利用2b-RAD測序結合HRM分析技術開發(fā)與梨矮生性狀相關的DNA分子標記

肖玉雄，王彩虹，田義軻，楊紹蘭，李鼎立，張海月

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利用2b-RAD測序結合HRM分析技術開發(fā)與梨矮生性狀相關的DNA分子標記

肖玉雄，王彩虹，田義軻，楊紹蘭，李鼎立，張海月

（青島農業(yè)大學園藝學院/青島市園藝植物遺傳改良與育種重點實驗室，山東青島 266109）

【目的】果樹的矮生性狀是一種重要的農藝性狀，對果樹的集約化栽培具有重要意義。來自西洋梨實生變異品種‘Le Nain Vert’的矮生性狀受控于一個單顯性基因，目前關于該基因的序列信息等還不清楚。本研究的目的是開發(fā)與其緊密連鎖的DNA分子標記，為鑒定該基因提供依據(jù)。【方法】根據(jù)分離群體分組分析的原理，以‘矮生梨’ב茌梨’和‘2-3’ב綠寶石’2個F1雜交分離群體為試材，應用IIB型限制性內切酶的RAD技術（Restriction association site DNA，2b-RAD）對2對矮生型/普通型對比基因池進行基因組測序分析，在對比基因池間篩選出單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）位點，從中篩查出位于定位染色體上的SNPs，用高分辨率熔解曲線分析技術（High-resolution melting analysis，HRM）在群體上進一步檢測驗證，以確定其與位點的連鎖關系?！窘Y果】對4個樣本（即4個對比基因池）的2b-RAD標簽測序文庫的測序結果共產生67 186 260條reads，平均每個樣本測序reads數(shù)為16 796 565。將原始reads進行質量過濾后的統(tǒng)計結果表明，每個樣本獲得平均unique標簽數(shù)目為86 810，平均測序深度為77×，該測序深度能夠達到準確分型的標準。SOAP軟件定位結果表明，4個測序文庫中含有酶切位點的高質量reads占測序原始reads的70%以上，表明測序質量較好。在來自2個不同群體的矮生型基因池與普通型基因池間進行對比分析，初步篩選出SNP位點1 317個，其中有8個位于的定位染色體scaffold00074上。用HRM技術對這8個SNP標記在群體上的進一步檢測結果表明，在‘矮生梨’ב茌梨’群體上有2個SNP標記、在‘2-3’ב綠寶石’群體上有4個SNP標記表現(xiàn)出與位點共分離的特性，根據(jù)其擴增子的熔解曲線形狀差異，可有效區(qū)分矮生型和普通型表型。在來自‘矮生梨’ב茌梨’群體的215個雜種后代和來自‘2-3’ב綠寶石’群體的168個雜種后代中，未發(fā)現(xiàn)有標記與性狀的重組類型?！窘Y論】2b-RAD測序技術與HRM分析技術相結合，進行果樹重要農藝性狀分子標記的開發(fā)，是一種行之有效的方法。基于這一策略，本研究鑒定獲得了4個與西洋梨矮生性狀單顯性基因連鎖的SNP標記。

梨；矮生性狀；；SNP標記；2b-RAD；HRM

0 引言

【研究意義】果樹的矮化密植栽培因具有早果、高產、品質優(yōu)良、易于管理、能夠有效節(jié)約成本和增加利潤等優(yōu)點，已發(fā)展成為國內外極為重要的栽培模式。目前，實現(xiàn)矮密栽培的主要途徑是利用矮化砧木和矮生品種，因此，發(fā)掘和利用優(yōu)良的基因資源，進行矮化砧木和矮生品種的培育對果樹生產具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】西洋梨矮生型實生變異品種‘Le Nain Vert’具有樹體緊湊、矮小的特點，非常適合矮密栽培。研究發(fā)現(xiàn)，矮生梨在莖、葉的解剖結構上有區(qū)別于普通型梨的顯著特征[1]。由于‘Le Nain Vert’的矮生性狀受控于顯性單基因[2]，因此，該基因資源在梨矮生品種的培育方面具有重要應用價值。Wang等[3]將該基因命名為，并通過SSR標記將其定位于西洋梨基因組第16連鎖群上。最近，李煒等[4]依據(jù)蘋果與梨基因組間高度的保守性和共線性關系，以二者的參考基因組序列為基礎，又篩選鑒定了一組與連鎖的DNA分子標記，將該基因定位到了西洋梨的染色體片段scaffold00074上。利用簡化基因組測序技術進行大規(guī)模高通量SNP分型是當前國際上動植物基因組學研究熱點之一。美國Oregon大學發(fā)明的RAD(Restriction Association site DNA)技術是廣泛應用的簡化基因組測序技術[5]。2007年，Miller等[6]發(fā)表了應用芯片雜交的RAD技術。2008年，Baird等[7]將RAD和NGS（Next-generation sequencing）結合，建立了RAD-seq技術。2012年，Peterson等[8]對RAD技術進行改進，提出了ddRAD（double digest RAD）技術。針對RAD技術流程復雜的問題，Elshire等[9]曾提出GBS（genotyping- by-sequencing）技術。隨后，Wang等[10]推出基于llB型限制性內切酶的2b-RAD技術，該技術流程簡便，重復性和標簽代表性高，基于混合泊松分布模型的de novo SNP分型新算法（iML），可使假陽性率得到較大幅度降低[11]。目前，RAD測序技術在許多物種上得到了應用，例如大麥(L. )[12]、黑麥草（）[13]等，但在果樹上還未見報道?！颈狙芯壳腥朦c】為了最終達到分離鑒定的目的，還需要大量的遺傳標記進一步對該基因進行更為精細的染色體定位。因此，在以往研究的基礎上，繼續(xù)高效開發(fā)更多與其緊密連鎖的遺傳標記是十分必要的。將2b-RAD測序技術與HRM分析技術相結合，進行果樹重要農藝性狀SNP標記的開發(fā)，是一個值得探索的途徑?！緮M解決的關鍵問題】隨著西洋梨全基因組序列的公布[14]，使大量獲得SNP標記成為可能。本研究利用分離群體分組分析的原理[15]，采用2b-RAD技術在矮生型/普通型梨對比基因池間進行比較分析，初步篩查可能與目標性狀相關的SNP位點，然后利用高效的高分辨率熔解曲線（HRM）分析技術進行大規(guī)模的群體分析，以確認與梨矮生性狀決定基因共分離的SNP標記，為進一步實現(xiàn)該基因的精細定位及分離鑒定提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2016年4—11月在青島農業(yè)大學園藝學院植物遺傳改良與育種重點實驗室進行。

1.1 基因組DNA 的提取與對比基因池的構建

以‘矮生梨’（L.）ב茌梨’（Rehd.）及‘2-3’（L.×Rehd.）ב綠寶石’（Nakai.）2個F1雜交分離群體（即群體1和群體2）為試材?！妗汀?-3’為矮生型親本；‘茌梨’和‘綠寶石’為普通型親本。群體1共有215株，其中矮生型和普通型分別有115株和100株。群體2共有168株，其中矮生型和普通型各有89株和79株。2016年4月取梨樹的幼葉，用天根植物基因組DNA提取試劑盒提取并純化基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000超微量分光光度計（Thermo Fisher Scienti?c, USA）對DNA的質量和濃度進行檢測，并將其濃度稀釋到10 ng·L-1。

從每個群體中分別抽取15個矮生型雜種和15個普通型雜種，將其DNA等量混合，形成矮生型基因池D1和D2以及普通型基因池S1和S2。

1.2 2b-RAD測序分析與SNP位點篩選

利用2b-RAD技術構建梨4個基因池的標簽測序文庫，并在Hiseq2500 v2平臺進行single-end測序（此項工作由上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司完成）。將原始reads進行質量過濾，剔除不含有XⅠ酶切識別位點的序列，剔除低質量序列（即大于10個堿基的質量分數(shù)小于20的序列），剔除有10個以上連續(xù)相同堿基的序列。從梨參考基因組序列（https:// www.rosaceae.org/species/pyrus/pyrus_communis/genome_v1.0）中提取包含XⅠ酶切位點的標簽作為參考序列。將每個樣本的高質量reads利用SOAP軟件[16]（參數(shù)設置為：-M4–v2–r0）定位到參考序列上。獲得可用于分型的unique標簽數(shù)目及深度。利用最大似然法（maximum likelihood，ML）進行SNP位點的分型（分型條件：只留取標簽內最多有3個SNP的標簽位點；分型標簽深度設置為500以下。選取在樣本間能分型的SNP位點，采用種群結構分析軟件對樣本間及組間差異SNP位點篩選數(shù)據(jù)進行分析。

1.3 與連鎖的SNP標記的鑒定

對在4個對比基因池上產生的SNP標記進行分析，篩選出矮生型基因池與普通型基因池間的多態(tài)性SNP標記，然后查找位于西洋梨染色體片段scaffold00074上的SNP位點，在其兩側合適位置設計引物（Primer 4.0 software），用HRM技術分析這些SNP標記在群體上的分離行為，以確定是否為與緊密連鎖的遺傳標記。

1.4 高分辨率熔解曲線（HRM）分析

HRM分析在LightCycler?480Ⅱ熒光定量PCR儀（Roche）上進行。反應試劑來自LightCycler?480 High Resolution Melting Master 試劑盒。反應體系為10 μL，內含10 ng基因組DNA 1 μL，1×Master Mix 5 μL，2.0 mmol·L-1MgCl21 μL，上、下游引物（0.2 μmol·L-1）各1 μL，ddH2O 1 μL。PCR擴增程序為95℃預變性10 min，然后按95℃變性10 min、55℃退火15 s、72℃延伸10 s的程序進行45個循環(huán)。在PCR循環(huán)結束后，立即對擴增產物進行HRM檢測，程序為：95℃ 1 min、40℃ 1 min、65℃1 s；在65℃升溫至95℃的過程中，以25次/℃的頻率收集熒光信息，最后降溫至40℃。

HRM分析用LightCycler?480的Gene Scanning軟件（1.5 version）進行。

2 結果

2.1 2b-RAD測序結果

對4個樣本（即4個近等基因池）的2b-RAD標簽測序文庫的測序結果共產生67 186 260條reads，平均每個樣本測序reads數(shù)為16 796 565。將原始reads進行質量過濾后的統(tǒng)計結果表明，每個樣本獲得平均unique標簽數(shù)目為86 810，平均測序深度為77×。測序深度能夠達到準確分型的標準，可以進行下一步SNP標記分型分析。SOAP軟件定位結果表明，4個測序文庫中含有酶切位點的高質量reads占測序原始reads的70%以上（表1），表明梨文庫的測序質量較好。

2.2 矮生型/普通型對比基因池間SNP位點篩選

選取在樣本間能分型的SNP位點，分別在來自群體1和群體2的4個對比基因池間進行比較分析，共篩查出可在矮生型/普通型表型間進行分型的SNP標記1 317個，進一步的標簽篩查結果表明，其中有8個SNP位于西洋梨染色體片段scaffold00074（即的定位染色體片段，長度441 741 bp）上，其染色體位置及樣品分型結果見表2。

表1 2b-RAD測序結果

D1、D2：分別來自群體1和群體2的矮生型基因池；S1、S2：分別來自群體1和群體2的普通型基因池。下同

D1 and D2 represent the dwarf bulk from population 1 and population 2, respectively. S1 and S2 represent the standard bulk from population 1 and population 2, respectively. The same as below

表2 定位到西洋梨染色體片段scaffold00074上的8個SNP標記及其分型信息

方框為堿基差異位點位置The box represents the position of the base difference

2.3 與位點共分離的SNP標記鑒定

針對以上8個定位于scaffold00074上的SNP位點，分別設計8對PCR引物（表3），并分別在群體1和群體2上進行HRM分析，最終在群體1上檢測到SNP1和SNP7兩個與位點共分離的SNP標記，在群體2上檢測到SNP1、SNP6、SNP7和SNP8 4個可與位點共分離的SNP標記。根據(jù)其擴增子的熔解曲線形狀差異，可有效地區(qū)分矮生型和普通型表型（圖1、圖2）。在群體1的215個雜種后代和群體2的168個雜種后代中，未發(fā)現(xiàn)有標記與性狀的重組類型。

表3 8個SNP位點群體分型檢測所用的HRM 引物

圖 1 SNP1和SNP7在‘矮生梨’ב茌梨’群體中的HRM分析結果

圖 2 SNP1、SNP6、SNP7和SNP8在‘2-3’ב綠寶石’群體中的HRM 分析結果

3 討論

單核苷酸多態(tài)性（SNP）是基因組中最常見的遺傳多態(tài)性。SNP標記已在果樹的遺傳圖譜構建、基因標記與定位等研究中發(fā)揮了重要作用[17-20]。與RFLP、AFLP、SSR等傳統(tǒng)基因分型技術相比，SNP分子具有分布廣泛、代表性強、穩(wěn)定性好、易于分析等優(yōu)勢。SNP分子標記的獲得往往依賴于大規(guī)模、高通量的基因組數(shù)據(jù)分析[21]。對果樹來說，其復雜的基因組是造成測序分析成本高的主要原因。

簡化基因組測序技術2b-RAD是改進的RAD技術，使測序更加簡易、精確，已在高密度遺傳圖譜的構建、群體的遺傳學研究、群體進化分析、標記開發(fā)等領域得到了應用[22-28]。高分辨率熔解曲線分析是一種高效的遺傳變異檢測方法，被廣泛的應用于突變掃描、基因分型和標記開發(fā)等方面。目前，HRM技術已發(fā)展成為SNP標記分型的重要手段[29-31]。李煒等[4]曾依據(jù)蘋果與梨基因組間高度的保守性和共線性關系，以蘋果基因組序列為參考設計了大量引物，通過HRM分析僅篩查到1個與梨矮生性狀決定基因緊密連鎖的SNP標記。為了提高SNP位點的檢測效率，本研究利用2b-RAD測序技術通過對4個對比基因池間共有標簽的序列分析，篩查到了大量的可能與目標性狀相關的SNP位點，對于初步篩查到的SNP標記，再利用高通量的HRM分析技術進行群體上的大規(guī)模驗證，以確定其是否為與目標性狀緊密連鎖的遺傳標記。這樣，可避免了在群體上繼續(xù)用2b-RAD技術進行驗證分析造成的高成本問題。本研究基于這一策略，鑒定獲得了一組與梨矮生性狀決定基因位點連鎖的新標記。可見，將2b-RAD測序技術與HRM分析技術相結合，進行果樹重要農藝性狀分子標記的開發(fā)，是一種行之有效的方法。

根據(jù)不同親本構建的雜交群體的遺傳背景是有差異的，因此，依據(jù)不同群體開發(fā)的遺傳標記是不可能完全相同的。本研究結果顯示，在群體1上，鑒定出了2個與連鎖的SNP標記；在群體2上，鑒定出了4個與連鎖的SNP標記。另外，對在不同群體上鑒定到的相同的SNP標記來說，其HRM分析熔解曲線形狀也可能會出現(xiàn)差異。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因，也與群體的遺傳基礎差別有關。本研究從2個不同的雜種群體上共檢測到了4個新的與梨緊密連鎖的DNA分子標記。這些標記，不僅可以作為目標基因定位的參考依據(jù)，也可成為目標性狀標記輔助選擇的有力工具。

4 結論

應用2b-RAD技術對2對矮生型/普通型對比基因池進行基因組測序分析，在對比基因池間篩選出單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點1 317個，其中有8個SNP位點位于的定位染色體scaffold0007上。用HRM分析技術對這8個SNP位點進行群體上的進一步檢測，共鑒定出4個與位點共分離的SNP標記，其中SNP1和SNP7為2對群體共有的SNP標記。這一研究結果對的精細定位及其候選基因的篩查具有重要參考。

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（責任編輯 趙伶俐）

Development of DNA Molecular Markers for the Dwarf Trait in Pear through the Method of 2b-RAD Sequencing and HRM Analysis

XIAO YuXiong, WANG CaiHong, TIAN YiKe, Yang ShaoLan, Li DingLi, ZHANG HaiYue

(College of Horticulture, Qingdao Agricultural University/Qingdao Key Laboratory of Genetic Improvement and Breeding in Horticultural Plants, Qingdao 266109, Shandong)

【Objective】As an important agronomic trait, the dwarf character of tree is significant to fruit intensive culture. The dwarf traits of pear originated from variety ‘Le Nain Vert’, a chance seedling of, is determined by a dominant gene, which sequence information is still unknown. Development of DNA molecular markers tightly linked to thelocus could provide important information for identifying of this gene.【Method】Using 2 different F1populations obtained from ‘Aishengli’בChili’ and ‘2-3’בLvbaoshi’, respectively, as plant materials, 2 pairs of bulks for dwarf type/standard type were sequenced through IIB restriction association site DNA (2b-RAD) technology, and then single nucleotide polymorphism (SNP) markers were detected between the dwarf and standard bulks based on the principle of bulked segregant analysis. After that, those SNPs located on themapped chromosome were selected and tested on the whole population to confirm their linkage relationship to thegene by high-resolution melting (HRM) analysis.【Result】A total of 67 186 260 reads were produced from the 2b-RAD sequencing of the 4 samples (2 pairs of bulks). That means the average reads per sample was 16 796 565. Statistical analysis of the filtered raw reads showed that the average unique tags per sample were 86 810, and the average sequencing depth was 77× which was enough for accurate genotyping. For the 4 libraries, mapping through SOAP software indicated that the high quality reads containing the restriction site accounted for more than 70% of the raw reads, which means the high quality of sequencing. Totally 1 317 polymorphic SNP markers were screened between the dwarf bulks and standard bulks derived from the 2 different populations, and 8 of them were mapped on the-localized chromosome scaffold00074. Further detection of the 8 SNPs through HRM analysis showed that 2 and 4 SNP markers co-segregated with thelocus were identified from population ‘Aishengli’בChili’ and population ‘2-3’בLvbaoshi’, respectively. According to the different shapes of the melting curves of amplicons, the dwarf/normal phenotype could be distinguished effectively. The recombinants for each marker and the target trait were not found in both of the two populations, which contained 215 and 168 progenies, respectively. 【Conclusion】The combination of 2b-RAD sequencing and HRM analysis technology is an efficient method for exploiting molecular markers of important agronomic traits in fruit trees. In this study, a total of 4 SNP markers co-segregated with thelocus were identified based on this strategy.

pear; dwarf traits;; SNP marker; 2b-RAD; HRM

2017-01-20；接受日期：2017-04-13

國家自然科學基金（31372049）、山東省現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系果品創(chuàng)新團隊（SDAIT-06-06）

肖玉雄，E-mail：1427449415@qq.com。通信作者王彩虹，E-mail：chwang@qau.edu.cn