豬睪丸組織定量PCR分析中內參基因的選擇

彭馥芝，冉茂良，翁波，李智，董蓮花，陳斌

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豬睪丸組織定量PCR分析中內參基因的選擇

彭馥芝，冉茂良，翁波，李智，董蓮花，陳斌

（湖南農業(yè)大學動物科學技術學院/畜禽遺傳改良湖南省重點實驗室，長沙 410128）

【目的】采用實時熒光定量PCR技術（qRT-PCR）對基因表達進行分析時，選擇適當的內參基因是獲得準確分析結果的關鍵。在豬睪丸分子生物學研究中，表達穩(wěn)定的蛋白編碼內參基因和microRNA（miRNA）內參基因均有哪些目前尚不清楚。本研究旨在篩選出合適的內參基因，為準確定量不同時期豬睪丸組織中目的基因的表達提供可靠依據?！痉椒ā窟x用8個不同發(fā)育時期（E 90、D 1、D 30、D 60、D 90、D 120、D 150、DM）的豬睪丸組織為材料，采用Trizol裂解法提取各樣品的總RNA，利用NanDrop ND-2000分光光度計檢測總RNA的濃度和純度。設計并合成已報道的豬其他組織中表達相對穩(wěn)定的5個編碼內參基因（、、、和）以及5個miRNA內參基因（U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR-103）的特異性引物序列，逆轉錄得到cDNA模板后，按1:10梯度稀釋為7個濃度梯度進行qRT-PCR反應以構建標準曲線。并對10個候選內參基因在各時期睪丸組織中的表達情況進行實時熒光定量全面檢測，采用GeNorm法對定量結果進行綜合分析，最后根據內參基因穩(wěn)定性值（M值）的大小篩選出最穩(wěn)定的參考基因；M值越小，表明內參基因的穩(wěn)定性越好，反之則越差。【結果】對、、、、、U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR-103 10個候選內參基因的熔解曲線進行分析發(fā)現(xiàn)，均無非特異擴增及引物二聚體，說明各內參基因特異性良好，qRT-PCR反應的專一性高；以Ct值為縱坐標，相對拷貝數的對數為橫坐標進行標準曲線分析可知，各內參基因在系列稀釋的濃度梯度內具有良好的線性關系；通過對10個候選內參基因在不同時期豬睪丸組織中的表達穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，蛋白編碼基因中，最穩(wěn)定的為，最不穩(wěn)定的是；miRNA候選內參中，最穩(wěn)定的為U6，最不穩(wěn)定的是ssc-miR-26a。【結論】成功篩選出豬睪丸組織基因表達分析中穩(wěn)定表達的內參基因和U6，可作為豬睪丸組織基因表達研究中最佳內參基因候選者。

豬睪丸組織；內參基因；qRT-PCR；miRNA

0 引言

【研究意義】實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR）是一種通過始點定量和熒光檢測系統(tǒng)實時監(jiān)測累積熒光強度進行定量基因檢測的靈敏度高、特異性強、線性關系好、操作簡單的定量PCR技術，已成為分子生物學研究領域中分析基因表達的重要工具[1]。內參基因是一種維持細胞最低限度功能不可缺少的基因，理想的內參基因在不同類型細胞和組織中的表達應無顯著差異，且不受試驗和臨床條件的影響。但由于內參基因的表達具有物種及組織特異性，所以其表達的穩(wěn)定性是相對的。而在使用qRT-PCR 技術檢測目的基因表達水平時，為減少檢測樣本在RNA產量、質量和反轉錄效率上可能存在的差異，通常需要引入一個表達較為穩(wěn)定的管家基因作為內參基因進行校正和標準化[2-3]?！厩叭搜芯窟M展】目前，各個研究領域關于內參基因的報道很多，例如，在家蠶不同組織中、的表達相對較穩(wěn)定[4]；陳瑞等[3]以3個階段的新西蘭白兔的3種不同組織作為研究對象，證實新西蘭白兔不同的發(fā)育時期和組織中，最穩(wěn)定的內參基因不同；而、和為山羊不同組織和不同時期中最合適的內參基因[5]，為波爾山羊10個不同組織中表達水平最穩(wěn)定的內參基因[6]，校正綿羊不同組織qRT-PCR結果時，也需要選擇各組織中最適用的內參基因[7]；LISOWSKI 等[8]在牛的不同組織中篩選內參基因的結果也表明，不同組織中各內參基因的表達穩(wěn)定性也有所不同。這些結果對不同試驗材料及其在不同時期基因表達研究中內參基因的選擇提供了有效參考。而作為生物基因調控網絡中重要成員的miRNAs，盡管現(xiàn)在對其的研究取得了很大進展[9-10], 但是對于均一化miRNA表達的內參基因的系統(tǒng)研究還比較匱乏，主要在人類疾病方面的研究比較多。SCHAEFER等[11]對前列腺癌組織樣本進行了相關試驗，建議在前列腺癌組織中使用miR-103b作為內參基因。WOTSCHOFSKY等[12]的研究結果指出，作為透明細胞腎癌研究的miRNA內參基因應用一種miRNA內參來進行標準化，那么miRNA-28是最佳選擇。人類各種組織miRNA內參基因的選擇結果顯示，miR-191是多種正常組織中最穩(wěn)定的miRNA，而在腫瘤組織中表達最穩(wěn)定的是miR-103[13]?！颈狙芯壳腥朦c】雄性睪丸是調控雄性生殖發(fā)育和精子成熟的重要器官，探索睪丸組織內各基因的表達水平對促進雄性生育及預防生殖方面的疾病具有重要的意義。目前，內參基因的篩選在仔豬心、肝臟、脾臟等不同組織[14]、梅山-大白豬肌肉組織[15]、豬血管內皮細胞[16]、豬骨骼肌組[17]等豬的相關組織中已有報道，但對其在豬睪丸組織中表達的內參基因的篩選還未見系統(tǒng)研究。因此，本研究以不同發(fā)育階段豬睪丸組織樣品為材料，綜合比較豬其他組織中各內參基因穩(wěn)定性后，選擇、、、和五個蛋白編碼基因以及U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR-103等5個miRNA為候選內參基因，采用qRT-PCR技術，結合GeNorm分析軟件[18]，對10個候選基因在不同時期豬睪丸組織中的表達穩(wěn)定性進行評價?！緮M解決的關鍵問題】獲得適用于豬睪丸組織基因表達研究的最佳內參基因，以期為后續(xù)相關研究中內參基因的選擇提供依據。

1 材料與方法

試驗于2016年4—6月在湖南農業(yè)大學動物科學技術學院畜禽遺傳改良湖南省重點實驗室進行。

1.1 材料

試驗所用的沙子嶺豬睪丸組織樣品采于湖南省湘潭市沙子嶺豬保種場，通過屠宰的方法采集豬胚胎期睪丸組織樣品，采用閹割的方法采集出生后公豬的睪丸組織樣品。采集90胚齡（E 90）、1日齡（D 1）、30日齡（D 30）、60日齡（D 60）、90日齡（D 90）、120日齡（D 120）、150日齡（D 150）及180日齡（DM）8個發(fā)育階段的正常健康公豬睪丸組織，剪成小塊，放入RNase-free的EP管中，立即置于液氮中速凍，帶回實驗室，于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。每個階段采集3頭公豬睪丸組織樣品，共計24個樣品。

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

采用Trizol裂解法提取各樣品的總RNA，利用NanDrop ND-2000分光光度計檢測總RNA的濃度和純度。OD260/280和OD260/230的值用來確定所有RNA樣品的純度。只有OD260/280比值介于1.8—2.0之間，OD260/230在2.0以上的RNA樣品才能用于后續(xù)研究。按照RR047A型PrimeScript? RT Reagent Kit反轉錄試劑盒（TaKaRa，日本）說明書反轉錄合成cDNA，于-80℃超低溫冰箱內保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設計及標準曲線的構建

本研究選取、、、和等5個蛋白編碼基因以及U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR-103等5個miRNA內參基因作為候選基因。利用miRBase數據庫搜索5個miRNA內參基因的成熟序列，查閱文獻資料確定5個蛋白編碼基因的序列，設計10個候選基因的特異性引物序列（表1），并由生工生物工程有限公司（上海，中國）合成。將cDNA模板按1﹕10梯度稀釋為7個濃度梯度后進行qRT-PCR反應以構建標準曲線。

表1 候選基因的引物序列

1.4 實時熒光定量PCR

qRT-PCR反應體系為25 μL：熒光染料SYBR?Premix Ex TaqⅡ12.5 μL，dH2O（滅菌蒸餾水）8.5 μL，PCR Forward Primer 1.0 μL（10 μmol·L-1）、PCR Reverse Primer（10 μmol·L-1）1.0 μL，cDNA模板2.0 μL。反應在CFX Connect（Bio Rad，美國）實時熒光定量PCR儀中進行。實時熒光定量PCR反應條件為：95℃預變性30 s；95℃5 s，60℃30 s擴增，40個循環(huán)；55℃—95℃熔解30 s，監(jiān)測熔解曲線的過程中，每0.5℃進行1次熒光監(jiān)測。每個階段睪丸組織均有3個生物學重復，每個樣品進行3次qRT-PCR，同時設置陰性對照和空白對照。

1.5 表達數據分析

GeNorm程序的原理是根據基因相對表達水平的幾何平均值計算候選內參基因的穩(wěn)定性值（M值），根據M值的大小篩選出最穩(wěn)定的參考基因，M值越小，表明內參基因的穩(wěn)定性越好，反之則越差[19]。數據讀取由CFX Connect（Bio Rad，美國）實時熒光定量PCR儀自動完成，通過CFX Manager軟件中的GeNorm程序獲得內參基因在各時期表達穩(wěn)定度的平均M值，從而篩選出最穩(wěn)定的內參基因。

2 結果

2.1 內參基因引物的特異性

對、、、、、U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR- 103等10個候選內參基因的熔解曲線進行分析發(fā)現(xiàn)，均無非特異擴增及引物二聚體，說明各內參基因特異性良好，qRT-PCR反應的專一性高, 結果準確可靠，滿足試驗要求（圖1，2）。

2.2 標準曲線的構建

以Ct值為縱坐標，相對拷貝數的對數為橫坐標進行標準曲線分析，由表2可知，各內參基因在系列稀釋的濃度梯度內具有良好的線性關系，滿足qRT-PCR的擴增條件。

2.3 內參基因在不同時期表達的穩(wěn)定性

通過對10個內參基因在不同時期豬睪丸組織中的表達穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，蛋白編碼基因中，最穩(wěn)定的為，最不穩(wěn)定的是（圖3）；miRNA中，最穩(wěn)定的為U6，最不穩(wěn)定的是ssc-miR-26a（圖4）。

(A) β-actin; (B) TBP; (C) SDHA; (D) GAPDH; (E) B2M

(A) ssc-miR-27a; (B) ssc-miR-17-5p; (C) U6; (D) ssc-miR-26a; (E) ssc-miR-103

圖2 豬睪丸組織中5個候選miRNA內參基因Real-time PCR熔解曲線

Fig. 2 Real-time PCR melting curves of 5 candidate miRNA reference genes of porcine testis tissues

表2 豬睪丸組織10個候選內參基因的qRT-PCR 標準曲線

圖3 豬睪丸組織中內參基因的平均表達穩(wěn)定度

圖4 豬睪丸組織中miRNA內參基因的平均表達穩(wěn)定度

3 討論

內參基因也叫看家基因，指在檢測基因表達水平的試驗中，通常用來作為參照物，對試驗誤差進行校正的基因。理想的內參基因要求在各種試驗條件及各組織、細胞和發(fā)育時期中的表達均相對恒定[20]。采用穩(wěn)定的內參基因能對定量試驗中qRT-PCR的數據進行標準化，但尚未發(fā)現(xiàn)任何一個內參基因能在所有試驗條件下均穩(wěn)定表達，而是在不同的組織或同一組織的不同發(fā)育時期均存在差異表達[21-23]。因此在對特定基因表達研究中，篩選出最穩(wěn)定的基因作為內參基因對數據進行校正，才能保證結果的準確性[24]。本試驗首次對豬睪丸組織基因表達分析中適宜的內參基因進行研究。結果表明，豬睪丸組織8個發(fā)育時期的10個候選基因中蛋白編碼基因和miRNA表達最穩(wěn)定的內參基因分別是和U6，穩(wěn)定性最差的分別是和ssc-miR-26a。

是轉錄起始復合物TFIID 的核心組分，與相關啟動子結合后，能識別并特異性結合TATA元件，進而指導RNA 聚合酶和其他轉錄因子有序裝配，形成穩(wěn)定的轉錄起始復合物，并直接影響基因的轉錄水平[25-26]。本研究結果揭示在豬睪丸組織中的表達穩(wěn)定性與之前在豬各組織中的研究結果一致。例如，ERKENS等[27]研究發(fā)現(xiàn)和可作為最合適、表達最穩(wěn)定的內參基因用于豬的背脂和背肌的基因表達研究。在NYGARD等的研究中，分析了9個內參基因在豬的不同組織中的表達穩(wěn)定性，結果發(fā)現(xiàn)、、和這4個基因的表達最穩(wěn)定，而表達最不穩(wěn)定[28]。對豬外周血基因表達分析中適宜的內參基因進行研究，結果表明，6個候選內參基因在全血中穩(wěn)定表達順序中穩(wěn)定性最好的內參基因的是和，最差的是[29]。

U6是剪接體的組成元件之一，參與mRNA前體的加工過程[30]。U6在真核生物各種組織和細胞中廣泛表達，而且表達水平恒定，因此，常被選作內參基因用于miRNA的定量表達分析[31-32]。本研究結果也表明，在豬睪丸組織miRNA表達水平的研究中，U6為最穩(wěn)定的內參基因。但U6作為理想內參基因其穩(wěn)定性也一直受到質疑。例如，在豬肝臟、脾臟、胰臟、心臟、胃、肺、小腸、大腦、小腦和腿肌的正常組織中篩選出miR-103實時定量PCR檢測分析的合適內參時，采用GeNorm 算法和擴增效率試驗對miR-196、U6和總RNA[33]（以總RNA為標準歸一化各候選基因的表達水平）3個候選內參進行了評價，結果表明，miR-196的表達穩(wěn)定性和擴增效率均優(yōu)于U6；以miR-196為內參的miR-103 相對定量結果具有更高的準確性[34]。李春枚[35]選擇13個在豬的miRNA定量中常被用作內參的基因（5S，Met-rRNA，ssc-miR-16，ssc-miR-17，ssc-miR-23a，ssc-miR-24，ssc-miR-27a，ssc-miR-103，ssc-miR-106a，ssc-miR-107，ssc-miR-186，ssc-miR-221和U6），通過EvaGreenq-PCR法分別比較其在47個不同組織，10個脂肪組織和4個肌肉組織中的表達差異，然后利用GeNorm軟件評估這些基因在3個不同樣本分類中的表達穩(wěn)定性。結果顯示，通過內參基因的表達穩(wěn)定性分析，在全部47個組織中，有7個內參基因的表達顯示出可靠的穩(wěn)定性，其中ssc-miR-17和ssc-miR-103是最穩(wěn)定的兩個內參基因。而在3個不同樣本分類中，U6的表達都是最不穩(wěn)定的。由此可見，不同組織中最適用的內參基因并不完全一致，因此有必要針對豬不同組織進行內參基因的優(yōu)選。

4 結論

本研究成功篩選了豬睪丸組織基因表達分析中穩(wěn)定表達的內參基因（和U6），為準確定量不同時期豬睪丸組織目的基因的表達提供了可靠的依據。但是本試驗結果并不是絕對的，在其他試驗條件下，還需要通過系統(tǒng)的試驗分析重新確定合適的編碼基因或miRNA作為內參基因，盲目地選擇內參基因可能會導致試驗結果與預期結果出現(xiàn)偏差，甚至得到錯誤的結論。

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（責任編輯 林鑒非）

Validation of Reference Genes for Quantitative RT-PCR Analysis in Porcine Testis Tissues

PENG FuZhi, RAN MaoLiang, WENG Bo, LI Zhi, DONG LianHua, CHEN Bin

（College of Animal Science & Technology, Hunan Agricultural University / Hunan Provincial Key Laboratory for Genetic Improvement of Domestic Animal, Changsha 410128）

【Objective】Reference gene is the key to obtain the accurate analysis results when apply quantitative RT-PCR (qRT-PCR) technique to identify the gene expression level. However, reference gene and microRNA (miRNA) which are used in researching the molecular biology of porcine testis are not well characterized. Screening suitable reference gene will provide a reliable evidence for the quantitative analysis of target gene in different periods of porcine testis tissues.【Method】Porcine testis tissues at 8 different developmental stages (E 90, D 1, D 30, D 60, D 90, D 120, D 150, and DM) were selected as materials in this study. Trizol method was used to extract the total RNA and the concentration and purity of total RNA were detected by ND-2000 NanDrop spectrophotometer. The primers of 5 commonly used protein coding reference genes (,,,and) and 5 miRNA reference genes (U6, ssc-miR-17-5p, ssc-miR-26a, ssc-miR-27a and ssc-miR-103) were designed and synthesized to reverse transcription. cDNA templates were diluted to 7 concentration gradients with 1:10 serial dilution to construct standard curves. The expression of 10 candidate reference genes in porcine testis tissues was systematically analyzed at specified times, then the Genorm 3.5 was used to analyze the results. The most stable reference genes were picked up according to the stability value which called M value, the smaller the value of M, the better the stability of the reference gene; otherwise, the stability would be worse.【Result】The melting curves of 10 candidate reference genes (U6, ssc-miR-17-5p, ssc-miR-26a, ssc-miR-27a, and ssc-miR-103) indicated that the expression of all the candidate reference genes was of some specificity, no primer-dimers and nonspecific amplification. The relationship between Ct value and the logarithm of relative copy number was coincidence with linear relation according to the standard curves which were made with Ct value as ordinate and the logarithm of relative copy number as abscissas in a series of diluted concentration gradients. Analysis showed that the most stable reference gene of protein encoding gene wasand the most unstable was. U6 was the most suitable gene for miRNA expression analysis and ssc-miR-26a was the most unsuitable. 【Conclusion】This study has screened the most suitable reference genes (and U6) to identify porcine testis gene expression level successfully. The highly ranked reference genes identified from this study can provide a theoretical basis for the selection of the most suitable reference gene to detect differences in expression rates of genes and miRNAs in porcine testis tissues.

porcine testis tissue; reference genes; qRT-PCR; miRNA

2016-07-01；接受日期：2017-06-15

國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金（CARS-36）

彭馥芝，Tel：13117516124；E-mail：pengfuzhi0809@126.com。通信作者陳斌，E-mail：chenbin7586@126.com