逆針灸對(duì)慢性疲勞大鼠血清ACTH、CORT、CRH的影響*

華金雙，傅 文，邵伯雍

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046)

·實(shí)驗(yàn)研究·

逆針灸對(duì)慢性疲勞大鼠血清ACTH、CORT、CRH的影響*

華金雙1，傅 文2，邵伯雍2

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046)

目的：探討逆針灸對(duì)慢性疲勞大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)醇(CORT)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)的影響。方法：將40只SD大鼠隨機(jī)分為4組，即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、逆針灸1組、逆針灸2組,每組10只。模型對(duì)照組先平行飼養(yǎng)，然后采用多因素刺激相結(jié)合的辦法制備慢性疲勞大鼠模型，共44 d。逆針灸1組、逆針灸2組在制備模型前依次先給予大鼠電針刺激10 d、20 d，然后再制備慢性疲勞大鼠模型。正常對(duì)照組不予任何處理，平行飼養(yǎng)。分別于實(shí)驗(yàn)第1天和最后1天進(jìn)行開(kāi)野實(shí)驗(yàn)檢測(cè)；采用 ELISA 法檢測(cè)各組大鼠血清 ACTH、CORT 、CRH含量。結(jié)果：①實(shí)驗(yàn)第44天，與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組、逆針灸1組、逆針灸2組大鼠水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)得分明顯下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型對(duì)照組大鼠對(duì)比，逆針灸1組、逆針灸2組大鼠水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)得分明顯增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；逆針灸1組、逆針灸2組大鼠水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)得分對(duì)比，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。②與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組、逆針灸1組、逆針灸2組大鼠血清ACTH、CORT、CRH含量明顯增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型對(duì)照組對(duì)比，逆針灸1組、逆針灸2組大鼠血清ACTH、CORT、CRH含量明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；逆針灸1組血清ACTH、CORT含量較逆針灸2組明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；逆針灸2組血清CRH含量較逆針灸1組明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論：逆針灸能通過(guò)調(diào)控下丘腦-垂體-腎上腺軸降低慢性疲勞大鼠血清ACTH、CORT、CRH含量，減輕或抵抗隨后長(zhǎng)期的應(yīng)激刺激對(duì)機(jī)體的損害，從而發(fā)揮防治作用。

逆針灸/作用；慢性疲勞綜合征/針灸療法；開(kāi)野實(shí)驗(yàn)；ACTH；CORT；CRH；動(dòng)物；大鼠

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)是一種以長(zhǎng)期或慢性反復(fù)發(fā)作的極度疲勞為突出表現(xiàn)，同時(shí)伴有低熱、咽喉痛、淋巴結(jié)腫痛、肌肉酸痛、關(guān)節(jié)疼痛、神經(jīng)精神癥狀、睡眠障礙等其他非特異性表現(xiàn)的綜合征。目前CFS的發(fā)病機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CFS的發(fā)生與應(yīng)激、下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)功能異常關(guān)系密切。研究[1-3]顯示：引發(fā)慢性疲勞綜合征的強(qiáng)有力因素是緊張的生活事件以及隨之而來(lái)的HPA軸功能障礙。根據(jù)美國(guó)疾病控制中心的診斷標(biāo)準(zhǔn)，該病從開(kāi)始出現(xiàn)癥狀到明確診斷至少有6個(gè)月的潛伏時(shí)間。此時(shí)期，疾病尚處于萌芽階段，若能積極采取預(yù)防措施，則有可能防止病情的進(jìn)一步發(fā)展，促使疾病早期治愈。李曉泓[4]認(rèn)為：逆針灸可以啟動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，對(duì)機(jī)體進(jìn)行調(diào)整，因此預(yù)先在“未病”機(jī)體上給予針灸刺激，能夠提高機(jī)體的抵抗力與應(yīng)變能力，減輕隨后疾病的損害，是一種激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生良性應(yīng)激的有效手段。研究[5]發(fā)現(xiàn)：逆針灸可使腦內(nèi)遞質(zhì)、受體、轉(zhuǎn)錄調(diào)控類(lèi)基因、熱休克反應(yīng)等眾多基因發(fā)生變化,從而對(duì)隨后的疾病起到未病先防、防患于未然的作用?；诖耍緦?shí)驗(yàn)通過(guò)觀(guān)察逆針灸對(duì)慢性疲勞大鼠HPA軸的影響，探討逆針灸對(duì)慢性疲勞大鼠可能的保護(hù)作用，以期為慢性疲勞綜合征的超早期防治提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

雄性SD大鼠，體質(zhì)量(180±20)g，清潔級(jí)，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于溫度(18～25 ℃)和濕度(55%±2%)相對(duì)恒定的動(dòng)物飼養(yǎng)室，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 試劑與儀器

促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)醇(CORT)、 促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)試劑盒，均為江蘇卡爾文生物科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)依次為20160319A，20160310A，20160319A。華佗牌一次性針灸針，規(guī)格為直徑0.30 mm、長(zhǎng)度25 mm，蘇州醫(yī)療用品有限公司產(chǎn)品。佳健CMNS6-Ⅰ型電子針灸治療儀，無(wú)錫佳健醫(yī)療器械股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將40只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、逆針灸1組和逆針灸2組，每組10只。

1.4 模型的建立

模型對(duì)照組和預(yù)處理后的逆針灸組采用多因素刺激方法制備慢性疲勞大鼠模型。①冷水游泳：大鼠游泳桶寬40 cm、高50 cm，大鼠游泳時(shí)水深40 cm，水溫21 ℃左右，每次游泳30 min。②束縛法：束縛大鼠四肢，每次3 h。③晝夜顛倒1次。第1個(gè)2 4 h，無(wú)措施。第2個(gè)24 h早8:30用晝夜顛倒鼠籠罩罩住鼠籠，模擬夜晚；晚8:30給予日光燈持續(xù)照明，模擬白晝。每次隨機(jī)安排1種，使動(dòng)物不能預(yù)料刺激的發(fā)生，以避免產(chǎn)生適應(yīng)性。共21 d。

1.5 針刺方法

逆針灸1組：大鼠先平行飼養(yǎng)10 d，再給予電針刺激10 d，然后制備慢性疲勞大鼠模型。穴位選取百會(huì)、足三里、三陰交、太沖。頭部穴位平刺進(jìn)針，四肢穴位直刺進(jìn)針，用30號(hào)1寸毫針，深度為0.5～1 cm，電針頻率為2 Hz，電流強(qiáng)度為0.6 mA，以大鼠頭部微顫為宜。每次20 min。5 d為1個(gè)療程，中間休息1 d，共4個(gè)療程。逆針灸2組：先給予大鼠電針刺激20 d，再制備慢性疲勞大鼠模型。針灸操作同逆針灸1組。模型對(duì)照組和正常對(duì)照組同逆針灸組平行飼養(yǎng)，不做任何處理。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 開(kāi)野實(shí)驗(yàn)(open-field)

分別于實(shí)驗(yàn)第1天和最后1天進(jìn)行。方法：將大鼠置于敞箱底面的中心方格內(nèi)，記錄大鼠水平運(yùn)動(dòng)得分和垂直運(yùn)動(dòng)得分。水平運(yùn)動(dòng)得分標(biāo)準(zhǔn)為：動(dòng)物穿越底面塊數(shù)(四爪均進(jìn)入的方格方可記數(shù))，每穿越1塊計(jì)1分。垂直運(yùn)動(dòng)得分標(biāo)準(zhǔn)為：大鼠后腿直立次數(shù)(兩前爪騰空或攀附箱壁)，每次計(jì)1分。每次測(cè)定時(shí)間6 min。

1.6.2 血清ACTH、CORT、CRH含量

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，逆針灸兩個(gè)組各死亡1只大鼠。稱(chēng)量剩余大鼠體質(zhì)量并記錄，根據(jù)體質(zhì)量，以100 g/L水合氯醛3μL/g體質(zhì)量腹腔麻醉大鼠；將麻醉后的大鼠平鋪于操作臺(tái)上，切開(kāi)腹部，暴露下腔腹主動(dòng)脈；用注射器抽取5 mL血液，迅速注入試管中，靜置2 h后，3 000 r/min離心10 min；取上清液，注入一次性EP管中，做好標(biāo)記，放入- 70 ℃冰箱中保存待檢。采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清ACTH、CORT、CRH含量，均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠開(kāi)野實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

各組大鼠實(shí)驗(yàn)第1天水平運(yùn)動(dòng)得分對(duì)比，P>0.05，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明各組基線(xiàn)情況一致，具有可比性。實(shí)驗(yàn)第44天：除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠水平運(yùn)動(dòng)得分均較第1天明顯減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組、逆針灸1組、逆針灸2組大鼠水平運(yùn)動(dòng)得分明顯下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對(duì)照組大鼠對(duì)比，逆針灸1組、逆針灸2組大鼠水平運(yùn)動(dòng)得分明顯增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。逆針灸1組、逆針灸2組大鼠水平運(yùn)動(dòng)得分對(duì)比，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠水平運(yùn)動(dòng)得分對(duì)比 分，±s

注：與同組實(shí)驗(yàn)前對(duì)比，*P<0.05;與同時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組對(duì)比，##P<0.01;與同時(shí)間點(diǎn)模型對(duì)照組對(duì)比，ΔP<0.05;與同時(shí)間點(diǎn)逆針灸1組對(duì)比，＊P>0.05。

各組大鼠實(shí)驗(yàn)第1天垂直運(yùn)動(dòng)得分對(duì)比，P>0.05，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明各組基線(xiàn)情況一致，具有可比性。實(shí)驗(yàn)第44天：除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠垂直運(yùn)動(dòng)得分均較第1天明顯減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組、逆針灸1組、逆針灸2組大鼠造模后垂直運(yùn)動(dòng)得分明顯減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，逆針灸1組、逆針灸2組大鼠垂直運(yùn)動(dòng)得分明顯增多，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。逆針灸1組和2組垂直運(yùn)動(dòng)得分對(duì)比，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠垂直運(yùn)動(dòng)得分對(duì)比 分，±s

注：與同組實(shí)驗(yàn)前對(duì)比，*P<0.05;與同時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組對(duì)比，##P<0.05;與同時(shí)間點(diǎn)模型對(duì)照組對(duì)比，ΔP<0.05;與同時(shí)間點(diǎn)逆針灸1組對(duì)比，＊P>0.05。

2.2 各組大鼠血清ACTH、CORT、CRH含量對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組、逆針灸1組、逆針灸2組大鼠血清ACTH、CORT、CRH含量明顯增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對(duì)照組對(duì)比，逆針灸1組、逆針灸2組大鼠血清ACTH、CORT、CRH含量明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。逆針灸1組血清ACTH、CORT含量較逆針灸2組明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。逆針灸2組血清CRH含量明顯降低，與逆針灸1組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。

組 別動(dòng)物數(shù)ACTH/(ng·L-1)CORT/(μg·L-1)CRH/(ng·L-1)正常對(duì)照組1019．343±2．498159．635±21．18921．497±3．197模型對(duì)照組1052．128±5．030???304．190±26．685???57．436±4．421???逆針灸1組934．177±2．649???###200．997±14．397???###42．074±2．925???###逆針灸2組937．932±2．762???###ΔΔ219．173±15．065???###ΔΔ35．992±4．031???###ΔΔΔ

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，***P<0.01；與模型對(duì)照組對(duì)比，###P<0.01；與逆針灸1組對(duì)比，ΔΔP<0.05; ΔΔΔP<0.01。

3 討 論

現(xiàn)代研究已證實(shí)：慢性疲勞綜合征患者的慢性疲勞、焦慮等臨床癥狀與HPA軸功能異常關(guān)系十分密切。HPA軸的主要作用是維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和應(yīng)激反應(yīng)的應(yīng)答。當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)期處于慢性應(yīng)激刺激時(shí)，HPA軸會(huì)被激活，處于異常狀態(tài)，使CORT和其他激素釋放的增加,從而導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)分泌、免疫等系統(tǒng)功能紊亂，產(chǎn)生多種癥狀[6-7]。應(yīng)激信號(hào)通過(guò)相應(yīng)的神經(jīng)遞質(zhì)將信息匯聚于下丘腦室旁核,這些神經(jīng)元合成CRH，并刺激垂體前葉合成、分泌ACTH，最終ACTH釋放入周?chē)h(huán)，刺激腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞合成、釋放以CORT為主體的糖皮質(zhì)激素。CRF是機(jī)體調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子，CORT是HPA軸的最終效應(yīng)器,它可以負(fù)反饋地調(diào)節(jié)CRF和ACTH的分泌,抑制HPA軸興奮性,形成HPA軸的環(huán)行調(diào)節(jié)通路。可以看出：下丘腦、垂體和腎上腺組成一個(gè)相互協(xié)調(diào)的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，從而維持血中CORT濃度的相對(duì)穩(wěn)定和應(yīng)激狀態(tài)下的適應(yīng)性反應(yīng)。大量臨床研究[8-11]表明了針灸能明顯改善慢性疲勞綜合征患者的臨床癥狀，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[12-13]也顯示了針灸對(duì)慢性疲勞大鼠神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)，尤其是對(duì)HPA軸的良性調(diào)節(jié)作用,這些研究為逆針灸防治慢性疲勞大鼠奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

逆針灸一詞，首見(jiàn)于明代高武的《針灸聚英》[14]，原文為“無(wú)病而先針灸曰逆。逆,未至而迎之也” 。意即：在機(jī)體健康無(wú)病、疾病即將發(fā)生之前或疾病輕淺之時(shí)預(yù)先采用針灸方法激發(fā)經(jīng)絡(luò)之氣，提高正氣，平衡陰陽(yáng)，可以防止疾病發(fā)生，減輕疾病損害的程度。本研究所選足厥陰肝經(jīng)之原穴太沖，具疏肝解郁、調(diào)暢氣機(jī)之效；足太陰脾經(jīng)之三陰交，配伍足陽(yáng)明胃經(jīng)之足三里穴，可健脾和胃，調(diào)和氣血，共奏調(diào)暢氣機(jī)、補(bǔ)益氣血、強(qiáng)筋壯骨之功；百會(huì)為督脈穴，督脈通于腦，具有健腦寧神之功。四穴合用，調(diào)暢氣機(jī)，調(diào)和氣血，扶正固本，能有效地調(diào)動(dòng)機(jī)體的自我防御能力，從而對(duì)機(jī)體隨后的紊亂狀態(tài)做出良性調(diào)整，起到防病治病的作用。

本研究中的開(kāi)野實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：除正常對(duì)照組外，各組大鼠水平運(yùn)動(dòng)得分和垂直運(yùn)動(dòng)得分均明顯降低。此說(shuō)明經(jīng)過(guò)多種慢性應(yīng)激因素所致的慢性疲勞模型大鼠自主探索行為明顯降低，并伴有心理焦慮；而提前給予逆針灸干預(yù)則能明顯改善大鼠的自主探索行為，增加水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)得分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：逆針灸具有調(diào)節(jié)作用。此外，本研究中模型對(duì)照組大鼠血清ACTH、CORT、CRH含量明顯增加(P<0.01)，提示長(zhǎng)期應(yīng)激刺激可使HPA軸持續(xù)亢進(jìn)，血中ACTH、CORT、CRH含量升高，超過(guò)了大鼠自身調(diào)節(jié)的范圍，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)造模方法是成功的。逆針灸1組、2組與模型對(duì)照組對(duì)比，血清ACTH、CORT、CRH含量顯著降低(P<0.01)，提示通過(guò)預(yù)先電針干預(yù)，可能啟動(dòng)了機(jī)體內(nèi)部的保護(hù)機(jī)制，當(dāng)再次受到長(zhǎng)期應(yīng)激刺激時(shí)，通過(guò)機(jī)體自身的調(diào)整，能有效地維持HPA軸的環(huán)行調(diào)節(jié)通路，使機(jī)體對(duì)再次的不良刺激產(chǎn)生相對(duì)穩(wěn)定的適應(yīng)性反應(yīng)，這可能是逆針灸防治慢性疲勞綜合征的機(jī)制之一。慢性疲勞綜合征的病因病機(jī)十分復(fù)雜，需要體內(nèi)諸多細(xì)胞因子、基因等共同參與完成。逆針灸雖然是一種有效的預(yù)處理手段，但其對(duì)慢性疲勞大鼠的預(yù)防作用應(yīng)是多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)的綜合干預(yù)，因此對(duì)逆針灸的作用環(huán)節(jié)尚需進(jìn)一步深入研究。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2017)08-0067-04

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10.3969/j.issn.1001-6910.2017.08.29

華金雙(1974-)，女(漢族)，黑龍江大慶人，副教授，博士，研究方向：針灸防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)研究。

河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(15A360023)

2017-03-06；

2017-07-14