李津金 王毅軍芮慶林 指導(dǎo) 奚肇慶 王海丹
(江蘇省中醫(yī)院,江蘇 南京 210029)
上感顆粒對肺炎鏈球菌感染性肺炎小鼠白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白和肺指數(shù)的影響*
李津金 王毅軍△芮慶林 指導(dǎo) 奚肇慶 王海丹
(江蘇省中醫(yī)院,江蘇 南京 210029)
目的 觀察上感顆粒對肺炎鏈球菌感染性肺炎小鼠白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白(CRP)和肺指數(shù)的影響,探討該方是否對肺炎鏈球菌感染性肺炎小鼠具有治療作用。方法 肺炎鏈球菌感染性肺炎小鼠隨機(jī)分正常組、模型組、上感顆粒低劑量組、上感顆粒高劑量組、鹽酸左氧氟沙星組、上感顆粒高劑量聯(lián)合鹽酸左氧氟沙星組,觀察給藥第3日末、第6日末其白細(xì)胞、CRP和肺指數(shù)水平的變化。結(jié)果 上感顆粒低劑量組、高劑量組、上感顆粒高劑量聯(lián)合鹽酸左氧氟沙星組均能降低肺炎鏈球菌感染性肺炎小鼠的肺指數(shù)、血白細(xì)胞、CRP水平,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 上感顆??山档头窝祖溓蚓腥拘苑窝仔∈蟮姆沃笖?shù)、血白細(xì)胞、CRP水平,表明其對肺炎鏈球菌感染性肺炎小鼠有治療作用。
上感顆粒 肺炎鏈球菌感染性肺炎 白細(xì)胞 C反應(yīng)蛋白(CRP) 肺指數(shù)
上感顆粒是江蘇省名老中醫(yī)奚肇慶教授,在繼承吳門中醫(yī)學(xué)(葉天士為代表)、山陽中醫(yī)學(xué)(吳鞠通為代表)溫?zé)嵬飧邪l(fā)熱的理論與辨證方藥的基礎(chǔ)上,總結(jié)臨床經(jīng)驗(yàn),得出上呼吸道感染發(fā)熱的衛(wèi)分表證短暫,外邪易入里化熱,應(yīng)早用、重用清氣法祛病的理論,據(jù)此研制而成。在臨床中觀察治療465例病毒性上呼吸道感染發(fā)熱患者,結(jié)果發(fā)現(xiàn)對于各證候的總有效率達(dá)到85%以上[1-2],顯示出理想的療效。社區(qū)獲得性肺炎發(fā)熱亦是由于正氣不足,表衛(wèi)不固,不能御邪與外,外邪入里化熱所致。筆者認(rèn)為上感顆粒應(yīng)能夠應(yīng)用于社區(qū)獲得性肺炎的治療。本實(shí)驗(yàn)旨在探討上感顆粒對肺炎鏈球菌感染性肺炎小鼠是否具有治療作用,為進(jìn)一步擴(kuò)大上感顆粒臨床應(yīng)用范圍,提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?,F(xiàn)報(bào)告如下。
1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級BALB/c小鼠120只,雌雄各半,6~8周齡,體質(zhì)量18~22 g。由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供,許可證號:SCXK(蘇)2012-0004。
1.2 藥物及試劑 上感顆粒組成:羌活12 g,薄荷6 g,柴胡12 g,黃芩10 g,青蒿10 g,石膏30 g,大青葉15 g,鴨跖草15 g,生甘草3 g。免煎中藥顆粒配方,由江陰天江藥業(yè)有限公司提供;鹽酸左氧氟沙星片:江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供 (批號14111153);CRP試劑盒:浙江康特生物科技有限公司提供(批號B150414);臨床分離的肺炎鏈球菌由江蘇省中醫(yī)院微生物鑒定室提供。
1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 AB Pentra Xl 80血細(xì)胞分析儀(法國HORIBA公司);AU480全自動生化儀(美國BECKMAN公司);SUNRISE酶標(biāo)儀 (瑞士TECAN公司);FA1004電子天平 (上海天平廠);YXQ-2S-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);生物安全柜BSC-1500ⅡA2-X(濟(jì)南鑫貝西亞生物技術(shù)有限公司);孵箱(上海分析儀器廠)。
1.4 分組及造模 取清潔級BALB/c小鼠120只,隨機(jī)等分成6組,分別為正常對照組、模型組、上感顆粒低劑量組、上感顆粒高劑量組、鹽酸左氧氟沙星片組、上感顆粒高劑量聯(lián)合鹽酸左氧氟沙星組。給藥前1 d,用10%水合氯醛按3 mL/kg劑量腹腔注射給藥,待有明顯麻醉癥狀后,用無菌針頭刺破鼻黏膜后滴入配好的肺炎鏈球菌菌液50 μL(菌量3×107CFU)[3]制備肺炎鏈球菌感染性肺炎小鼠模型。
1.5 給藥方法 造模后第2日,正常組、模型組給予等量生理鹽水,上感顆粒高劑量組、上感顆粒低劑量組分別按56.4、28.2 g/kg給藥,鹽酸左氧氟沙星片組按0.249 g/kg給藥,上感顆粒高劑量聯(lián)合鹽酸左氧氟沙星組按上感顆粒56.4 g/kg加鹽酸左氧氟沙星0.249 g/kg給藥。各組給藥的體積均為0.2 mL/10 g,灌胃給藥,每日1次,連續(xù)7 d。
1.6 標(biāo)本采集與檢測 1)觀察各組小鼠生長情況及行為變化。2)觀察各組小鼠肺病理組織病變。取各組小鼠給藥第3日末、第6天日的肺臟,經(jīng)過10%甲醛液固定,常規(guī)取材,脫水,石蠟包埋,制片(4 μm),HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肺病變情況。根據(jù)病變輕重程度不同,依次標(biāo)記為“-、+、++、+++”,其中“-”為無明顯改變,“+、++、+++”分別為輕、中、重度病理改變,同時對相應(yīng)病變程度分別賦值為0、1、2、3,計(jì)算出病變評分。3)觀察肺指數(shù)。各組小鼠于給藥第3日末、第6日末,脫頸椎處死,摘取小鼠完整肺組織,潔凈紗布吸干水分,稱質(zhì)量后計(jì)算肺指數(shù)。肺指數(shù)=肺全質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×10。4)測定血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、CRP水平。各組小鼠于給藥第3日末、第6日末,眼眶靜脈叢取血,離心,取血清。白細(xì)胞通過AB Pentra Xl 80血細(xì)胞分析儀測定。CRP采用免疫散射比濁法檢測,試劑盒由浙江康特生物科技有限公司提供。操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以(±s)表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 各組小鼠生長情況及行為變化 正常組小鼠精神良好,行動靈活敏捷,毛發(fā)有光澤,呼吸正常,飲食正常,體質(zhì)量自然增長。模型組小鼠感染細(xì)菌后2 d內(nèi)未出現(xiàn)明顯異常癥狀,第3日開始出現(xiàn)呼吸急促,行動遲緩,毛發(fā)無光澤,飲食減少、消瘦等表現(xiàn)。上感顆粒低劑量組、高劑量組、鹽酸左氧氟沙星組、上感顆粒高劑量聯(lián)合鹽酸左氧氟沙星組部分小鼠第3~4日出現(xiàn)輕微的病態(tài)表現(xiàn),呼吸稍急促,飲食少量減少,毛色稍欠光澤,體質(zhì)量增長緩慢。各組小鼠實(shí)驗(yàn)期間均未發(fā)生死亡。
2.2 上感顆粒對肺炎鏈球菌感染性肺炎小鼠肺組織的影響 從形態(tài)學(xué)上觀察:用藥第3天日模型組小鼠肺臟體積明顯增大,整個肺部可見成片實(shí)變區(qū),呈暗紅色;用藥第6日末模型組小鼠肺臟病變略有減輕。用藥第3日末、第6日末各用藥組肺臟病變與模型組相比,均有不同程度減輕。從組織學(xué)上觀察:用藥第3日末,正常組小鼠大部分肺組織均呈正常形態(tài)。病變總評分為0分,平均評分為0分。模型組大部分肺組織均呈中至重度肺實(shí)質(zhì)、間質(zhì)炎癥。病變總評分為59分,平均評分為5.9分。上感顆粒低劑量組肺組織總體病變程度略輕于模型組。1例肺部炎癥基本恢復(fù)正常。病變總評分為41分,平均評分為4.1分。上感顆粒高劑量組肺組織總體病變程度輕于模型組。2例肺部炎癥基本恢復(fù)正常。病變總評分為36分,平均評分為3.6分。左氧氟沙星組肺組織總體病變程度輕于模型組。2例肺部炎癥基本恢復(fù)正常。病變總評分為32分,平均評分為3.2分。左氧氟沙星+上感顆粒高劑量組肺組織總體病變程度明顯輕于模型組。2例肺部炎癥基本恢復(fù)正常。病變總評分為21分,平均評分為2.1分。見圖1。
圖1 給藥第3天末肺組織切片(HE染色,100倍)
用藥第6日末,正常組小鼠大部分肺組織均呈正常形態(tài)。病變總評分為0分,平均評分為0分。模型組大部分肺組織均呈輕至中度肺實(shí)質(zhì)、間質(zhì)炎癥。病變總評分為40分,平均評分為4.0分。上感顆粒低劑量組肺組織總體病變程度略輕于模型組。2例肺部炎癥基本恢復(fù)正常。病變總評分為29分,平均評分為2.9分。上感顆粒高劑量組肺組織總體病變程度輕于模型組。5例肺部炎癥基本恢復(fù)正常。病變總評分為24分,平均評分為2.4分。左氧氟沙星組肺組織總體病變程度輕于模型組。5例肺部炎癥基本恢復(fù)正常。病變總評分為35,平均評分為3.5分。左氧氟沙星+上感顆粒高劑量組肺組織總體病變程度明顯輕于模型組。3例肺部炎癥基本恢復(fù)正常。病變總評分為2.2分,平均評分為2.2分。見圖2。
圖2 給藥第6天末肺組織切片(HE染色,100倍)
2.3 上感顆粒對肺炎鏈球菌感染性肺炎小鼠肺指數(shù)的影響 見表1。肺炎鏈球菌感染性肺炎小鼠模型組在給藥第3日末和給藥第6日末的體質(zhì)量明顯降低,與正常組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。模型組小鼠給藥第6日末的肺指數(shù)明顯上升,與正常組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。上感顆粒低劑量組、上感顆粒高劑量組、左氧氟沙星組、上感顆粒高劑量聯(lián)合鹽酸左氧氟沙星組小鼠在給藥第6日末的肺質(zhì)量和肺指數(shù)比模型組降低(P<0.05或P<0.01)。
表1 各組小鼠給藥3 d、6 d肺臟指數(shù)比較(±s)
表1 各組小鼠給藥3 d、6 d肺臟指數(shù)比較(±s)
與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01。下同。
組別 時間正常組 給藥3 d(n=10) 給藥6 d模型組 給藥3 d實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量(g)給藥3 d體質(zhì)量(g) 肺質(zhì)量(g) 肺指數(shù)(g/10 g)21.25±0.63 21.97±0.92 0.144±0.014 0.066±0.007 20.96±0.78 22.02±0.89 0.138±0.020 0.063±0.010 20.98±0.93 20.15±1.19△△0.123±0.017△△0.061±0.009(n=10) 給藥6 d 21.06±0.74 20.08±0.82△△0.155±0.022 0.077±0.012△△鹽酸左氧氟沙星片組 給藥3 d 21.01±0.60 19.38±0.66 0.120±0.029 0.062±0.016(n=10) 給藥6 d 21.27±0.71 19.98±0.87 0.132±0.022*0.066±0.011*上感顆粒高劑量組 給藥3 d 21.3±0.55 19.6±1.24 0.140±0.027 0.072±0.016(n=10) 給藥6 d 21.41±0.27 20.37±1.07 0.132±0.018*0.065±0.009*上感顆粒低劑量組 給藥3 d 21.37±0.55 19.54±1.19 0.137±0.019 0.070±0.007*(n=10) 給藥6 d 21.33±0.31 19.91±0.88 0.123±0.019**0.062±0.010**聯(lián)合組 給藥3 d 21.49±0.27 19.82±1.15 0.137±0.019 0.070±0.012(n=10) 給藥6 d 21.18±0.38 19.15±1.05*0.121±0.035*0.063±0.016*
3.4 上感顆粒對肺炎鏈球菌感染性肺炎小鼠血白細(xì)胞水平的影響 見表2。肺炎鏈球菌感染性肺炎小鼠模型組在給藥第3日末和給藥第6日末的白細(xì)胞明顯升高,與正常組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。上感顆粒高劑量組、上感顆粒低劑量組、左氧氟沙星組、上感顆粒高劑量聯(lián)合鹽酸左氧氟沙星組小鼠在給藥第3日末的白細(xì)胞比模型組明顯降低,與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。上感顆粒高劑量組、左氧氟沙星組、上感顆粒高劑量聯(lián)合鹽酸左氧氟沙星組小鼠在給藥第6日末的白細(xì)胞比模型組明顯降低(P<0.05或P<0.01)。
表2 各組小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(×109,±s)
表2 各組小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(×109,±s)
組別 n 給藥6 d正常組 10 5.62±1.15模型組 10 8.37±2.08△△鹽酸左氧氟沙星片組 10 3.92±1.18**造模前 給藥3 d 4.765±1.109 5.61±1.04 4.665±1.005 7.44±1.84△4.695±1.047 5.82±1.52*上感顆粒高劑量組 10 5.06±1.23**4.735±1.110 5.18±1.90*上感顆粒低劑量組 10 4.825±1.175 5.25±0.94**7.02±1.25聯(lián)合組 10 4.755±0.980 4.54±1.06**4.84±1.50**
2.5 上感顆粒對肺炎鏈球菌感染性肺炎小鼠血清CRP的影響 見表3。肺炎鏈球菌感染性肺炎小鼠模型組在給藥第3日末和給藥第6日末的CRP明顯升高,與正常組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。左氧氟沙星組、上感顆粒高劑量聯(lián)合鹽酸左氧氟沙星組小鼠在給藥第3日末的CRP比模型組明顯降低(P<0.05)。上感顆粒低劑量組、上感顆粒高劑量組、左氧氟沙星組、上感顆粒高劑量聯(lián)合鹽酸左氧氟沙星組小鼠在給藥第6天末的CRP比模型組明顯降低(P<0.05)。
表3 各組小鼠CRP水平比較(mg/L,±s)
表3 各組小鼠CRP水平比較(mg/L,±s)
組別 n 給藥6 d正常組 10 1.098±0.123模型組 10 1.549±0.462△鹽酸左氧氟沙星片組 10 1.134±0.095*給藥3 d 1.156±0.135 1.353±0.127△1.174±0.167*上感顆粒高劑量組 10 1.085±0.105*1.277±0.101上感顆粒低劑量組 10 1.246±0.152 1.121±0.084*聯(lián)合組 10 1.201±0.090*1.103±0.090*
上感顆粒中柴胡輕清升散,疏邪透表;黃芩苦寒,善清表里之火,一散一清,清解邪熱,共為君藥。石膏除煩解肌,泄熱;羌活、薄荷合柴胡加強(qiáng)疏邪解表之力,且可避免全方過于寒涼,兼能除濕,為治肢體酸痛之要藥;青蒿清熱瀉火,助黃芩清表里郁熱,三者同為臣藥。大青葉、鴨跖草輔黃芩清熱解毒,瀉火,故為佐藥。甘草為使,扶正以助祛邪。臨床上治療病毒性上呼吸道感染取得了良好的效果[4-5]。本研究將上感顆粒用于治療肺炎鏈球菌肺炎小鼠,同樣取得了良好的效果。
本研究結(jié)果顯示,模型組與正常組的比較,肺指數(shù)顯著性上升,血白細(xì)胞顯著升高,表明小鼠肺部感染肺炎鏈球菌后,細(xì)菌毒素對小鼠肺組織造成損傷,肺組織發(fā)生炎癥反應(yīng),肺部血管擴(kuò)張、充血、滲出,肺組織發(fā)生水腫,以及炎性細(xì)胞浸潤,使得肺質(zhì)量、肺指數(shù)、白細(xì)胞升高。經(jīng)藥物治療后,上感顆粒低劑量組、上感顆粒高劑量組、左氧氟沙星組、上感顆粒高劑量聯(lián)合鹽酸左氧氟沙星組肺炎鏈球菌感染性肺炎小鼠肺重量、肺指數(shù)、血白細(xì)胞水平均降低,與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示上感顆粒能夠減輕肺炎鏈球菌肺炎小鼠的肺組織炎癥,具有治療肺炎鏈球菌肺炎的作用。
CRP作為一種經(jīng)典的急性時相反應(yīng)蛋白,對疾病無診斷特異性,但其濃度水平對于各種炎癥和組織損傷有靈敏的反映。健康人血清中CRP濃度極低(0.068~8.2 mg/L),一旦出現(xiàn)炎癥、感染、創(chuàng)傷等,可在幾小時內(nèi)迅速增高,并于1~3 d達(dá)頂峰,此時濃度可達(dá)正常時的十倍、百倍甚至千倍,其上升幅度、速度、持續(xù)時間與患者的病情嚴(yán)重程度和組織損傷程度密切相關(guān),且變化不受患者放化療及其他藥物的影響。當(dāng)病情緩解后,它又可迅速下降到正常范圍[6-8]。
本研究結(jié)果顯示,模型組與正常組的比較,血清CRP顯著升高,提示小鼠肺組織感染肺炎鏈球菌后,產(chǎn)生了明顯的損傷。經(jīng)藥物治療后,上感顆粒低劑量組、上感顆粒高劑量組、上感顆粒高劑量聯(lián)合鹽酸左氧氟沙星組小鼠血清CRP水平均顯著降低,與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示肺炎鏈球菌肺炎小鼠經(jīng)過上感顆粒治療后,肺部炎癥明顯減輕,病情明顯改善。
上感顆粒能夠治療肺炎鏈球菌肺炎,可能是通過對細(xì)菌發(fā)揮直接抗菌作用,以及通過抑制機(jī)體炎癥反應(yīng),維持機(jī)體炎癥反應(yīng)綜合征和代償性抗炎反應(yīng)綜合征的相對平衡而產(chǎn)生的。根據(jù)現(xiàn)代藥理,分析上感顆粒組方,其中黃芩、青蒿、大青葉、鴨跖草具有一定的抗菌作用[9-12]。如黃芩對葡萄球菌、鏈球菌等細(xì)菌具有不同程度的抑制作用。動物實(shí)驗(yàn)表明上感顆粒對病毒性肺炎小鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用,能夠減輕病毒性肺炎小鼠肺組織炎癥,主要通過減少CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群增殖,降低CD4+/CD8+水平,減輕過激的炎癥反應(yīng)對組織的損傷,如降低肺組織TLR3及PKR mRNA的表達(dá),抑制炎性介質(zhì)TNF-α釋放,以及促進(jìn)抗炎介質(zhì)IL-2釋放,發(fā)揮治療作用[13-15]。
本研究表明,上感顆粒對于肺炎鏈球菌肺炎小鼠具有治療作用。因此,該研究為上感顆粒進(jìn)一步應(yīng)用于社區(qū)獲得性肺炎的治療提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
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Effects of Shanggan Granule on White Blood Cell,CRP and Lung Index in Mice with Streptococcus Pneumoniae
LI Jinjin,WANG Yijun,RUI Qinglin,et al. Traditional Chinese Medicine Hospital of Jiangsu Province,Jiangsu,Nanjing 210029,China.
Objective:To observe effects of Shanggan Granule on white blood cell,CRP and lung index in mice with streptococcus pneumonia,and to investigate whether the prescription has therapeutic effect on streptococcus pneumoniae infected mice.Methods:Streptococcus pneumoniae infected mice were randomly divided into 6 groups:the normal group,the model group,low dose group of Shanggan Granule,high dose group of Shanggan Granule,Levofloxacin group and the group of high dose of Shanggan Granule and Levofloxacin.White blood cell,CRP and lung index were observed on 3rd and 6th day after treatment.Results:Compared with the model group,the degree of white blood cell,CRP and lung index in low dose group of Shanggan Granule,high dose group of Shanggan Granule and the group of high dose of Shanggan Granule and Levofloxacin significantly reduced(P< 0.05).Conclusions:Shanggan Granule can reduce white blood cell,CRP and lung index in mice with streptococcus pneumoniae,which shows that it has a therapeutic effect on streptococcus pneumoniae infected mice.
Shanggan Granule;Streptococcus pneumoniae;White blood cell;C-reaction Protein(CRP);Lung index
R285.5
A
1004-745X(2017)08-1368-04
10.3969/j.issn.1004-745X.2017.08.016
2017-05-25)
江蘇省中醫(yī)院院級課題(Y14057);江蘇省中醫(yī)藥管理局省重點(diǎn)科室資助項(xiàng)目
△通信作者(電子郵箱:wyjyn@189.cn)