新法合成納米銀及其對鳥分枝桿菌的抗菌活性研究

王春花 李維宏 趙慧 穆成 孫蕊

·短篇論著·

新法合成納米銀及其對鳥分枝桿菌的抗菌活性研究

王春花 李維宏 趙慧 穆成 孫蕊

以山楂葉水提取物作為還原劑，采用生物法合成納米銀粒子。采用BACTEC MGIT 960 培養(yǎng)系統(tǒng)對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和鳥分枝桿菌(ATCC25291)對鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇一線抗結(jié)核藥物，以及納米銀終濃度為0.15、0.30、0.60、1.20 μg/ml等4個劑量組進行藥物敏感性試驗。發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH值為11、濃度為0.5 mmol/L硝酸銀溶液29.9 ml與0.1 ml山楂葉水提取物混合，反應(yīng)條件為80 ℃、水浴15 min時，合成的納米銀粒徑為7 (±23%) nm，為最佳合成條件。新法合成納米銀在較低濃度下(0.30 μg/ml)即顯示出對鳥分枝桿菌和H37Rv具有抗菌活性。

銀化合物； 金屬納米粒子； 微生物敏感性試驗； 分枝桿菌，鳥； 劑量效應(yīng)關(guān)系， 藥物

鳥分枝桿菌是最主要的非結(jié)核分枝桿菌(NTM)性肺炎的致病菌，尤其常見于免疫功能低下者。其對包括利福平、異煙肼在內(nèi)的多種抗結(jié)核藥物具有天然抗藥性[1]。目前臨床針對該致病菌的治療以大環(huán)內(nèi)酯類藥物(如克拉霉素)為主，療程2年左右。因此，亟需尋找對鳥分枝桿菌具有殺菌作用的新藥物。近年來，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米材料作為一種新型抗菌材料被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域。本研究即采用新法合成納米銀材料，通過體外藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，了解新法合成的納米銀對鳥分枝桿菌的殺菌作用。

材料和方法

1.菌株和試劑：結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv，鳥分枝桿菌(ATCC25291)來源于中國疾病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實驗室；納米銀由本試驗室合成；MGIT液體培養(yǎng)管和SIRE藥敏試劑盒購自美國BD公司。改良羅氏培養(yǎng)基購自珠海貝索生物公司。山楂葉采自果園；硝酸銀為分析純，購自天津試劑一廠。

2.主要儀器：比濁儀，BACTEC MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)(美國BD公司)；恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；超聲水浴儀(德國Elma公司)；紫外可見分光光度計(日本島津UV-visible2400系列)；透射電鏡(Jeol JEM100SX)；X射線衍射儀[XRD；德國布魯克公司(D8 ADVANCE)]。

3.納米銀合成：新鮮山楂葉用雙蒸水清洗后，稱取100 g，添加250 ml雙蒸水榨汁。4 ℃保存?zhèn)溆?。分析不同pH值、山楂葉提取物添加量和硝酸銀濃度對納米銀合成的影響，找出最佳合成條件。將3 ml山楂葉提取物與27 ml濃度1 mmol/L的硝酸銀溶液混合。80 ℃水浴15 min。分別調(diào)節(jié)硝酸銀溶液的pH值為2.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0。分別取山楂葉提取物0.1 ml、0.4 ml、0.7 ml、1 ml和3 ml，加1 mmol/L 的硝酸銀溶液定容至30 ml。pH值選取上一步得出的納米銀粒徑最小時的pH值(pH值為11)。硝酸銀溶液濃度選取0.5、1.0、2.0和4.0 mmol/L。選取上步得出的納米銀粒徑最小時的山楂葉添加量(0.1 ml)和pH值(pH值為11)。用紫外可見分光光度計檢測以上試樣是否有合成納米銀。用透射電鏡觀察合成納米銀的粒徑。用X射線衍射儀對合成的納米銀進行表征。

4.液體藥敏試驗：應(yīng)用BACTEC MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)對H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株和鳥分枝桿菌進行液體藥敏試驗。使用固體培養(yǎng)基上生長小于14 d的菌種，以無菌白金耳接種環(huán)刮取菌落，移至含MGIT液體培養(yǎng)基的無菌玻璃試管中，用振蕩器充分打碎，配置成大于1.0麥?zhǔn)蠞岫鹊木骸ｌo置20 min，使大的菌團塊下沉。轉(zhuǎn)移上清液至另一無菌試管，并用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)濁度至0.5麥?zhǔn)蠞岫取Ｈ? ml上述菌液加入4 ml無菌生理鹽水(1∶5 稀釋)，混勻，即為工作濃度菌液。

取10支MGIT培養(yǎng)管，分別加入MGIT 營養(yǎng)添加劑0.8 ml。4支培養(yǎng)管分別加鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇藥物溶液100 μl(依據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)液體結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)，終濃度分別為1.0、0.1、1.0、5.0 μg/ml)。將納米銀(合成母液濃度為100 mg/L)超聲處理15 min，4支培養(yǎng)管分別加入納米銀，終濃度分別為0.15、0.30、0.60、1.20 μg/ml。此8支培養(yǎng)管標(biāo)記為含藥管。另2支培養(yǎng)管不加入藥物，標(biāo)記為對照管。取工作濃度菌液0.5 ml加入上述8支含藥管。取工作濃度菌液0.5 ml加入4.5 ml無菌生理鹽水(1∶10 稀釋)，混勻，取此稀釋菌液0.5 ml加入4.5 ml無菌生理鹽水(1∶100稀釋)，混勻。取上述稀釋后菌液(1∶100稀釋)0.5 ml加入對照管。將10支MGIT培養(yǎng)管放入液體藥敏試管架，并按放管程序放入BACTEC MGIT 960 儀器。在4～13 d內(nèi)，MGIT 960系統(tǒng)將自動報告藥敏試驗結(jié)果。按上述方法重復(fù)進行鳥分枝桿菌對納米銀的藥物敏感性試驗2次。

結(jié) 果

1.納米銀合成試驗結(jié)果：紫外可見分光光度法對反應(yīng)后的溶液通過表征，紫外可見吸收光譜的吸收峰值介于400～434 nm，合成納米銀粒徑介于7 (±23%)～27 (±22%) nm之間，透射電鏡照片顯示所有合成的納米銀粒子為近似球形(圖1)。隨pH值增加吸收峰變得尖而窄，合成納米銀的粒徑減小。隨著山楂葉提取物添加量的增加，吸收峰值向長波長遷移且峰變寬，納米銀顆粒粒徑變大。隨著硝酸銀濃度增加，吸收峰增高并且向長波長移動，納米銀顆粒粒徑變大。圖1顯示在pH為11和pH為3條件下合成納米銀的粒徑。

當(dāng)pH值為11，濃度為0.5 mmol/L的硝酸銀溶液29.9 ml 與0.1 ml山楂葉水提取物混合，反應(yīng)條件為80 ℃，水浴15 min時，合成的納米銀粒徑為7 (±23%) nm，為最佳合成條件。

選取以上最佳條件合成的納米銀靜置3個月，期間連續(xù)觀察納米銀粒子的紫外可見吸收峰，發(fā)現(xiàn)其吸收峰值均在402 nm處，期間無明顯變化。說明合成的納米銀粒子具有很好的穩(wěn)定性。合成納米銀的X射線衍射圖譜峰位置與粉末衍射標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合委員會物質(zhì)X射線衍射數(shù)據(jù)卡(JCPDS卡)上數(shù)據(jù)一致(JCPDS NO14-0781)，特征值見圖2。圖中出現(xiàn)4個明顯的峰值，說明納米銀晶體有4個晶面，衍射圖譜由4個不同半徑的同心圓環(huán)組成，對應(yīng)的晶面指數(shù)由里到外依次為(111)、(200)、(220)、(311)。

圖2 納米銀的X射線衍射圖譜

2.液體藥敏試驗結(jié)果：結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv只對納米銀濃度0.15 μg/ml耐藥，在0.30 μg/ml、0.60 μg/ml和1.20 μg/ml濃度下均敏感。鳥分枝桿菌對異煙肼、利福平、乙胺丁醇耐藥，對鏈霉素敏感，只對納米銀濃度為0.15 μg/ml 時耐藥，納米銀濃度為0.30、0.60和1.20 μg/ml時均敏感，見表1。鳥分枝桿菌對納米銀的藥敏試驗重復(fù)2次，試驗結(jié)果一致，與上述結(jié)果相同。

表1 結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和鳥分枝桿菌液體藥敏試驗結(jié)果

注 S：敏感，此劑量下MIGT 960系統(tǒng)未報告細(xì)菌生長；R：耐藥，此劑量下MIGT 960系統(tǒng)報告細(xì)菌生長

討 論

1990、2000年和2010年3次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查資料顯示，我國的NTM分離率分別為4.9%，11.1%和22.9%，呈明顯上升趨勢[2]。鳥分枝桿菌是最常見的NTM，細(xì)菌呈抗酸性，菌落形態(tài)多樣，需要進行細(xì)菌菌種鑒定才能確定。鳥分枝桿菌培養(yǎng)生長緩慢，故選取其作為本次試驗代表NTM進行液體藥敏試驗分析。鳥分枝桿菌對包括利福平、異煙肼在內(nèi)的多種抗結(jié)核藥物具有天然抗藥性。

納米材料在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[3]，含納米銀抗菌紗布用于治療燒傷，可快速殺滅各類細(xì)菌且效果持久[4]。納米銀系列抗菌劑具有高效抗菌性和廣譜性，不易產(chǎn)生抗藥性和效用持久等優(yōu)點。納米銀合成的方法很多，其中氧化還原法是目前最常用的納米銀合成方法[5]。納米銀合成中常使用肼、硼氫化鈉、二甲基甲酰胺等還原劑和有機溶劑，這些化合物毒性強，污染嚴(yán)重，對環(huán)境和生物具有潛在危害。而銀杏葉等天然材料制備納米銀方法簡單，無污染[6]。本研究采用山楂葉合成納米銀，山楂葉中含大量黃酮、多酚化合物，是很好的還原劑[7]，用于納米銀的合成有利于降低生物毒性，對于納米銀在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用具有很好的前景。

本研究中pH值為2的條件下沒有納米銀合成，可能是因為在這樣的強酸條件下，抑制了山楂葉提取物中還原基團的活性。在高pH值下，納米銀粒子的形態(tài)更規(guī)則、更分散，不容易團聚。這可能是由于隨著反應(yīng)溶液pH值的升高，參與還原反應(yīng)的官能團去質(zhì)子化能力增強，可以攜帶更多負(fù)電荷，把Ag+還原為單質(zhì)Ag。此外，其穩(wěn)定性可能與靜電排斥作用使納米銀顆粒更分散不易團聚有關(guān)[8]。本研究中納米銀粒徑隨著提取物添加量的增加而增大，可能由于較多的還原基團聚集在形成的原子核表面，這使得銀原子核表面的銀離子繼續(xù)被還原，導(dǎo)致納米銀形成大粒徑粒子。另外，太多的還原物質(zhì)可以加強形成納米粒子間的橋聯(lián)效應(yīng)，這導(dǎo)致了納米粒子的團聚。所以，為合成小粒徑的納米銀，應(yīng)選取最低山楂葉提取物添加量。這與Song等[6]研究木蘭葉提取物合成納米銀的結(jié)論一致。本研究顯示，隨硝酸銀濃度增高納米銀的粒徑增加，這可能由于太多的納米銀離子會富集在合成的原子核表面，在其表面發(fā)生二次還原反應(yīng)，合成新的原子核，從而導(dǎo)致了大粒徑納米銀的形成。

不同方法和條件合成納米銀的形狀、粒徑和性質(zhì)不同，不同粒徑和形狀的納米銀抗菌效果不同。Seth等[9]研究顯示，牛血清白蛋白納米銀(BSA-Agnano)復(fù)合物穩(wěn)定性高于、生物毒性低于聚乙烯吡咯烷酮-納米銀(PVP-Agnano)，但其殺滅臨床分離結(jié)核分枝桿菌和H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的有效濃度為8 μg/ml。Banu和Rathod[10]對10株臨床分離的耐多藥和廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌，以及非結(jié)核分枝桿菌研究顯示，納米銀的最低抑菌濃度為6.25～12.5 μg/ml。以上兩結(jié)果最低抑菌濃度均高于本研究，可能與納米銀合成方法不同、粒徑不同及有無結(jié)合物有關(guān)。有研究顯示，納米銀的抗菌作用具有形狀依賴性，Pal等[11]對不同形狀的納米銀對大腸桿菌的抗菌性研究結(jié)果顯示，三角形納米銀在銀含量為0.01 μg/ml時即顯示出明顯的細(xì)菌抑制作用，而圓形和桿狀納米銀起細(xì)菌抑制作用的銀含量分別達(dá)到0.125 μg/ml和0.5～1.0 μg/ml 之間。納米銀的抗菌性能還具有尺寸依賴性，粒徑小于5 nm的納米銀對大腸埃希菌表現(xiàn)出了更好的抗菌能力。當(dāng)納米銀濃度為75 μg/ml時，大腸埃希菌沒有明顯的細(xì)菌生長，表明納米銀的抗菌性能還具有濃度依賴性[12]。本研究以農(nóng)業(yè)廢料山楂葉為原料，降低納米銀合成的成本。采用新的方法合成納米銀顆粒，形狀為圓形顆粒，粒徑在7～27 nm范圍。目前，納米銀對NTM抗菌活性的研究較少。本研究采用新法合成納米銀對NTM和結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株進行耐藥分析，低于0.30 μg/ml 濃度對鳥分枝桿菌和H37Rv均不具有殺菌作用，而高于0.30 μg/ml對二者均具有抗菌活性，表明納米銀對分枝桿菌的抗菌活性具有劑量依賴性，這與此前Morones等[12]對納米銀對大腸埃希菌抗菌作用的研究結(jié)果相一致。

本研究采用體外藥敏試驗，研究新法合成納米銀對鳥分枝桿菌的殺菌作用。結(jié)果表明，鳥分枝桿菌對鏈霉素敏感，對異煙肼、利福平、乙胺丁醇耐藥。而納米銀在較低濃度下即顯示出對鳥分枝桿菌具有殺菌作用。同時，納米銀均有良好的穩(wěn)定性，在多次重復(fù)試驗中均顯示其具有殺菌特性。本研究證實了新法合成納米銀對鳥分枝桿菌的殺菌作用，為開發(fā)治療鳥分枝桿菌感染藥物提供了新的思路。

目前，研究顯示醫(yī)院感染中NTM常見，尤其是手術(shù)傷口不愈合情況中的醫(yī)院感染中，NTM是常見菌種[13-14]。NTM感染全身用藥時間長、不良反應(yīng)明顯。在前期研究基礎(chǔ)上有必要開展其他NTM的體外殺菌作用研究，將納米銀用于體外創(chuàng)面?zhèn)谔幚?，提高殺菌效果、促進愈合有積極意義。但對于納米銀對人體毒性效應(yīng)研究也顯示吸入納米銀可引起肺部損害[15]，經(jīng)口或者經(jīng)靜脈給予納米銀可以引起胃腸道、心血管、肝臟及神經(jīng)系統(tǒng)的損傷[16-19],但損傷的發(fā)生與納米銀的濃度及暴露時間有關(guān)。目前納米銀材料廣泛應(yīng)用于治療控制皮膚感染，但其真皮毒性仍存在爭議[20-22]，本研究采用體外實驗發(fā)現(xiàn)納米銀對鳥分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌H37Rv具有抗菌活性，對于臨床應(yīng)用治療皮膚結(jié)核和NTM感染仍需要進行動物實驗及臨床實驗進行深入研究。

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(本文編輯：李敬文)

Study on the effect of new method of synthesis of silver nanoparticles onMycobacteriumavium

WANGChun-hua*,LIWei-hong,ZHAOHui,MUCheng,SUNRui.

*TuberculosisReferenceLaboratory,TianjinCenterforTuberculosisControl,Tianjin300041,China

Correspondingauthor:LIWei-hong,Email:lhy040528@163.com

Silver nanoparticles were successfully synthesized from aqueous silver nitrate through a simple green route using the extract of hawthorn leaves as a reducing as well as capping agent. BACTEC MGIT 960 culture systems was used to evaluate the antibacterial activity of silver nanoparticles onMycobacteriumavium(ATCC25291) and H37Rv for streptomycin,isoniazid, rifampicin and ethambutol with the final concentration of silver nanoparticles at 0.15 μg/ml,0.30 μg/ml, 0.60 μg/ml and 1.20 g/ml. The best reaction conditions were pH 11.0, 0.1 ml of the extract, silver nitrate concentration 0.5 mmol/L, incubation temperature at 80 ℃ and duration time was 15 min, the diameter of silver nanoparticles was 7 (±23%) nm. When the concentration of silver nanoparticles was at 0.30 μg/ml, there were antibacterial activity in bothMycobacteriumaviumand H37Rv.

Silver compounds; Metal nanoparticles; Microbial sensitivity tests;Mycobacteriumavium; Dose-response relationship, drug

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.09.024

300041 天津市結(jié)核病控制中心參比室(王春花、趙慧、穆成、孫蕊)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)院(李維宏)

李維宏，Email:lhy040528@163.com

2017-02-13)

注：王春花與李維宏對本研究有同等貢獻，為并列第一作者