可以作為新的篩選資源,為從中發(fā)現(xiàn)新的菌株和有活性的代謝產(chǎn)物提供了廣泛的研究空間。

此外,優(yōu)勢屬的真菌擬青霉屬和次優(yōu)勢屬真菌小球腔菌屬,它們在桃兒七植株的莖葉組織中均有分布。這兩種內(nèi)生真菌是常見的內(nèi)生真菌,在許多植物和環(huán)境地域均被分離報道,其次生代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出藥用價值和應(yīng)用價值,如產(chǎn)抗癌活性物質(zhì)、拮抗病原性真菌、產(chǎn)新型化合物等[33- 36]。并且,研究還顯示擬青霉屬真菌是自然界中一類重要的昆蟲病原性真菌,可以有效的控制害蟲的種群數(shù)量和繁殖[37],本研究中擬青霉屬在桃兒七莖葉中廣泛定殖,可能對桃兒七種群抵御自然環(huán)境中的蟲害具有一定的生態(tài)學(xué)作用。此外,青霉屬、木霉屬、曲霉屬、莖點霉屬和交鏈孢屬是自然界常見的植物內(nèi)生真菌類群,它們在宿主植物中廣泛分布,這些真菌具有重要的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)功能[38],對于這些真菌的開發(fā)利用,亦是我們今后工作的研究重點。目前,對于桃兒七莖葉內(nèi)生真菌的研究較少,大量的內(nèi)生真菌資源還有待挖掘和開發(fā),本研究對擴大桃兒七植株內(nèi)生真菌種源篩選提供了新的思路。此外,選取桃兒七莖葉組織為研究對象,這樣在得到內(nèi)生真菌的同時也不破壞野生桃兒七種群,可以更加充分的保護桃兒七自然資源。

[1] Stone J K, Bacon C W, White J F Jr. An overview of endophytic microbes: Endophytism defined //Bacon C W, White J, eds. Microbial Endophytes. New York: Marcel Dekker, 2000: 3- 29.

[2] Hoffman M T, Arnold A E. Geographic locality and host identity shape fungal endophyte communities in cupressaceous trees. Mycological Research, 2008, 112(3): 331- 344.

[3] Li H Y, Qing C, Zhang Y L, Zhao Z W. Screening for endophytic fungi with antitumour and antifungal activities from Chinese medicinal plants. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2005, 21: 1515- 1519.

[4] Redman R S, Sheehan K B, Stout R G, Rodriguez R J, Henson J M. Thermotolerance conferred to plant host and fungal endophyte during mutualistic symbiosis. Science, 2002, 298: 1581.

[5] Arnold A E, Mejía L C, Kyllo D, Rojas E I, Maynard Z, Robbins N, Herre E A. Fungal endophytes limit pathogen damage in a tropical tree. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003, 100(26): 15649- 15654.

[6] Sun X, Guo L D, Hyde K D. Community composition of endophytic fungi inAcertruncatumand their role in decomposition. Fungal Diversity, 2011, 47(1): 85- 95.

[7] 賈敏, 游飛, 秦路平. 內(nèi)生菌藥用新資源與道地藥材的關(guān)系探討. 藥學(xué)服務(wù)與研究, 2009, 9(5): 321- 324.

[8] 馬昭, 唐承晨, 張純, 胡之璧, 王莉莉, 黎萬奎. 內(nèi)生菌與宿主植物關(guān)系對中藥材道地性研究的啟示. 上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2015, 29(6): 4- 11.

[9] 楊永昌. 藏藥志. 青海: 青海人民出版社, 1991: 319- 320.

[10] 李艷玲, 寧祎, 徐文華, 周國英. 桃兒七不同部位2種木脂素含量的動態(tài)研究. 中國中藥雜志, 2015, 40(9): 1837- 1841.

[11] Yousefzadi M, Sharifi M, Behmanesh M, Moyano E, Bonfill M, Cusido R M, Palazon J. Podophyllotoxin: Current approaches to its biotechnological production and future challenges. Engineering in Life Sciences, 2010, 10(4): 281- 292.

[12] Aly A H, Debbab A, Proksch P. Fungal endophytes: unique plant inhabitants with great promises. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 90(6): 1829- 1845.

[13] 李海燕, 王志軍, 張玲琪, 張無敵. 一種桃兒七內(nèi)生真菌的分離初報. 云南大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 1999, 21(3): 243- 243.

[14] 楊顯志, 郭仕平, 張玲琪, 邵華. 鬼臼類植物產(chǎn)鬼臼毒素內(nèi)生真菌的篩選. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2003, 15(5): 419- 422.

[15] 王興紅. 鬼臼類植物內(nèi)生真菌的分離及其抗癌活性研究. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2006, 18(5): 723- 727.

[16] Puri S C, Nazir A, Chawla R, Arora R, Riyaz-ul-Hasan S, Amna T, Ahmed B, Verma V, Singh S, Sagar R, Sharma A, Kumar R, Sharma R K, Qazi G N. The endophytic fungusTrameteshirsutaas a novel alternative source of podophyllotoxin and related aryl tetralin lignans. Journal of Biotechnology, 2006, 122(4): 494- 510.

[17] 張琨, 黃建新, 曹莉, 袁文常. 桃兒七內(nèi)生菌及產(chǎn)鬼臼類物質(zhì)菌株的篩選. 西北大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2008, 38(3): 431- 434.

[18] Nadeem M, Mauji R, Pravej A, Ahmad M M, Mohammad A, Qurainy F A, Khan S, Abdin M Z.Fusariumsolani, P1, a new endophytic podophyllotoxin-producing fungus from roots ofPodophyllumhexandrum. African Journal of Microbiology Research, 2012, 6(10): 2493- 2499.

[19] 劉茂軍, 張興濤, 趙之偉. 深色有隔內(nèi)生真菌(DSE)研究進展. 菌物學(xué)報, 2009, 28(6): 888- 894.

[20] 區(qū)智, 屈燕. 桃兒七國內(nèi)外研究進展. 北方園藝, 2013, 37(18): 183- 185.

[21] 熊文勇, 魏朔南, 岳明. HPLC分析桃兒七中鬼臼毒素的含量. 中成藥, 2010, 32(5): 875- 878.

[22] 臧威, 孫翔, 孫劍秋, 于文喜, 王雪松, 尹軍霞, 宋瑞清. 南方紅豆杉內(nèi)生真菌的多樣性與群落結(jié)構(gòu). 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2014, 25(7): 2071- 2078.

[23] 魏景超. 真菌鑒定手冊. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1979.

[24] 齊祖同, 孔華忠. 中國真菌志—曲霉屬及其相關(guān)有性型. 北京: 科學(xué)出版社, 1997.

[25] 李海燕, 曾松榮, 張玲琪. 云南桃兒七植株地下莖內(nèi)生真菌多樣性及有價值菌株的篩選. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 1999, 12(4): 123- 125.

[26] 畢江濤, 何萍, 呂雯, 關(guān)曉慶, 賀達漢. 桃兒七內(nèi)生真菌分離及其抑菌活性初步研究. 中草藥, 2013, 44(12): 1667- 1672.

[27] 祝英, 王治業(yè), 楊暉, 周劍平. 桃兒七地下莖內(nèi)生真菌的分離和鑒定. 中國現(xiàn)代中藥, 2015, 17(6): 572- 576.

[28] Bertollo P. Assessing landscape health: a case study from northeastern Italy. Environmental Management, 2001, 27(1): 349- 365.

[29] 梁雪娟, 張水寒, 張平, 彭菲, 柯健, 糜亞男. 不同產(chǎn)地杜仲皮內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)的比較分析. 中國中藥雜志, 2014, 39(2): 204- 208.

[30] Sun J Q, Guo L D, Zang W, Ping W X, Chi D F. Diversity and ecological distribution of endophytic fungi associated with medicinal plants. Science in China Series C: Life Sciences, 2008, 51(8): 751- 759.

[31] Huang W Y, Cai Y Z, Hyde K D, Corke H, Sun M. Biodiversity of endophytic fungi associated with 29 traditional Chinese medicinal plants. Fungal Divers, 2008, 33: 61- 75.

[32] Gai J P, Christie P, Cai X B, Fan J Q, Zhang J L, Feng G, Li X L. Occurrence and distribution of arbuscular mycorrhizal fungal species in three types of grassland community of the Tibetan plateau. Ecological Research, 2009, 24: 1345- 1350.

[33] Huang Y J, Wang J F, Li G, Zheng Z H, Su W J. Antitumor and antifungal activities in endophytic fungi isolated from pharmaceutical plantsTaxusmairei,CephalataxusfortuneiandTorreyagrandis. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 2001, 31(2): 163- 167.

[34] Liu J Y, Liu C H, Zou W X, Tian X, Tan R X. Leptosphaerone, a Metabolite with a Novel Skeleton fromLeptosphaeriasp. IV403, an Endophytic Fungus inArtemisiaannua. Helvetica Chimica Acta, 2002, 85(9): 2664- 2667.

[35] Xu L L, Han T, Wu J Z, Zhang Q Y, Zhang H, Huang B K, Rahman K, Qin L P. Comparative research of chemical constituents, antifungal and antitumor properties of ether extracts ofPanaxginsengand its endophytic fungus. Phytomedicine, 2009, 16(6/7): 609- 616.

[36] 楊明琰, 田稼, 馬瑜, 孫超, 黃繼紅. 杜仲內(nèi)生真菌的分離鑒定及抗菌活性研究. 西北植物學(xué)報, 2012, 32(1): 193- 198.

[37] 羅科, 張青文, 楊奇華. 擬青霉屬真菌在植物保護中的研究利用. 世界農(nóng)業(yè), 1990, 32- 33.

[38] Li H Y, Shen M, Zhou Z P, Li T, Wei Y L, Lin L B. Diversity and cold adaptation of endophytic fungi from five dominant plant species collected from the Baima Snow Mountain, Southwest China. Fungal Diversity, 2012, 54(1): 79- 86.

DiversityofendophyticfungifromthestemandleafofSinopodophyllumhexandrum(Royle)Ying

NING Yi1,2, LI Yanling1,4, LI Yuan1,2, ZHOU Guoying1,3, YANG Lucun1,3, XU Wenhua1,3,*

1NorthwestInstituteofPlateauBiology,ChineseAcademyofSciences,Xining810001,China2UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China3KeyLaboratoryofTibetanMedicineResearch,ChineseAcademyofSciences,Xining810001,China4ResearchCenterforEco-EnvironmentalSciences,ChineseAcademyofSciences,Beijing100085,China

In this study, endophytic fungal diversity of the host plantSinopodophyllumhexandrum(Royle) Ying was investigated at five locations in Qinghai, Gansu, and Sichuan Provinces. The endophytic fungi on the stems and leaves of the host plants were isolated on two culture media, potato dextrose agar (PDA) and Sabouraud dextrose agar (SDA), and the strains were identified using morphological and molecular analyses. A total of 141 endophytic fungi were isolated from 720 tissue samples. These fungi were divided into 52 endophytic taxa on the basis of their morphology in the culture media. Phylogenetic analysis based on the internal transcribed spacer region indicated 19 genera, 18 of which belonged to Ascomycetes and 1 to Basidiomycetes. The number of genera varied among the five locations: 10 were detected in Ruoergai County, 6 in Datong County, 6 in Ledu County, 5 in Huangzhong County, and 5 in Xiahe County. With respect to tissue type, 16 genera were isolated from the stems, 6 from the leaves, and only 3 were found in both tissues. Further analysis showed thatPaecilomyceswas the most dominant genus, with an isolation frequency of 26.34%, followed byLeptosphaeria, with an isolation frequency of 14.89%. The community structure clearly differed among the locations. At the sites in Xiahe County, Datong County, and Ledu County, the dominant genus wasPaecilomycesand the isolation frequencies were 42.31%, 56.52%, and 33.33%, respectively. The dominant genus wasLeptosphaeriain Ruoergai County andSeptoriain Huangzhong County, with isolation frequencies of 26.83% and 38.10%, respectively. Shannon′s diversity index ranged from 0.71 to 1.41 and was the highest in Ruoergai County and the lowest in Huangzhong County. Sorenson similarity index ranged from 0.13 to 0.50; it was the highest between Datong County and Ledu County and the lowest between Ruoergai County and Huangzhong County. The colonization rate of the endophytic fungi at the five locations ranged from 14.58% to 28.47%; the mean colonization rate was 19.58%, and the highest colonization rate was observed in Ruoergai County and the lowest colonization rate in Huangzhong County. In addition, the colonization rate was higher in SDA (21.67%) than in PDA (17.50%) and higher in the stem (29.72%) than in the leaf (9.44%). These findings revealed that the species diversity of the endophytic fungi in the stem and leaf tissues ofS.hexandrumwas low, but the community structure ofS.hexandrumdiffered substantially among the sampling sites. Endophytic fungi that colonize stem and leaf tissues are targets for the production of podophyllotoxin and other natural compounds and, accordingly, have potential practical applications. This study offers a novel strategy for identifying valuable microbial strains fromS.hexandrum.

Sinopodophyllumhexandrum(Royle) Ying; endophytic fungi; diversity; colonization rate; community structure

2015年國家級星火計劃重點資助項目(2015GA870007);中國科學(xué)院“西部之光”人才培養(yǎng)計劃重點項目后續(xù)擇優(yōu)支持資助項目(2013年)

2016- 05- 05; < class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期

日期:2017- 03- 22

10.5846/stxb201605050851

*通訊作者Corresponding author.E-mail: whxu@nwipb.cas.cn

寧祎,李艷玲,李媛,周國英,楊路存,徐文華.桃兒七莖葉組織內(nèi)生真菌多樣性.生態(tài)學(xué)報,2017,37(15):5157- 5166.

Ning Y, Li Y L, Li Y, Zhou G Y, Yang L C, Xu W H.Diversity of endophytic fungi from the stem and leaf ofSinopodophyllumhexandrum(Royle) Ying.Acta Ecologica Sinica,2017,37(15):5157- 5166.