中華絨螯蟹蛻殼過程中肌肉的組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)及主要蛋白質(zhì)含量的變化

田志環(huán)成永旭吳旭干劉 青

(1. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室, 上海 201306; 2. 廣東韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院, 韶關(guān) 512005)

中華絨螯蟹蛻殼過程中肌肉的組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)及主要蛋白質(zhì)含量的變化

田志環(huán)1,2成永旭1吳旭干1劉 青1

(1. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室, 上海 201306; 2. 廣東韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院, 韶關(guān) 512005)

為探討中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)蛻殼前后肌肉組織的形態(tài)特征變化, 采用石蠟切片、電鏡及生物化學(xué)方法, 研究了中華絨螯蟹蛻皮過程中步行足和腹部肌肉的組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)及主要蛋白質(zhì)含量的變化。結(jié)果顯示: 相對于蛻皮間期, 步行足在蛻皮前后組織學(xué)形態(tài)特征無明顯變化; 超微結(jié)構(gòu)在蛻皮前無明顯變化,蛻皮后可見肌原纖維縱裂及肌小節(jié)橫裂現(xiàn)象, 表明蛻皮后外骨骼硬化的過程伴隨著肌肉的生長。相對于蛻皮間期, 腹部肌肉在蛻皮前后組織學(xué)特征變化明顯: 蛻皮前肌束間隙增大, 蛻皮后肌束內(nèi)肌纖維間隙增大。電子顯微鏡觀察顯示, 蛻皮前肌原纖維在內(nèi)部降解, 出現(xiàn)空洞, 肌原纖維邊緣降解, 導(dǎo)致肌原纖維間隙增大; 蛻皮后肌原纖維重新組裝、重建, 恢復(fù)到間期正常形態(tài)。生物化學(xué)研究發(fā)現(xiàn), 蛻皮前后步行足和腹部肌肉中肌原纖維蛋白和可溶性蛋白含量的變化同其結(jié)構(gòu)特征的變化相一致。以上研究結(jié)果表明, 中華絨螯蟹肌肉組織的結(jié)構(gòu)特征同蛻皮周期密切相關(guān)。

組織學(xué); 超微結(jié)構(gòu); 肌原纖維蛋白; 可溶性蛋白; 蛻皮; 步行足; 腹部肌肉; 中華絨螯蟹

甲殼動物由于體表覆蓋著堅硬的外骨骼, 其生長發(fā)育和蛻皮周期密切相關(guān)。在蛻皮過程中, 甲殼動物發(fā)生一系列形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化及分子生物學(xué)方面的變化[1—5]。更為重要的是, 對甲殼動物來說, 蛻皮即意味著生長, 而衡量動物生長的一項重要指標(biāo)即肌肉的生長發(fā)育。目前, 國內(nèi)對于甲殼動物蛻殼與肌肉生長的關(guān)系并無相關(guān)研究, 對于蛻殼過程中肌肉生長及調(diào)節(jié)機制更是一無所知。本文以中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)為實驗對象, 研究其蛻皮前后肌肉組織的顯微結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)及主要蛋白質(zhì)含量的變化, 為后續(xù)研究蛻皮與肌肉生長在分子水平方面的變化及其調(diào)節(jié)機制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

一年生中華絨螯蟹取自上海海洋大學(xué)崇明養(yǎng)殖基地, 平均體重(8.24±2.17) g, 此體重的中華絨螯蟹性腺尚未發(fā)育, 故雌雄個體隨機取材。按照文獻[6, 7]的方法鑒定蛻皮周期, 分別取蛻皮間期C期、蛻皮前晚期D3-4期及蛻皮后A-B期個體, 按照圖 1所示, 分別取第3步行足前節(jié)的開肌及腹部第Ⅴ腹節(jié)肌肉進行研究。

1.2 實驗方法

組織學(xué)研究 按照圖 1所示, 取不同蛻皮時期中華絨螯蟹的肌肉組織, Bouin氏液固定24h, 系列酒精脫水, 二甲苯透明, 石蠟包埋, 常規(guī)切片, 切片厚度 6—8 μm。蘇木精-伊紅染色, 光學(xué)顯微鏡(Leica, RM2125 RTS)觀察拍照。

圖 1 中華絨螯蟹步行足和腹部肌肉示意圖Fig. 1 Diagram of the walking leg and abdomen muscle of Eriocheir sinensis

超微結(jié)構(gòu)研究 按照圖 1所示, 取不同蛻皮時期中華絨螯蟹的肌肉組織, 切成1 mm×1 mm× 1 mm的小塊, 立即投入2.5%的戊二醛固定液中固定2—24h, 然后于1%鋨酸后固定2h, 環(huán)氧樹脂包埋。常規(guī)超薄切片70—90 nm, 2%檸檬酸鉛和0.1%醋酸鈾雙重電子染色, 透視電子顯微鏡(JEM2100)觀察拍照。

肌纖維蛋白與可溶性蛋白含量測定 按照Saito等[8]的方法, 略作改動: 準(zhǔn)確稱取一定量的肌肉組織, 按1:4 (w/v)的比例加入0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液 (pH=7.4), 電動勻漿器勻漿2min, 4℃離心10min(轉(zhuǎn)速12000 r/min), 收集上清液, 重復(fù)上次步驟2次, 合并上清液待測蛋白含量。收集可溶性蛋白提取后剩余的沉淀, 按1:2(w/v)的比例加入含0.6 mol/L NaCl的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4), 電動勻漿器勻漿2min, 4℃離心10min (轉(zhuǎn)速12000 r/min), 收集上清液, 重復(fù)上次步驟2次, 合并上清液測定蛋白含量。蛋白質(zhì)含量測定試劑盒由南京建成生物公司提供。

數(shù)據(jù)處理 利用SPSS 17.0 軟件處理數(shù)據(jù), 采用單因素方差分析, 顯著性水平P＜0.05, 數(shù)值以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 不同部位肌肉組織在蛻皮間期的形態(tài)特征不同

步行足肌纖維多橢圓形, 多核, 細胞核位于肌膜(細胞膜)下方, 并且肌纖維排列疏松、游離, 不形成肌肉束(圖 2a)。腹部肌肉肌纖維為不規(guī)則塊狀,排列緊密, 幾到十幾束肌纖維聚集成束, 形成肌肉束(圖 2b, 箭頭所示), 外包結(jié)締組織形成的肌束膜。電子顯微鏡下, 步行足肌節(jié)長度約為(3.80± 0.17) μm, A、I帶和Z線清晰可見, H帶隱約可見。肌原纖維之間分布著大量肌質(zhì)網(wǎng)及二連體(圖 3a)。腹部肌原纖維的肌節(jié)長度約為(4.44±0.45) μm, H帶不明顯(圖 3b)。

2.2 不同部位肌肉組織蛻皮前后結(jié)構(gòu)特征變化不同

步行足 組織切片上步行足蛻皮前后看不出明顯變化(圖 4)。電子顯微鏡觀察顯示, 與蛻皮間期相比, 蛻皮前肌原纖維結(jié)構(gòu)無明顯變化, 蛻皮后可見縱裂的纖維束及肌節(jié)橫裂, 顯示肌纖維的生長(圖 5)。

圖 2 中華絨螯蟹蛻皮間期C期步行足(a)和腹部肌肉(b)的組織學(xué)特征Fig. 2 Histology of walking leg muscle (a) and abdominal muscle (b) of E. sinensis in intermolt C stage箭頭示纖維束(標(biāo)尺: 100 μm)Fiber bundles are indicated by arrowheads. Scale bar: 100 μm

腹部肌肉 與蛻皮間期相比, 蛻皮前腹部肌肉組織的肌束間隙有所增大, 但肌纖維無明顯萎縮。蛻皮后可見肌束膜內(nèi)肌纖維間隙增大(圖 6)。電子顯微鏡切片顯示, 腹部肌肉組織在蛻皮前肌原纖維有降解現(xiàn)象, 肌原纖維內(nèi)部出現(xiàn)空洞, 肌原纖維間隙增大, 嚴(yán)重者Z線斷裂、消失。蛻皮后, 肌原纖維得以重建、恢復(fù), 但彎曲、折疊, 在縱切面上肌絲斷斷續(xù)續(xù), I帶、A帶不明顯(圖 7)。

圖 3 中華絨螯蟹蛻皮間期C期步行足(a)和腹部肌肉(b)的超微結(jié)構(gòu)Fig. 3 Ultrastructure of walking leg muscle (a) and abdominal muscle (b) of E. sinensis in inter-molt C stageA. A帶, I. Z帶, H. H帶, Z. Z線, D. 二聯(lián)體, T. 三聯(lián)體, SR. 肌質(zhì)網(wǎng)A band (A), I band (I), H band (H), Z line (Z), dyad (D), triplet (T) and sarcoplasmic reticulum (SR) are indicated

圖 4 中華絨螯蟹蛻皮前晚期D3-4期(a)和蛻皮后A-B期(b)步行足的組織學(xué)特征(標(biāo)尺: 100 μm)Fig. 4 Histology of walking leg muscle of E. sinensis in later pre-molt D3-4stage (a) and post-molt A-B stage (b). Scale bar: 100 μm

圖 5 中華絨螯蟹蛻皮前晚期D3-4期(a)和蛻皮后A-B期(b)步行足超微結(jié)構(gòu)

2.3 肌肉組織肌原纖維蛋白和可溶性蛋白含量的變化

從蛻皮后A-B期至蛻皮間期C期, 步行足和腹部肌肉肌原纖維蛋白含量都有所增加; 從蛻皮間期C期到蛻皮前晚期D3-4期, 步行足肌原纖維蛋白含量略有升高, 而腹部肌肉肌原纖維蛋白含量略有下降?？扇苄缘鞍缀孔兓c此有所不同, 在所測量的3個時期, 步行足和腹部肌肉的可溶性蛋白含量都是在蛻皮前晚期D3-4期最高, 蛻皮后A-B期可溶性蛋白含量最低, 此后逐漸升高, 恢復(fù)到蛻皮間期水平(圖 8)。

3 討論

3.1 中華絨螯蟹蛻殼前后肌肉組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化

甲殼動物肌纖維按肌節(jié)長度主要分為長肌節(jié)纖維(＞6 μm)、短肌節(jié)纖維(＜4 μm)和混合型肌節(jié)纖維(4—6 μm)[9]。不同長度的肌纖維形態(tài)特征不同:長肌節(jié)纖維Z線彎曲不平整, H帶不明顯, 短肌節(jié)纖維Z線平直, H帶可見, 混合型肌節(jié)纖維介于二者之間[10—12]。很明顯, 中華絨螯蟹步行足屬于短肌節(jié)纖維, 而腹部肌肉屬于混合肌節(jié)纖維, 二者的超微結(jié)構(gòu)特征差異明顯(圖 3)。在光學(xué)顯微鏡下, 步行足和腹部肌肉的組織學(xué)特征也是差異明顯, 前者肌纖維游離, 沒有形成肌纖維束; 后者肌纖維聚集成束,外包肌束膜。不同部位肌肉組織結(jié)構(gòu)的特征和它們的功能相適應(yīng), 游離、無肌束膜包裹的肌纖維更有利于步行足在不同方向的靈活運動。

圖 6 中華絨螯蟹蛻皮前晚期D3-4期(a)和蛻皮后A-B期(b)腹部肌肉的組織學(xué)特征Fig. 6 Histology of abdominal muscle of E. sinensis in later pre-molt D3-4stage (a) and post-molt A-B stage (b)箭頭示增大的纖維束間隙, 星號示增大的肌纖維間隙(標(biāo)尺: 100 μm)The enlarged space of fiber bundles and fibers are indicated by arrowheads and stars respectively. Scale bar: 100 μm

圖 7 中華絨螯蟹蛻皮前晚期D3-4期(a)和蛻皮后A-B期(b)腹部肌肉超微結(jié)構(gòu)Fig. 7 Ultrastructure of abdominal muscle of E. sinensis in later pre-molt D3-4stage (a) and post-molt A-B stage (b)M. 線粒體, Z. Z線, 箭頭示內(nèi)部空洞, 星號示增大的肌原纖維間隙The mitochondrion (M) and Z line (Z) are indicated. The erosions in myofibrilla and enlarged space of myofibrilla are indicated by arrowheads and stars respectively

甲殼動物的肌肉纖維, 一端附著于甲殼上, 一端附著于表皮內(nèi)突。剛蛻殼的動物, 甲殼柔軟, 隨著甲殼的硬化, 動物身體由于吸水膨脹而長大。在這一過程中, 肌肉纖維必須隨著甲殼的硬化而伸長來適應(yīng)增大了的外骨骼。對于龍蝦及蟹類等外骨骼鈣化程度較高的種類, 螯足與身體連接處狹窄,蛻皮前肌肉纖維發(fā)生降解以順利蛻出, 蛻皮后肌肉組織重建以適應(yīng)寬大的外骨骼[9,13,14](中華絨螯蟹相關(guān)數(shù)據(jù)將另文發(fā)表)。對于步行足而言, 其肌肉組織不如螯足寬大, 步足肌肉蛻殼時可順利通過各關(guān)節(jié), 所以蛻殼前肌纖維沒有明顯的萎縮、降解,其組織學(xué)特征于蛻殼前后無明顯變化。步足肌肉的超微結(jié)構(gòu)在蛻皮前亦無明顯變化, 蛻皮后, 可見有些肌原纖維內(nèi)部縱裂, 有些肌原纖維在H帶橫向斷裂, 形成新的Z線(圖 5)。肌纖維的生長包括兩方面, 增粗和伸長。根據(jù)現(xiàn)有資料, 節(jié)肢動物肌纖維的增粗源自肌原纖維的橫向生長, 即肌原纖維縱裂;伸長則源自肌原纖維的縱向生長, 通常有3種方式, (1)現(xiàn)有肌小節(jié)長度的增加, (2)肌原纖維末端添加肌小節(jié)數(shù)目, (3)通過Z線裂開或者肌節(jié)橫裂添加肌小節(jié)數(shù)目[15—21]。通常來說, 甲殼動物的短肌節(jié)纖維肌小節(jié)長度不會變化太多, 推測其肌纖維伸長主要是靠增加肌小節(jié)數(shù)目來完成[16,18], 至于新的肌小節(jié)是在肌纖維附著的甲殼端增加, 還是表皮內(nèi)突端增加, 或者兩端同時增加, 目前還不清楚[9]。目前所能觀察到的, 多是通過肌節(jié)橫裂或者Z線裂開的方式增加肌小節(jié)的數(shù)目[19—21]。在本研究中, 中華絨螯蟹步行足肌纖維肌小節(jié)長度在蛻皮間期、前期和后期分別為(3.80±0.17)、(3.7±0.4)和(3.6 ±0.11) μm,無明顯差異。蛻皮后發(fā)現(xiàn)肌原纖維縱裂, 以此增加肌纖維的橫截面積; 肌節(jié)橫裂以增加肌小節(jié)數(shù)目,以此增加肌纖維長度。肌節(jié)橫裂表現(xiàn)為在H帶, 形成新的Z線, 進而形成新的肌小節(jié)。

中華絨螯蟹腹部肌肉屬于混合肌節(jié), 蛻皮前有較大的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征變化。蟹類在蛻殼時, 頭胸甲和腹節(jié)的裂縫不斷增大, 腹部首先由此蛻出。腹部肌肉在蛻出時雖不如螯足肌肉發(fā)生顯著的肌纖維降解, 但也表現(xiàn)出纖維束之間的間隙增大, 提示纖維束橫截面積的縮小。電子顯微觀察則顯示肌絲發(fā)生了降解, 表現(xiàn)為肌原纖維內(nèi)部出現(xiàn)空洞, 肌原纖維間隙增大, 二聯(lián)體、肌質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)消失或者破壞。在蛻皮后, 降解的肌絲開始組裝, 逐步重建恢復(fù)。隨著動物吸水膨脹, 外骨骼逐漸硬化, 肌纖維亦隨之膨脹、伸展, 恢復(fù)到間期狀態(tài), 從而完成生長。

圖 8 中華絨螯蟹蛻皮過程中步行足和腹部肌肉主要蛋白質(zhì)含量的變化Fig. 8 Changes in main protein content in walking leg and abdominal muscle of E. sinensis during the molt cycleA-B. 蛻皮后A-B期, C. 蛻皮間期, D3-4. 蛻皮前晚期D3-4A-B. post-molt A-B stage, C. inter-molt stage, D3-4. later pre-molt D3-4stage

3.2 中華絨螯蟹蛻殼前后肌肉組織主要蛋白質(zhì)含量的變化

在肌肉組織中肌原纖維蛋白和可溶性蛋白含量的變化和步行足及腹部肌肉的結(jié)構(gòu)特征變化是一致的。肌原纖維蛋白, 是肌肉組織的主要成分,主要包括肌球蛋白、肌動蛋白、肌原蛋白和肌原球蛋白等, 是組裝成肌原纖維(粗肌絲和細肌絲)的原料[5,22,23]。蛻皮后A-B期至蛻皮間期C期, 正是外骨骼逐漸硬化的過程, 亦是肌纖維生長的過程, 所以不論是步行足還是腹部肌肉, 此過程肌原纖維蛋白含量增加。由于步行足在整個蛻皮過程中肌肉纖維無萎縮、降解現(xiàn)象, 所以從蛻皮間期C期至蛻皮前晚期D3-4期, 其肌原纖維蛋白含量仍有升高, 有利于蛻皮后肌纖維的組裝生長[24]。而腹部肌肉在蛻皮前有較大的組織形態(tài)變化, 肌絲降解, 其肌原纖維蛋白含量于蛻皮前D3-4期有所降低。

肌肉中的可溶性蛋白又稱作肌漿蛋白, 主要包括肌清蛋白、肌紅蛋白、蛋白酶、糖水解酶、肌酸激酶等。甲殼動物在蛻皮前會進行一系列生理準(zhǔn)備, 合成蛻皮所需的各種酶、調(diào)節(jié)因子及受體[9,22,23]。已有研究顯示[24], 甲殼動物蛻皮前肌肉組織中可溶性蛋白和肌原纖維蛋白合成速度都大于蛻皮間期, 而可溶性蛋白的合成速度更是肌原纖維蛋白合成速度的3.2倍。在本研究中, 蛻皮前步行足和腹部肌肉組織的可溶性蛋白含量在蛻皮前D3-4期均有升高, 蛻皮后A-B期則降到最低水平, 以利于肌原纖維的生長, 此后逐漸恢復(fù)到蛻皮前期水平。

目前對于水產(chǎn)甲殼動物肌肉生長發(fā)育的研究還很薄弱, 本文初步研究了中華絨螯蟹步行足和腹部肌肉在蛻皮前后的形態(tài)特征變化, 后續(xù)將在分子水平研究其蛻皮過程中不同部位肌肉的生長變化及調(diào)節(jié)機制, 以促進甲殼動物基礎(chǔ)生物學(xué)研究, 從而豐富動物肌肉生長發(fā)育理論。

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CHANGES OF HISTOLOGY, ULTRASTRUCTURE AND MAIN PROTEIN IN MUSCLES OF CHINESE MITTEN CRAB, ERIOCHEIR SINENSIS DURING THE MOLT CYCLE

TIAN Zhi-Huan1,2, CHENG Yong-Xu1, WU Xu-Gan1and LIU Qing1
(1. Key Laboratory of Freshwater Fishery Germplasm Resources of Ministry of Agriculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. College of Yingdong Life Science, Shaoguan University, Shaoguan 512005, China)

To investigate morphological characteristic of muscles in Eriocheir sinensis before and after molt, histology, ultrastructure and main protein contents in walking leg and abdominal muscles of E. sinensis during molt cycle were studied. The results showed that the histology of walking leg muscle at pre- and post-molt was similar with inter-molt. Their ultrastructure had no obvious change in pre-molt stage compared with inter-molt, and it took on visible myofibrillar fissure and sarcomere transverse crack in post-molt, indicating that the muscle was growing while the exoskeleton was hardening. In termers of abdominal muscle, enlarged muscle bounds space in pre-molt stage and enlarged muscle fibers space in post-molt stage were observed. Moreover, there were erode area in myofibril and enlarged inter-myofibril space in pre-molt. The myofibril re-assembled in post-molt and re-covered to the normal form of inter-molt. Myofibrillar protein and soluble protein content in walking leg and abdominal muscle fluctuated and agreed well with their structure. The results indicate that the structural characters of walking leg and abdominal muscles of E. sinensis are closely related to the animal’s molt stage.

Histology; Ultrastructure; Myofibrillar protein; Soluble protein; Molting; Walking leg; Abdominal muscles; Eriocheir sinensis

10.7541/2017.129

2016-09-18;

2017-02-14

國家自然科學(xué)基金(31572635); 科技部港澳臺科技合作專項項目(2014DFT30270); 上海市科學(xué)技術(shù)委員會科研項目(16DZ2281200); 上海高校水產(chǎn)學(xué)高峰學(xué)科建設(shè)項目(2015-62-0908)資助 [Supported by the Grant from National Natural Science Foundation of China (31572635); The Hongkong, Macao and Taiwan Science and Technology Cooperation Projects (2014DFT30270); The Projects (16DZ2281200) from Shanghai Municipal Science and Technology Commission; The Shanghai Universities First-class Disciplines Project of Fisheries (2015-62-0908) from Shanghai Municipal Education Committee]

田志環(huán)(1971—), 女, 山東省夏津縣人; 博士, 副教授; 研究方向為甲殼動物生長發(fā)育。E-mail: tianzhihuan@126.com

成永旭(1964—), 男, 教授, 博士生導(dǎo)師; 研究方向為甲殼動物營養(yǎng)繁殖學(xué)。E-mail: yxcheng@shou.edu.cn

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1000-3207(2017)05-1036-06