浙江麗水中華蜜蜂線粒體遺傳多樣性分析

曹聯(lián)飛，顧佩佩，林宇清1

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州310021；2.麗水市畜牧獸醫(yī)局，浙江麗水323000）

浙江麗水中華蜜蜂線粒體遺傳多樣性分析

曹聯(lián)飛1*，顧佩佩2，林宇清21

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州310021；2.麗水市畜牧獸醫(yī)局，浙江麗水323000）

為了解浙江省麗水市中華蜜蜂（中蜂）的遺傳多樣性及分類地位，基于mtDNA tRNAleu～COⅡ序列對麗水市9個區(qū)縣共94個中蜂樣本進(jìn)行序列測定和相關(guān)分析。群體多樣性分析顯示：麗水市中蜂的平均核苷酸多樣度（Pi）為0.003 52，平均單倍型多樣度（Hd）為0.772±0.036，多樣性較高；共發(fā)現(xiàn)20個單倍型，其中主體單倍型占總樣本數(shù)的41.5%，與已報道的福建主體單倍型以及廣州序列相同，支持麗水中蜂劃為華南中蜂類型；麗水中蜂的第二大單倍型的分布頻率與福建中蜂明顯不同，同時首次報道2個新發(fā)現(xiàn)的單倍型，提示麗水中蜂有其獨(dú)特的遺傳背景。單倍型聚類分析顯示，麗水中蜂的單倍型與地理分布有較大關(guān)系，說明麗水多山環(huán)境的地理隔離可能形成了地區(qū)間中蜂的分化。該研究為麗水中華蜜蜂的資源保護(hù)及開發(fā)利用提供了重要的理論依據(jù)。

麗水市；中華蜜蜂；遺傳多樣性；線粒體DNA

SummaryApis cerana cerana is a native honeybee species in China,which is widely distributed in all parts of the country,especially in the hills and mountains of the South China.Apis mellifera was introduced into China in the end of the 19th century.With interspecific competition and destruction of ecological environment,the number of Apis cerana cerana colonies in China declined sharply.In 2006,Apis cerana cerana was among the List of the Genetic Resources of Livestock and Poultry under Protection in China.

Located in the southwest of Zhejiang Province,China,Lishui City is a mountainous area and known as“the first ecological city in China”with the forest coverage rate of 80.8%and a variety of climate and vegetation.Lishui has a long history of raising Apis cerana cerana.In recent years,the number of Apis cerana cerana colonies in Lishui increased significantly.In order to understand the genetic diversity and taxonomic status of Apis cerana cerana in Lishui,the mitochondrial DNA tRNAleu-COⅡsequences of 94 samples from each district and county of Lishui were determined and further analyzed in the study.

It was shown that the nucleotide polymorphism(Pi)was 0.003 52 and the haplotype diversity(Hd)was 0.772±0.036, which indicated that the genetic diversity of Apis cerana cerana in Lishui was high.Twenty haplotypes were found in 94honeybee colonies.The main haplotype was found in 41.5%of the honeybee colonies and was identical to the main haplotype which was found in Apis cerana cerana in Fujian Province and also was identical to the sequence found in Guangzhou.Therefore,the results support Apis cerana cerana in Lishui belongs to the honeybee type of South China. However,the second most common haplotype in Lishui was different from that in Fujian Province.There were also two new haplotypes found in Lishui.The results indicated that Apis cerana cerana in Lishui had a unique genetic background. Furthermore,cluster analysis showed that the clusters of the haplotypes were closely associated with their geographical distribution,which indicated that different geographic Apis cerana cerana populations had been possibly differentiated by the geographical isolation in mountainous areas of Lishui.The above results are of great significance to the protection and reasonable use of the genetic resources of Apis cerana cerana in Lishui.

中華蜜蜂（Apis cerana cerana）簡稱中蜂，是中國境內(nèi)東方蜜蜂（Apis cerana）的總稱，廣泛分布于除新疆以外的全國各地，特別是南方的丘陵、山區(qū)[1]。中蜂善于采集零星蜜源，抗逆能力強(qiáng)，適合山區(qū)定地飼養(yǎng)，在我國具有悠久的飼養(yǎng)歷史，其傳粉作用對形成我國獨(dú)特的植被體系、保證植物繁衍生息和維護(hù)生態(tài)平衡均起著重要作用。19世紀(jì)末西方蜜蜂開始引入我國，中蜂在種間競爭中處于劣勢，加之自然生態(tài)環(huán)境的破壞，我國中蜂數(shù)量銳減[2]。2006年，中蜂被列入《國家級畜禽遺傳資源保護(hù)名錄》。

麗水位于浙江省西南部，以山區(qū)為主，森林覆蓋率達(dá)到80.8%，具有多樣性的氣候與植被，被譽(yù)為“中國生態(tài)第一市”。麗水市中蜂養(yǎng)殖歷史悠久，各個區(qū)縣均有分布。近年來，基于生態(tài)優(yōu)勢，麗水市政府加大了對中蜂資源的保護(hù)與利用，同時將中蜂養(yǎng)殖作為山區(qū)農(nóng)民脫貧增收的重要產(chǎn)業(yè)，中蜂數(shù)量明顯增加，2016年麗水市被授予“中國蜜蜂之鄉(xiāng)”。

遺傳多樣性研究是中蜂有效保護(hù)與合理利用的基礎(chǔ)。目前，我國中蜂可劃分為北方中蜂、華南中蜂、華中中蜂、云貴高原中蜂、長白山中蜂、海南中蜂、阿壩中蜂、滇南中蜂和西藏中蜂等9個類型[1]。由于蜜蜂是社會性昆蟲，同一個蜂群中的所有工蜂具有相同的母系，因而近年來線粒體DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）在中蜂的遺傳多樣性研究中得到了大量應(yīng)用[3]。姜玉鎖等[4]利用mtDNA分析發(fā)現(xiàn)我國境內(nèi)不同地理型中蜂存在著較明顯的遺傳分化。周姝婧等[5]、YIN等[6]和谷瑛等[7]利用mtDNA分別對福建、云南、重慶的中蜂進(jìn)行了遺傳多樣性分析，均發(fā)現(xiàn)遺傳分化不明顯。趙東緒等[8]通過對浙江省中蜂的形態(tài)特征進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)其變異豐富。曹聯(lián)飛等[9]利用微衛(wèi)星標(biāo)記對浙江省中蜂的遺傳多樣性進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性較低。本研究基于目前應(yīng)用較多的mtDNAtRNAleu～COⅡ序列對麗水地區(qū)中蜂進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在為麗水地區(qū)中蜂資源的保護(hù)和合理開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2015—2016年在麗水市9個區(qū)縣各隨機(jī)選擇3個蜂場，每個蜂場采集5群中華蜜蜂。蜂場的蜂群來源主要為野生收捕，飼養(yǎng)方式主要為無框桶養(yǎng)，以盡可能保證采集的蜂群來自于本地群體。每群隨機(jī)取幾十只工蜂，放入無水乙醇中，置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆??？紤]到有的區(qū)縣采樣蜂場距離較近，按照每個鄉(xiāng)鎮(zhèn)5群左右選取實(shí)驗(yàn)樣本，最終樣本數(shù)量為94群。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取

取無水乙醇浸泡保存的蜜蜂樣本，每群取1只，剪取蜜蜂胸部肌肉，按照細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒DP1201（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）的說明和步驟提取蜜蜂總DNA。

1.2.2mtDNA tRNAleu～COⅡ序列擴(kuò)增與測序

使用引物E2:5'-GGCAGAATAAGTGCATTG-3'和H2:5'-CAATATCATTGATGACC-3'[10]進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（40 μL）：10×緩沖液4 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，10 mmol/L dNTP 4 μL，10 nmol/L引物各1.6 μL，DNA模板3 μL，Taq酶0.5 μL，用ddH2O補(bǔ)至40 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃5 min；94℃1 min，50℃1 min，72℃1 min，35個循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

使用DNAStar 5.0和Clustal X 1.81[11]分別進(jìn)行序列拼接和比對。利用MEGA 6.0[12]輸出堿基組成、變異位點(diǎn)、簡約信息位點(diǎn)以及進(jìn)行聚類分析等。利用DnaSP 5.0[13]進(jìn)行單倍型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列擴(kuò)增結(jié)果

94個中蜂樣本經(jīng)擴(kuò)增后均獲得長度接近500 bp的條帶（圖1），與目的片段大小一致。

2.2 序列堿基組成及變異情況

對94條序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，截除兩端引物序列后，絕大部分序列長度為414 bp，另外6條序列由于缺失1個堿基為413 bp，1條序列由于4個堿基重復(fù)為418 bp。以414 bp序列為標(biāo)準(zhǔn)，1～18 bp為tRNAleu基因部分序列，19～107 bp為非編碼區(qū)序列，108～414 bp為COⅡ部分序列。4個堿基重復(fù)和1個堿基缺失均發(fā)生在非編碼區(qū)。所有序列的A+T含量平均為84.5%。

圖1PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1PCR amplification results

序列分析結(jié)果顯示共有16個變異位點(diǎn)，其中7個在非編碼區(qū)，9個在COⅡ編碼區(qū)。16個變異位點(diǎn)均為堿基轉(zhuǎn)換，其中A/G有9個，T/C有7個。變異位點(diǎn)包括9個簡約信息位點(diǎn)和7個單一多態(tài)位點(diǎn)。根據(jù)序列變異共獲得20個單倍型，分別命名為LS1～20，各個單倍型的序列變異位點(diǎn)如表1所示。

表120 個單倍型的序列變異位點(diǎn)Table 1Variation of nucleotide sites of 20 haplotypes

2.3 群體多樣性分析

麗水中蜂平均核苷酸差異數(shù)k為1.452，平均核苷酸多樣度（Pi）為0.003 52，平均單倍型多樣度（Hd）為0.772±0.036。

20個單倍型在麗水中蜂中的分布情況如表2所示。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)：單倍型LS1出現(xiàn)在39個樣本中，占總樣本數(shù)的41.5%；單倍型LS2出現(xiàn)在9個樣本中，占總樣本數(shù)的9.6%；單倍型LS3出現(xiàn)在15個樣本中，占總樣本數(shù)的16.0%；單倍型LS4和LS5分別出現(xiàn)在5個樣本中，分別占總樣本數(shù)的5.3%；單倍型LS6和LS20分別出現(xiàn)在3個樣本中，分別占總樣本數(shù)的3.2%；單倍型LS10和LS15分別出現(xiàn)在2個樣本中，分別占總樣本數(shù)的2.1%；其余單倍型的樣本數(shù)均為1個。

統(tǒng)計各個區(qū)縣的單倍型分布發(fā)現(xiàn)，縉云、松陽、龍泉、景寧、慶元等地的單倍型類型較多且在樣本中的分布較為均勻。在縉云11個樣本中共發(fā)現(xiàn)5個單倍型，大多分布于2～3個樣本中。在景寧6個樣本中共發(fā)現(xiàn)5個單倍型，分布于1～2個樣本中。

表220 個單倍型在麗水市各個區(qū)縣的分布情況Table 2Distributions of 20 haplotypes for honeybees(Apis cerana cerana)in each district and county of Lishui,Zhejiang,China

2.4 單倍型聚類分析

利用鄰接法（neighbor-joining,NJ）對20個單倍型進(jìn)行聚類分析，得到5個支持率較高的分支（圖2）。其中：單倍型LS2和LS4聚為一支，結(jié)合單倍型在樣本中的分布，主要來源于松陽；單倍型LS5和 LS8聚為一支，主要來源于相鄰的蓮都和青田；單倍型LS10和LS20聚為一支，主要來源于慶元；單倍型LS6和LS15聚為一支，主要來源于縉云和景寧；單倍型LS13和LS17聚為一支，主要來源于相鄰的龍泉和松陽。

圖2 基于鄰接法的各個單倍型聚類分析Fig.2Cluster analysis of haplotypes based on neighbor-joining(NJ) method

2.5 與已有報道序列比對

將發(fā)現(xiàn)的主要單倍型序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已報道的序列進(jìn)行比對。結(jié)果顯示：單倍型LS1序列與姜玉鎖等[4]報道的廣州序列以及周姝婧等[5]報道的福建主體單倍型Acmt01001相同；單倍型LS2序列與周姝婧等[5]報道的福建單倍型Acmt01002相同；單倍型LS3序列與周姝婧等[5]報道的福建單倍型Acmt01018相同；單倍型LS4、LS5、LS6、LS10序列在NCBI中也均有報道；而單倍型LS15和LS20尚未見報道（新申請的NCBI登錄號分別為KY964596和KY964597）。

3 討論

中蜂是我國的本土蜂種，在長期的自然選擇過程中，各地中蜂對當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境產(chǎn)生了極強(qiáng)的適應(yīng)性，形成了許多不同的類型[1]。近年來，國家非常重視中蜂的遺傳資源保護(hù)工作，針對不同類型的中蜂建立了多個保種場和保護(hù)區(qū)。遺傳多樣性分析是進(jìn)行中蜂保護(hù)和利用的基礎(chǔ)，對本地中蜂的選育提高以及新品系培育具有重要的參考意義。本文采用在蜜蜂研究中最為常用的mtDNA tRNAleu～COⅡ序列對麗水地區(qū)中蜂進(jìn)行遺傳多樣性分析，對該地區(qū)中蜂的保護(hù)和利用具有重要意義。

研究結(jié)果顯示，94群麗水中蜂共存在20個單倍型，平均核苷酸多樣度（Pi）為0.003 52，平均單倍型多樣度（Hd）為0.772。周姝婧等[5]利用相同基因序列分析了福建省中蜂的遺傳多樣性，其中與麗水相鄰的福建政和采樣點(diǎn)的樣本量為50個，得到的平均核苷酸多樣度（Pi）為0.001 79，平均單倍型多樣度（Hd）為0.509。說明麗水中蜂的遺傳多樣性高于福建政和。與國內(nèi)其他地區(qū)相比[6-7]，麗水中蜂的平均核苷酸多樣度或平均單倍型多樣度也相對較高，這可能與麗水較好的生態(tài)條件和多樣性的氣候及植被有關(guān)。

單倍型分析發(fā)現(xiàn)，單倍型LS1占總樣本數(shù)的41.5%，為麗水中蜂的主體單倍型。這一單倍型與姜玉鎖等[4]報道的廣州序列以及周姝婧等[5]報道的福建主體單倍型相同，而福建主體單倍型占福建總樣本數(shù)的59.9%。目前，以地理分布和形態(tài)指標(biāo)為主要依據(jù)，中蜂可分為9大類型，其中廣東、福建、浙江（除西部外）均屬于華南中蜂類型。本研究結(jié)果支持麗水中蜂劃為華南中蜂類型。值得注意的是，除了主體單倍型LS1，單倍型LS3占麗水中蜂總樣本數(shù)的比例最大，為16.0%，且在麗水9個區(qū)縣中的7個區(qū)縣均有發(fā)現(xiàn)。雖然這個單倍型在周姝婧等[5]報道的福建中蜂中也有發(fā)現(xiàn)，但是它的出現(xiàn)頻率卻只有0.71%。此外，單倍型LS15和LS20目前尚未見報道，而這2個單倍型在麗水各自采樣地的樣本中也有較高的比例。因此，綜合以上結(jié)果，本研究認(rèn)為麗水中蜂雖然屬于華南中蜂類型，但是也具有自己獨(dú)特的遺傳背景。這可能與麗水中蜂在本地的適應(yīng)性進(jìn)化有關(guān)。

聚類分析結(jié)果顯示，大部分分支內(nèi)的單倍型主要來源于一個區(qū)縣或者相鄰的區(qū)縣，單倍型的劃分與地理分布有較大關(guān)系，說明麗水多山環(huán)境的地理隔離、多樣性的氣候與植被可能促進(jìn)了地區(qū)間中蜂的分化。此外，另一個分支的單倍型卻主要來源于距離較遠(yuǎn)的縉云和景寧，推測可能與近年來交通便利化帶來的遠(yuǎn)距離蜂群引進(jìn)有關(guān)，同時這也可能是縉云中蜂單倍型較多的一個形成因素。龍泉、景寧等地中蜂的單倍型較多則可能與其地理隔離條件較好有關(guān)。

近年來，我國許多地區(qū)對本地中蜂的遺傳多樣性進(jìn)行了相關(guān)研究，為各地中蜂的保護(hù)和利用提供了寶貴數(shù)據(jù)。浙江以山地和丘陵為主，生態(tài)環(huán)境較好，中蜂飼養(yǎng)歷史悠久，近年來浙江麗水等地大力發(fā)展中蜂養(yǎng)殖，全省中蜂數(shù)量增加迅速。尤其值得注意的是，依據(jù)目前中蜂類型的劃分標(biāo)準(zhǔn)，浙江大部分地區(qū)被劃為華南中蜂類型，而浙江西部被劃為華中中蜂類型。然而，目前關(guān)于浙江中蜂遺傳多樣性的相關(guān)研究卻鮮有報道，因此，建議加強(qiáng)相關(guān)研究工作。

4 結(jié)論

浙江省麗水市中華蜜蜂遺傳多樣性較高，屬于我國中蜂9大類型中的華南中蜂類型。由于較好的生態(tài)條件和多樣性的氣候與植被，麗水市中蜂具有獨(dú)特的遺傳背景。麗水市中蜂單倍型的形成可能與多山環(huán)境的地理隔離有較大關(guān)系。因此，麗水市中蜂具有較大的保種和育種價值。

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Genetic diversity of Apis cerana cerana based on mitochondrial DNA in Lishui,Zhejiang,China.

Journal of Zhejiang University(Agric.&Life Sci.),2017,43(4):425-430

CAO Lianfei1*,GU Peipei2,LIN Yuqing2(1.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021,China;2.Animal Husbandry and Veterinary Bureau of Lishui City,Lishui, 323000,Zhejiang,China)

Lishui City;Apis cerana cerana;genetic diversity;mitochondrial DNA

S 893.2;Q 963

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2017.03.281

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（31602014）；浙江省農(nóng)業(yè)（畜禽）新品種選育重大科技專項(xiàng)（2016C02054-11）；浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院-麗水市合作項(xiàng)目（LS20150002）。

*通信作者(Corresponding author)：曹聯(lián)飛(http://orcid.org/0000-0002-3448-8548),E-mail:beekeepingcao@163.com

2017-03-28；接受日期(Accepted)：2017-05-31