間苯三酚栓劑在家兔體內(nèi)的藥動學(xué)研究

廖昌軍，凌保東，王茜，廖麗云，陳秀明

（1.四川省高校結(jié)構(gòu)特異性小分子藥物重點實驗室，四川成都610083；2.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川成都610083）

間苯三酚栓劑在家兔體內(nèi)的藥動學(xué)研究

廖昌軍1，2，凌保東1，2，王茜2，廖麗云2，陳秀明2

（1.四川省高校結(jié)構(gòu)特異性小分子藥物重點實驗室，四川成都610083；2.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川成都610083）

建立液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）測定間苯三酚血藥濃度的方法，并研究間苯三酚栓劑在家兔體內(nèi)的藥動學(xué)特征。取6只健康家兔直腸給予間苯三酚栓劑，于給藥前和給藥后5，10，15，18，20，25，30，45，60，90，120，180 min分別自耳動脈采血0.5mL。采用LC-MS檢測其血藥濃度，安捷倫C18柱（4.6mm×50mm，1.7μm），流動相甲醇-水（含0.1%甲酸）梯度洗脫，三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜電噴霧（ESI）離子源，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式進(jìn)行檢測，離子化方式為正模式，進(jìn)樣量為2μL。采用DAS3.0藥動學(xué)軟件計算其在家兔體內(nèi)的藥動力學(xué)參數(shù)。間苯三酚在0.1725～5.52mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值呈良好的線性關(guān)系。間苯三酚在家兔體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)t1/2，Tmax，Cmax，AUC0-∞分別為65.733min，15min，1.2773mg/L，39.993（mg·min）/L。該方法專屬性強、精密度好，可用于間苯三酚家兔體內(nèi)的藥動學(xué)研究。間苯三酚栓劑在家兔體內(nèi)代謝過程符合一室模型。

間苯三酚；栓劑；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；藥動學(xué)

0 引言

間苯三酚是目前應(yīng)用較廣泛的新型平滑肌解痙藥[1-2]，能直接作用于胃腸道和泌尿生殖道的平滑肌，對正常平滑肌影響較小[3-4]，解痙效果快，療效顯著，臨床應(yīng)用非常廣泛[5-8]。目前間苯三酚市售的劑型有注射劑、顆粒劑、注射粉末和口服凍干片等，主要用于消化科和婦科上的痙攣性疾病[9-10]。關(guān)于間苯三酚制劑和原料藥等的體外含量測定研究報道較多，體內(nèi)藥代動力學(xué)研究國內(nèi)報道甚少。楊瑞玲等[11]進(jìn)行了間苯三酚顆?？诜o藥在家兔體內(nèi)的藥動學(xué)研究，而間苯三酚直腸給藥后體內(nèi)藥動學(xué)研究文獻(xiàn)國內(nèi)未見報道。本文在楊瑞玲[11]建立的家兔血漿中LC-MS含量測定方法的基礎(chǔ)上，對間苯三酚栓劑直腸給藥后體內(nèi)藥動學(xué)特征進(jìn)行了研究，為間苯三酚栓劑的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

電子天平（CP225D，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；旋渦混合器（XW-80A，上海青浦瀘西儀器廠）；離心機（Heraeus Pico 17，ThermoFisher）；氮吹儀（MTN-2800D，天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；液質(zhì)聯(lián)用儀（6410B，安捷倫三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜）。

1.2 試劑

間苯三酚栓劑（實驗室自制，批號：2015121001），間苯三酚對照品（康邦生物科技有限公司，批號：110807-201505，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%）；內(nèi)標(biāo)物咖啡因（成都康邦生物科技有限公司，批號：110773-201512，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%）；甲醇、甲酸為色譜純，其余試劑為分析純，水為實驗室超純水。

1.3 動物

健康家兔（雌雄各半），體重（2.5±0.5）kg，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號為SCXK（川）2008-19。動物實驗均按照實驗動物醫(yī)學(xué)倫理審查委員會批準(zhǔn)的動物協(xié)議和指南進(jìn)行。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜和質(zhì)譜條件

安捷倫C18柱（4.6mm×50mm，1.7μm）；流動相A為甲醇，B為水（0.1%甲酸），梯度洗脫（程序見表1），流量0.8mL/min，柱溫40℃。安捷倫三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜，干燥氣為氮氣，干燥氣溫度：350℃，干燥氣流量：11 L/min；電噴霧離子源（ESI），毛細(xì)管電壓：4 kV，霧化氣壓力：40 psi（1 psi=6.89 kPa），裂解電壓：105V，離子化方式為正模式。碰撞能量：100V（咖啡因）、60V（間苯三酚），Cell Accelerato Voltage：3 V，檢測方式為多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方法，用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z 194.9→m/z 138.0（咖啡因，[M+H]+），m/z 127.0→m/z 81.2（間苯三酚，[M+H]+），進(jìn)樣量2μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 對照品溶液配制

精密稱取間苯三酚對照品13.8mg，流動相B定容至50mL，再取0.5mL該溶液定容至10mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為13.8mg/L對照品貯備液。分別取對照品貯備液0.125，0.250，0.500，1.000，2.00，4.00mL于6個5mL容量瓶中，流動相B定容，得到質(zhì)量濃度為0.345，0.690，1.380，2.760，5.520，11.040mg/L的系列對照品溶液，冷藏于4℃冰箱備用。

2.3 內(nèi)標(biāo)溶液配制

精密稱取咖啡因?qū)φ掌?0mg，流動相B定容至10mL，再取0.5mL該溶液定容至50mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為10mg/L內(nèi)標(biāo)貯備液。冷藏于4℃冰箱備用。

2.4 血漿樣品處理

健康家兔，禁食12h后，在耳動脈埋入1枚留置針，用膠帶固定，取血漿0.2 mL，加入0.1 mL咖啡因內(nèi)標(biāo)貯備液和5mL乙酸乙酯，搖勻，渦旋振蕩5min，離心（10 000 r/min)10 min，分取乙酸乙酯層，氮吹儀揮干，0.2mL甲醇復(fù)溶,離心（10 000 r/min）10min后取上清液待測。

2.5 方法專屬性考察

分別取空白血漿和含藥血漿按照2.1項條件進(jìn)樣2μL，結(jié)果間苯三酚的保留時間約為4.0 min，內(nèi)標(biāo)物咖啡因的保留時間約為6.5min。血漿內(nèi)源性成分不干擾樣品的測定（見圖1～圖5）。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取家兔空白血漿0.1mL 6份，置6個10mL容量瓶中，均加入0.1mL內(nèi)標(biāo)貯備液與5mL乙酸乙酯，分別加入系列濃度間苯三酚對照品溶液0.1 mL，搖勻，渦旋振蕩5min，離心（10000r/min）10min，取上清液，氮吹儀揮干，0.2mL甲醇復(fù)溶，離心（10000r/min）10min后取上清液，分別進(jìn)樣2μL。記錄間苯三酚及內(nèi)標(biāo)物峰面積。以間苯三酚的峰面積分別與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以間苯三酚質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到間苯三酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.5206x-0.0007，r2=0.9983。結(jié)果表明：間苯三酚在0.1725～5.52mg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取家兔空白血漿，按照2.6項下方法操作，制備成間苯三酚質(zhì)量濃度分別為0.20，1.38，4.40mg/L的血漿溶液，4℃放置0，1，2，4，8，12，24 h，按照2.1項下分析條件分別進(jìn)樣2 μL，結(jié)果間苯三酚低、中、高濃度RSD分別為2.89%、2.99%和2.56%，表明家兔血漿樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

圖3 血漿樣品+內(nèi)標(biāo)

圖4 血漿樣品間苯三酚質(zhì)譜圖

圖5 血漿樣品咖啡因內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜圖

2.8 凍融穩(wěn)定性

精密吸取間苯三酚對照品溶液，加入空白血漿和內(nèi)標(biāo)溶液，按2.4項處理，并反復(fù)凍融3次，按2.1項下分析條件測定，結(jié)果間苯三酚質(zhì)量濃度的RSD為3.06%（n=6），說明家兔血漿樣品反復(fù)凍融3次基本穩(wěn)定。

2.9 密度試驗

取2.7項下質(zhì)量濃度分別為0.20，1.38，4.40mg/L的間苯三酚血漿溶液進(jìn)行測定，同日內(nèi)每份樣品測定3次，考察日內(nèi)精密度；3d內(nèi)同法平行制備上述血漿溶液，處理后，進(jìn)樣測定，考察日間精密度。結(jié)果顯示，日內(nèi)RSD分別為4.9%，4.6%，4.4%（n=3），日間RSD分別為5.1%，4.8%，5.2%（n=3）。

2.10 回收率試驗

取2.7項下質(zhì)量濃度分別為0.20，1.38，4.40mg/L（低、中、高質(zhì)量濃度）的間苯三酚血漿樣品，各3份，進(jìn)樣測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算血藥濃度；以其與相應(yīng)質(zhì)量濃度的間苯三酚對照品溶液測得量進(jìn)行比較，計算提取回收率。結(jié)果見表2。

表2 間苯三酚在家兔血漿中的回收率（n=3）

2.11 藥動學(xué)實驗

取健康家兔6只（雌雄各半），禁食12h后，在耳動脈埋入1枚留置針，用膠帶固定，分別直腸給藥間苯三酚栓劑1粒，于給藥前和給藥5，10，15，18，20，25，30，45，60，90，120，180min從留置針中取血0.5mL，置于肝素抗凝的EP管中，10000r/min離心10min，取上層血漿，按照2.4項下方法處理樣品，進(jìn)樣2μL。不同時間點的間苯三酚的血藥濃度見表3，將表中6組血藥濃度-時間數(shù)據(jù)代入DAS3.0藥動學(xué)軟件進(jìn)行擬合處理后，間苯三酚的平均藥-時曲線見圖6，藥代動力學(xué)參數(shù)見表4。

表3 家兔直腸給藥不同時間點的間苯三酚的血藥濃度（n=6）

圖6 家兔直腸給藥間苯三酚栓劑平均藥-時曲線（n=6）

表4 間苯三酚主要藥代動力學(xué)參數(shù)（n=6）

結(jié)果顯示，直腸給藥后間苯三酚在15 min左右血藥濃度達(dá)到高峰，平均達(dá)峰濃度約為1.2773mg/L，消除半衰期約為65.733min，表明間苯三酚直腸給藥后在家兔體內(nèi)吸收迅速，達(dá)峰時間較短，在家兔體內(nèi)的代謝過程符合一室模型。

3 結(jié)束語

本實驗預(yù)先在家兔耳動脈埋入留置針，每次取血時只需用注射器從留置針抽取所需血量，采血時間較短、血流順暢，對實驗動物創(chuàng)傷性小，提高了實驗動物的依從性，可反復(fù)多次取血，降低了采血的誤差。

目前研究大多進(jìn)行的是間苯三酚口服制劑給藥后血漿樣品測定方法的建立和體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)研究，而間苯三酚栓劑給藥后藥動學(xué)研究未見報道。本文進(jìn)行間苯三酚栓劑直腸吸收的藥物動力學(xué)研究，與間苯三酚口服制劑給藥相比較，結(jié)果證明，直腸給藥后有效成分的吸收比口服給藥快，峰濃度、吸收總量和生物利用度均高于口服給藥[11]。間苯三酚栓劑直腸給藥能防止或減少肝臟和胃腸消化液對藥物的破壞，使間苯三酚的生物利用度更高。本文建立的LC-MS測定血漿樣品中間苯三酚含量的方法，能夠快速、準(zhǔn)確地測定血漿樣品中間苯三酚含量。

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（編輯：莫婕）

Pharmacokinetic study of phloroglucinol suppository in rabbits in vivo

LIAO Changjun1，2，LING Baodong1，2，WANG Qian2，LIAO Liyun2，CHEN Xiuming2
（1.Key Laboratory of Small Molecule Special Structure Drugs，Sichuan Institution of Higher Education，
Chengdu 610083，China；2.School of Pharmacy，Chengdu Medical College，Chengdu 610083，China）

The paper established a method to determine the plasma concentration of phloroglucinol with LC-MS and studied the pharmacokinetic characteristics of phloroglucinol suppository in rabbits in vivo.In total of 0.5 mL ear arterial blood of 6 healthy rabbits was collected 5，10，15，18，20，25，30，45，60，90，120，180min before and after phloroglucinol suppository was applied to them through rectum.LC-MS was conducted to determine the drug concentration and the Agilent C18 column（4.6mm×50mm，1.7μm），mobile phase of methanol-water（0.1%formic acid）gradient elution，triple quadrupole mass spectrometry electrospray ionization（ESI）ion source and multiple reaction monitoring（MRM）mode were used for testing.The ionization mode was positive mode and the injection volume was 2μL.The pharmacokinetics parameters were calculated by DAS 3.0.There was a good linear relationship between phloroglucinol and the peak area and internal standard peak area in the range of 0.172 5-5.52mg/L.The pharmacokinetic parameters of phloroglucinol t1/2，Tmax，Cmax，AUC0-∞were 65.733 min，15 min，1.277 3 mg/L，39.993（mg·min）/L.This method has advantagesinstrongspecificityandgoodprecision，whichcanbeusedforstudyingthepharmacokinetics of phloroglucinol in rabbits.The metabolism process of phloroglucinol suppository in rabbits is consistent with the single compartment model.

phloroglucinol；suppository；LC-MS；pharmacokinetic

A

1674-5124（2017）08-0055-05

2016-12-09；

2017-02-07

四川省教育廳重大培育項目資助（16CZ0029）

廖昌軍（1981-），男，四川自貢市人，高級實驗師，主要從事藥物代謝研究工作。

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.08.012