油菜素內(nèi)酯對鹽脅迫下香樟幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

王舒甜，王金平，張金池，岳健敏

(南京林業(yè)大學，江蘇省南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省水土保持與生態(tài)修復重點實驗室，南京210037)

油菜素內(nèi)酯對鹽脅迫下香樟幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

王舒甜，王金平，張金池*，岳健敏1

(南京林業(yè)大學，江蘇省南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省水土保持與生態(tài)修復重點實驗室，南京210037)

為揭示油菜素內(nèi)酯（2,4-epibrassinolide,EBR）對香樟耐鹽性的影響，以香樟為試驗材料，在4‰單一鹽脅迫下，采用EBR浸種和浸種+噴葉2種處理方法，分別施加不同質(zhì)量濃度EBR（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L），以蒸餾水處理為對照，比較分析鹽脅迫下香樟幼苗的抗氧化酶活性變化。結(jié)果表明：在4‰鹽脅迫下，植株葉片中丙二醛、可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量及抗氧化酶活性均增加；施用一定質(zhì)量濃度的EBR能提高葉片超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶等保護酶的活性，增加可溶性蛋白質(zhì)及可溶性糖含量，并降低丙二醛含量，且浸種+噴葉處理優(yōu)于單一浸種處理。綜上所述，在鹽脅迫下適宜質(zhì)量濃度的EBR可提高葉片抗氧化能力，清除葉片中的活性氧，保護膜結(jié)構(gòu)，緩解鹽脅迫對香樟的傷害，從而提高香樟的抗鹽性；在0.1～0.5 mg/L EBR質(zhì)量濃度梯度中，以0.4和0.5 mg/L的效果較好，但對于EBR最佳質(zhì)量濃度的確定還有待進一步研究。

香樟幼苗；油菜素內(nèi)酯；鹽脅迫；抗氧化酶活性；活性氧

SummaryCinnamomum camphora,also known as camphor tree,is a kind of excellent tree for afforestation,street and shade,which is of great use to water conservation,making environment green and beauty.Cinnamomum camphora prefers warm and humid climate,and has strong taproot,deep-rootedness and strong sprouting ability,which is of considerable application value in southern coastal areas of China.However,camphor is intolerant to drought,barren and saline soil,and its requirement for soil salinity should be within 0.2%.Camphor grows well in acid yellow soil,but is susceptible to yellow leaf disease in alkaline soil.Moreover,some other elements such as low temperature,weak light and soil secondary salt damage of high concentration would lead to growth failure,fertility inhibition,and even death of camphor.In coastal areas of Jiangsu Province,high soil pH and low organic matter content are not beneficial to the growth and development of camphor,which seriously affect the greening cultivation,introduction and popularization.Therefore,it is of great significance to study the mechanism of salinity tolerance of C.camphora.

In this study,two application methods(soaking seed,soaking seed and spraying leaf)of 2,4-epibrassinolide(EBR) were designed to reveal the effect of EBR on the salt-tolerance of C.camphora.Different concentrations of EBR(0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/L)were used for soaking seeds and spraying leaf under a steadfast salt concentration at 4‰,respectively; meanwhile,distilled water treatment(CK1)and distilled water＋4‰salt treatment(CK2)were used as controls.Then soluble sugar,soluble protein,malondialdehyde(MDA)contents and antioxidant enzyme activities were analyzed to reveal the variation characteristics of C.camphora under the salt stress.

In summary,under the salt stress,a certain concentration of EBR can improve antioxidant status,scavenge reactive oxygen species and membrane stability,and enhance salt resistance of camphor seedlings.Moreover,the method of soaking seed and spraying leaf has better effect than soaking seed.

香樟(Cinnamomum camphora)，又名樟樹，為樟科樟屬常綠闊葉喬木，是常見的優(yōu)良綠化樹、行道樹及庭蔭樹。樟樹多喜溫暖濕潤氣候，主根發(fā)達，深根性，萌芽力強，在南方沿海地區(qū)有一定的應用價值[1]。但香樟不耐干旱、瘠薄和鹽堿土，土壤含鹽量要求在0.2%以內(nèi)，在酸性黃壤土中長勢良好，在堿性土壤中易出現(xiàn)黃化病，低溫、弱光以及高濃度的土壤次生鹽害均會導致香樟植株生長異常，生育受到抑制乃至死亡。沿海地區(qū)土壤pH偏高，有機質(zhì)含量較低，不利于香樟的生長需要，制約了其在南方沿海地區(qū)的引種推廣和綠化栽培。因此，對香樟的耐鹽機制進行研究具有重要意義。目前，關(guān)于樟樹的耐鹽性研究多集中于探討不同鹽濃度對香樟幼苗光合特性和生理特性的影響[2-3]，而對于如何提高樟樹耐鹽性的研究仍較少，僅有研究表明施氮能緩解樟樹鹽脅迫帶來的毒害[4]。

油菜素內(nèi)酯（2,4-epibrassinolide,EBR）是繼生長素、赤霉素、細胞分裂素、乙烯、脫落酸后發(fā)現(xiàn)的第六大植物激素，屬于類固醇類，在植物對生物和非生物的逆境響應中起主要作用[5]。大量研究表明，EBR可以提高作物對干旱[6]、低溫[7]、鹽害[8]、低氧[9]等逆境脅迫的抗性，可有效促進鹽脅迫下植物種子萌發(fā)、幼苗生長，提高葉片光合色素含量和光合能力，增強抗氧化酶活性，降低膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛含量和質(zhì)膜透性[10]，且不同EBR濃度和處理方式對鹽脅迫下植物的調(diào)控效果存在差異[11-12]。但是有關(guān)EBR對鹽脅迫下木本植物的研究卻鮮有報道，且針對EBR不同施用方式對鹽脅迫下樟樹幼苗影響方面的研究尚屬空白。因此，本文研究了在4‰單一鹽脅迫下，外源施用EBR（浸種及浸種+噴葉2種處理方式）對香樟幼苗葉片丙二醛、可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)含量以及抗氧化酶活性的影響，分析了鹽脅迫下香樟幼苗各指標的變化規(guī)律，以明確外源EBR誘導香樟抗鹽性的效果，為進一步探明EBR對鹽脅迫下香樟的代謝調(diào)節(jié)變化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

1.1.1 浸種處理

2014年11月3日在南京林業(yè)大學校園內(nèi)收集香樟種子，消毒后用自來水加少許洗衣粉漂洗，除去雜物與不飽滿的種子，再用H2O2處理30 min，用紗布包住瓶口，自來水流動沖洗24 h后，用濾紙吸干表面水分。將種子分為7份，每份100粒，其中2份用蒸餾水浸泡（CK1、CK2），剩余5份分別浸泡于質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L的EBR溶液中，置于45℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后，取出種子放入15～20℃的濕沙中層積催芽。每隔7 d往CK1處理的濕沙中添加一定量的蒸餾水，剩余處理添加一定量的4‰NaCl以保證其相對濕度及鹽度，約50 d后，待種子露白，將其播種于育苗袋中。

2015年5月2日，當苗高超過50 cm時，分別從各處理中取大小、長勢一致的苗木12株，定植于25 cm×25 cm的花盆中，苗木的培養(yǎng)基質(zhì)為V（沙）∶V（蛭石）=1∶1，約3.5 kg。在苗木生長期間（5—8月）保證水分供應，每隔25 d澆一次Hoagland營養(yǎng)液，每次澆0.5 L。

第二條標準，即無自變量標準的實質(zhì)就是上文中弗雷格自己給出的說明：“表達不帶有空位”?！安粠в锌瘴弧币庵竿暾钔暾谋磉_應該是句子，因此弗雷格后來也將句子看作專名，將句子的意謂“真值”看作對象。如果普通專名也是完整的，那么就只能在一種相對獨立的意義上是完整的，畢竟弗雷格說過：“實際上只有在完整的句子中詞才有意義(意謂)”。[注][德]弗雷格：《算術(shù)基礎》，王路譯，王炳文校，北京：商務印書館，1998年，第77頁。這一“相對獨立”所相對者無疑是概念詞。在弗雷格看來，概念詞就是在一個完整的句子中去掉專名之后所剩下來的部分。

1.1.2 噴葉處理

2015年8月1日向種子期間經(jīng)不同質(zhì)量濃度EBR浸泡的5組幼苗葉片表面和背面噴施質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L的EBR溶液，CK1、CK2噴施蒸餾水，間隔期為7 d，共噴3次。9月1日除CK1處理外，其余6組進行鹽處理，試驗開始時持續(xù)1周不澆水，且為了保證4‰的鹽分脅迫，一次性分別對6組處理加入100 mL 14%的鹽溶液，以后每周澆1次水。為防止鹽分流失，處理時在花盆下放置托盤，滲出的溶液再倒回盤中。2015年10月初對各指標進行測定。

1.2 測定方法

丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量和可溶性糖含量的測定采用硫代巴比妥酸法：用紫外分光光度計分別測定在450、532、600 nm波長下的吸光度，根據(jù)吸光度計算其濃度[13]?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量及抗氧化酶活性的測定采用李合生[14]的方法。其中：可溶性蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍比色法；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性測定采用氮藍四唑光還原法；過氧化物酶（peroxidase, POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法；過氧化氫酶（catalase,CAT）活性測定采用紫外吸收法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013對數(shù)據(jù)進行處理及統(tǒng)計分析，用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件中的鄧肯新復極差法對平均數(shù)進行多重比較，用Origin 8.5進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1EBR對鹽脅迫下香樟幼苗可溶性蛋白質(zhì)的影響

由圖1可知：CK2的可溶性蛋白質(zhì)含量高于CK1處理，增長了5.46%；而0.5 mg/L EBR浸種處理的可溶性蛋白質(zhì)含量與CK2相比增長了31.80%，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；外施0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L EBR（浸種+噴葉處理）均顯著提高了香樟葉片的可溶性蛋白質(zhì)含量，分別比CK2增加46.78%、60.07%、65.18%、60.16%，且在0.1～0.5 mg/L EBR質(zhì)量濃度梯度中，外施0.4 mg/L EBR的效果最佳。說明在鹽脅迫下采用外施EBR（浸種+噴葉處理）對提高香樟可溶性蛋白質(zhì)含量的效果較好。

2.2EBR對鹽脅迫下香樟幼苗可溶性糖含量的影響

由圖1可知：CK2的可溶性糖含量高于CK1，提高了18.60%；與CK2相比，EBR質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的浸種+噴葉處理可顯著提高可溶性糖含量，增加了24.80%，而其他EBR質(zhì)量濃度處理間差異無統(tǒng)計學意義；EBR浸種處理均能提高可溶性糖含量，其中以0.5 mg/L EBR處理的效果最佳，增加了22.03%。表明在4‰鹽脅迫下，外施不同質(zhì)量濃度的EBR均能不同程度地提高香樟可溶性糖含量，且浸種+噴葉處理優(yōu)于單一浸種處理。

2.3EBR對鹽脅迫下香樟幼苗丙二醛含量的影響

細胞內(nèi)丙二醛（MDA）含量的高低反映了植物遭受逆境脅迫傷害的強弱程度。由圖2可知：在4‰鹽脅迫下，CK2處理的香樟幼苗葉片中MDA含量高于CK1，增加了27.10%；在浸種處理下，外源施用不同質(zhì)量濃度的EBR均能不同程度地降低葉片的MDA含量，但差異無統(tǒng)計學意義；在浸種+噴葉處理下，與CK2相比，外施0.1、0.2、0.3 mg/L的EBR能降低MDA含量，但差異未達顯著水平；而外施0.4、0.5 mg/L的EBR，MDA含量分別降低了27.67%、23.66%，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。說明外施不同質(zhì)量濃度的EBR能降低MDA含量，且浸種+噴葉處理的效果優(yōu)于單一浸種處理；在0.1～0.5 mg/L質(zhì)量濃度梯度中，EBR為0.4 mg/L時的處理效果最佳。

圖1 在4‰鹽脅迫下不同質(zhì)量濃度EBR對香樟幼苗葉片可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量的影響Fig.1Effect of different concentrations of 2,4-epibrassionolide(EBR)on soluble protein and soluble sugar contents under 4‰NaCl stress

圖2 在4‰鹽脅迫下不同質(zhì)量濃度EBR對香樟幼苗葉片MDA含量及抗氧化酶活性的影響Fig.2Effect of different concentrations of EBR on MDA content and antioxidant enzyme activities under 4‰NaCl stress

2.4EBR對鹽脅迫下香樟幼苗抗氧化酶系統(tǒng)的影響

從圖2可見：與CK1相比，在CK2處理下香樟葉片的SOD、POD及CAT酶活性分別提高了21.48%、13.30%和8.65%，但差異無統(tǒng)計學意義，說明香樟幼苗對于低濃度鹽脅迫具有一定的耐受性；采用浸種、浸種+噴葉2種處理方法外施不同質(zhì)量濃度的EBR均能不同程度地提高葉片中的SOD活性，其中以0.5 mg/LEBR處理的效果最佳，分別顯著提高了49.49%和55.11%（P＜0.05）；與CK2處理相比，不同質(zhì)量濃度的EBR處理均能提高香樟葉片中的CAT活性，其中以0.4 mg/L EBR的浸種+噴葉處理效果最佳，CAT活性提高了35.33%；在相同處理條件下，POD活性變化規(guī)律與SOD相似，即隨著EBR質(zhì)量濃度的逐漸升高，酶活性呈波動上升的趨勢。綜上所述，3種保護酶的活性在各處理條件下的變化趨勢基本相同，它們通過協(xié)同互作共同緩解了NaCl脅迫造成的活性氧傷害，其中SOD變化幅度較大，POD次之，CAT最小，說明在抗氧化酶系統(tǒng)中SOD的作用相對較大。

3 討論與結(jié)論

在逆境條件下，植物細胞內(nèi)的活性氧會不斷積累，產(chǎn)生膜脂過氧化作用，造成植物體內(nèi)自由基代謝平衡失調(diào)，丙二醛積累，進而損害細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性[15-16]。油菜素內(nèi)酯作為一種外源激素，生理活性較強，通過合理使用可提高植物的滲透調(diào)節(jié)能力和抗氧化能力，維持植株水分平衡，緩解鹽脅迫的傷害，促進植株生長[17]。

丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，其含量的高低在一定程度上反映了膜脂過氧化作用程度和對逆境反應的強弱[18]。在本研究中4‰鹽脅迫使MDA含量上升，表明此時香樟幼苗葉片中活性氧的產(chǎn)生已超出了細胞的清除能力，導致活性氧大量積累，引起膜脂過氧化，嚴重破壞了膜系統(tǒng)。康云艷等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在低氧條件下，EBR處理可以降低黃瓜的MDA含量，緩解低氧脅迫對植株的傷害。陳善娜等[20]和?ZDEMIR等[21]的研究也表明，EBR處理可明顯降低鹽脅迫下水稻植株的MDA含量。本試驗發(fā)現(xiàn)在4‰鹽脅迫下，采用浸種+噴葉方式外施質(zhì)量濃度為0.4 mg/L的EBR可顯著降低MDA含量，與前人研究結(jié)果一致。說明外源EBR能在一定程度上抑制膜脂過氧化，維持細胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而保證植物體正常代謝和生長，且浸種+噴葉處理效果較好。

可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物適應逆境脅迫中發(fā)揮重要生理作用。在脅迫條件下，可溶性糖還可作為合成有機物質(zhì)的碳架，為物質(zhì)代謝提供能量。本試驗在鹽脅迫條件下，不同質(zhì)量濃度的外源EBR處理能不同程度地提高香樟幼苗葉片中可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量，這與前人的研究結(jié)論[22-23]一致。表明外源施用EBR可以通過促進體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)的合成，來提高細胞滲透勢，增強鹽脅迫下幼苗的吸水能力，維持細胞正常代謝，從而緩解鹽脅迫對香樟幼苗的傷害。本研究發(fā)現(xiàn)外施質(zhì)量濃度為0.4 mg/L的EBR能顯著提高葉片可溶性蛋白質(zhì)含量，且以浸種+噴葉處理效果較好。

超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶是植物膜脂過氧化酶促防御系統(tǒng)的幾個重要保護酶，它們通過相互協(xié)調(diào)、共同協(xié)作能有效清除活性氧（reactive oxygen species,ROS），是反映植物抗逆性的重要指標[24-26]。在鹽脅迫下有關(guān)植物體內(nèi)酶活性變化已有較多報道，但其變化規(guī)律不一致[8]。本試驗結(jié)果表明，在鹽脅迫下香樟幼苗葉片中的SOD、POD、CAT活性較CK1增加，說明當植株發(fā)生逆境脅迫時，葉片氧化脅迫程度加大，葉片可通過自身的調(diào)節(jié)機制提高酶活性以應對逆境脅迫[27]。外源施加EBR可進一步提高SOD、POD、CAT等保護酶的活性，這對于鹽脅迫下香樟幼苗體內(nèi)ROS的淬滅，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，維持活性氧代謝平衡，緩解鹽脅迫傷害均有一定的益處。在0.1～0.5 mg/L EBR質(zhì)量濃度梯度中，以0.4、0.5 mg/L的效果較為顯著。這可能是由于植株的抗性與其體內(nèi)的EBR水平相關(guān)，即在正常生長條件下EBR能在一定程度上提高植株的抗性，當植物遭遇逆境時，EBR的合成和累積將進一步提高抗逆性。這與李杰等[28]在低溫脅迫下對辣椒的研究結(jié)果一致。

從外源EBR的2種施用方法對提高香樟葉片抗氧化酶活性的幅度來看，總體表現(xiàn)為經(jīng)外源EBR浸種處理的效果優(yōu)于未經(jīng)外源EBR浸種處理（CK1），說明種子期間經(jīng)EBR浸種能在一定程度上提高葉片抗氧化酶系統(tǒng)活性以清除ROS。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)，外源EBR浸種+噴葉協(xié)同處理對提高鹽脅迫下香樟的抗氧化酶活性具有顯著的協(xié)同增效作用，推測植物在不同時期、不同部位對外源EBR的利用能力不同，且在種子和幼苗期同時處理更能有效地利用EBR以提高鹽脅迫抗性[29]。此外，當外施EBR質(zhì)量濃度為0.4、0.5 mg/L時，葉片SOD活性增幅最大，POD次之，CAT最小，表明SOD、POD對4‰鹽脅迫反應更敏感。因此，EBR對鹽脅迫下香樟幼苗葉片中3種保護酶的誘導效果不同，這可能是由于EBR對SOD、POD以及CAT這3種保護酶活性的調(diào)節(jié)機制不同，但其具體調(diào)節(jié)機制還需進一步論證。

綜上所述，外源EBR浸種、浸種+噴葉這2種處理均能降低香樟幼苗葉片的MDA含量，誘導植株葉片中可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖含量及抗氧化酶活性增加，從而提高植物耐鹽性。就處理方式而言，浸種+噴葉協(xié)同處理的效果優(yōu)于單一浸種處理，且以0.4、0.5 mg/L EBR的處理效果較好，但是對于其最佳質(zhì)量濃度的確定還有待進一步擴大濃度序列步階進行研究。雖然一定質(zhì)量濃度的EBR可緩解鹽脅迫對香樟幼苗葉片的傷害，但其保護作用可能不完全；同時，有關(guān)EBR浸種+噴葉處理協(xié)同誘導植物抗鹽性的動態(tài)變化規(guī)律和生理機制仍有待進一步探討。

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Effects of exogenous 2,4-epibrassinolide on antioxidant enzyme activities of camphor seedlings under salt stress.

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WANG Shutian，WANG Jinping，ZHANG Jinchi*，YUE Jianmin（Key Laboratory of Soil and Water Conservation and Ecological Restoration in Jiangsu Province/Collaborative Innovation Center of Sustainable Forestry in Southern China of Jiangsu Province,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China)

camphor seedling;2,4-epibrassinolide;salt stress;antioxidant enzyme activity;reactive oxygen species

S 718.3

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2016.09.101

江蘇省高校優(yōu)勢學科建設工程項目（PAPD）；江蘇省林業(yè)三新工程項目（LYSX〔2014〕05）。

張金池（http://orcid.org/0000-0001-5257-7491），E-mail:zhang8811@njfu.edu.cn

（First author）：王舒甜（http://orcid.org/0000-0003-4753-2314），E-mail:1980483666@qq.com

2016-09-10；接受日期(Accepted)：2017-02-15