聚酰胺樹脂分離純化神香草提取液工藝研究

毛艷 賀金華 王新堂 戎曉娟

摘要：目的 考察聚酰胺樹脂分離純化神香草提取液的最佳工藝條件。方法 以總黃酮和迷迭香酸為檢測指標，采用單因素考察法篩選樹脂純化工藝中的最大上樣量、水洗脫體積、洗脫劑用量、上樣液濃度、樹脂吸附時間、上樣液pH值和洗脫速率等參數(shù)。結(jié)果 最佳純化工藝參數(shù)為：神香草提取液濃度為10 mg/mL，最大上樣量為12 mL，水洗脫2 BV去除雜質(zhì)，40%乙醇洗脫9 BV，上樣液迷迭香酸濃度86.3 μg/mL、總黃酮濃度117.8 μg/mL左右，樹脂吸附時間為14 h，上樣液pH值調(diào)至6.5，洗脫速度3.0 BV/h。結(jié)論 該方法簡便易行，分離效果良好，適用于神香草提取液的分離純化。

關(guān)鍵詞：神香草；聚酰胺樹脂；總黃酮；迷迭香酸；純化工藝

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）09-

Research on Separation and Purification of Extract from Hyssopus cuspidatus Boriss. with Polyamide Resins MAO Yan， HE Jin-hua， WANG Xin-tang， RONG Xiao-juan （Xinjiang Institute of Materia Medica， Urumqi 830004， China）

Abstract： Objective To investigate the optimal process conditions for the separation and purification of extract from Hyssopus cuspidatus Boriss. by polyamide resins. Methods The total flavonoids and rosmarinic acid were used as the indexes. The maximum amount of sample solution， elution volume， concentration of sample solution， adsorption time of resin， loading time of sample solution and the amount of eluting solvent， pH and elution rate in the resin purification process were screened by single factor method. Results The optimal purification parameters were as follows： 10 mg/mL of extract， 12 mL of sample amount， 2 BV of water to remove impurities， 40% ethanol to elute 9 BV； the concentration of rosmarinic acid in sample solution was 86.3 μg/mL， and the total flavonoid concentration was 117.8 μg/mL； the resin adsorption time was 14 h； the pH of sample solution was 6.5； the elution rate was 3.0 BV/h. Conclusion This method is simple and feasible， fit for separating and purifying of extract from Hyssopus cuspidatus Boriss.

Key words： Hyssopus cuspidatus Boriss.； polyamide resins； total flavonoid； rosmarinic acid； purification process

神香草為唇形科植物硬尖神香草Hyssopus cuspidatus Boriss.的干燥地上部分，維吾爾名為“祖發(fā)奇尼”，是維吾爾族民間習用藥材[1]，性質(zhì)干熱，有很強的香味，具有鎮(zhèn)咳、袪痰、平喘作用，作為維吾爾醫(yī)和民間用藥已有幾百年歷史，療效顯著。以神香草為主藥的寒喘祖帕顆粒收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·維吾爾藥分冊》1999年版，在新疆維吾爾醫(yī)院臨床用于治療哮喘具有很好的療效。

神香草含有黃酮類、多糖及苷、酚酸類、甾醇類、萜類化合物以及醛類、脂類、有機酸[2-4]等。近年來，隨著分離純化技術(shù)的進步，對神香草的化學成分有了

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)科技計劃項目（201417107）

通訊作者：賀金華，E-mail：hejh1216@163.com

新的認識。趙軍等[5]報道，神香草中含有大量黃酮類化合物，具有抗炎、抗過敏及抑制細菌的作用。迷迭香酸是神香草藥材中質(zhì)量分數(shù)較高的成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗血栓和抑制透明質(zhì)酸酶等多種生物活性[6]。

本課題前期神香草抗哮喘有效部位譜效學實驗顯示，神香草具有很好的抗哮喘作用，且初步確定了其活性有效部位[7]。目前尚未見采用聚酰胺吸附樹脂處理、純化神香草抗哮喘有效部位的報道。因此，本試驗以迷迭香酸和總黃酮含量為指標，研究神香草抗哮喘有效部位的聚酰胺分離純化工藝，優(yōu)選最佳工藝參數(shù)，為神香草抗哮喘有效部位純化的中試和工業(yè)化大生產(chǎn)提供可靠依據(jù)，也為神香草的制劑研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

UltiMate 3000系列高效液相色譜儀（包括二極管陣列檢測器、四元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、4～40 ℃恒溫箱），美國Thermo Scientific Technologies公司；UV-2501PC型紫外分光光度計，日本島津；DT500A型電子計數(shù)天平，常熟市金羊砝碼儀器有限公司金羊天平儀器廠；DZF-6050型真空干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；BP211D型電子天平，德國Sartorius；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

迷迭香酸對照品（批號111871-201203，純度98.6%）、蘆丁（批號110885-200102）、木犀草素（批號111520-200504），中國食品藥品檢定研究院；三裂鼠尾草素（批號MUST-15052611，純度99.17%），成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇和乙腈為色譜純（Fisher），其他試劑均為分析純。

野生神香草藥材于2014年8月采自新疆阿爾泰地區(qū)，由本所何江副研究員鑒定為唇形科植物硬尖神香草Hyssopus cuspidatus Boriss.的干燥地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標性成分檢測方法

2.1.1 紫外分光光度法測定總黃酮

2.1.1.1 對照品溶液的制備 取120 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含195.4 ?g的溶液，即得。

2.1.1.2 線性關(guān)系 精密吸取蘆丁對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL置25 mL量瓶中[8]，加無水乙醇至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加無水乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，立即照紫外-可見分光光度法[2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）附錄0401]，在500 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程：Y=0.013 4X-0.006 3，r=0.999。結(jié)果表明，總黃酮在11.72～46.90 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 HPLC測定迷迭香酸

2.1.2.1 對照品溶液的制備 取迷迭香酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含191.3 ?g的溶液，即得。

2.1.2.2 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為乙腈-0.1%甲酸（23∶77），檢測波長為330 nm，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃。

2.1.2.3 標準曲線 精密吸取迷迭香酸對照品溶液0.15、0.5、1、2、4、6 mL置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。分別精密吸取上述溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以迷迭香酸濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y=0.370 5X-0.079 3，r=1。結(jié)果表明，迷迭香酸在2.87～114.78 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。色譜圖見圖1。

2.2 聚酰胺樹脂分離純化工藝

2.2.1 聚酰胺樹脂預(yù)處理 將聚酰胺樹脂置于圓底燒瓶中，用95%乙醇加熱回流提取3次，每次1 h，然后將樹脂倒出并抽濾，在吸附柱內(nèi)加入相當于裝填樹脂體積0.4～0.5倍乙醇，然后將聚酰胺樹脂投入吸附柱中，使其液面至高于樹脂約0.3 cm處，然后用2 BV/h乙醇淋洗樹脂（應(yīng)將樹脂中的氣體排出），并用蒸餾水以同樣流速洗凈乙醇，直到流出液沒有醇味，備用。

2.2.2 上柱藥液的制備 取神香草藥材粗粉適量，加入16倍量50%乙醇，提取3次，每次1 h，提取液濃縮至無醇味，然后加入適量的蒸餾水，攪拌均勻，過濾，制成適宜質(zhì)量濃度的神香草提取液（含原藥材48 mg/mL，其中迷迭香酸濃度9.13 μg/mL、總黃酮濃度117.8 μg/mL）后備用。

2.2.3 最大上樣量考察 取處理好的聚酰胺樹脂3 g于1.5 cm×30 cm層析柱內(nèi)，精密吸取上樣液，以1 BV/h流速進行動態(tài)吸附，分段收集流出液，每4 mL收集1份，收集6份后，每8 mL收集1份，用水定容至10 mL容量瓶中，共收集19份。每份流出液依法測定迷迭香酸和總黃酮含量，繪制泄漏曲線，見圖2?？梢?，第4份收集樣即第16 mL時，總黃酮開始明顯泄漏（總黃酮泄漏率6.39%），故確定最大上樣體積為12 mL上樣液。

2.2.4 水洗脫體積及洗脫終點考察 課題組前期進行的神香草抗哮喘有效部位譜效學研究結(jié)果顯示，40%乙醇洗脫部位抗哮喘效果最好，所以本試驗進一步考察水洗脫柱體積和洗脫終點。

取處理好的聚酰胺樹脂3 g，濕法裝柱后上樣12 mL，以1 BV/h流速進行動態(tài)吸附，先后用2 BV水、3 BV 20%乙醇、5 BV 40%乙醇、5 BV 60%乙醇洗脫，每1 BV為1份樣品，分別計算各BV的吸附率和解吸率。吸附率（%）=（C0V0-C1Vl）/C0V0×100%，解吸率（%）=C2V2/（C0V0-C1Vl）×100%。C0為神香草提取液中指標成分的質(zhì)量濃度，V0為神香草提取液體積，C1為殘液中指標成分的質(zhì)量濃度，V1為殘液體積，C2為洗脫液中指標成分的質(zhì)量濃度，V2為洗脫液體積。結(jié)果見表1。

由表1可知，目標洗脫部位40%乙醇洗脫液中，迷迭香酸的吸附率=100%、解吸率<50%，還需繼續(xù)考察40%乙醇洗脫體積；水洗脫液中含有大量總黃酮，隨著水用量的增加，總黃酮損失率逐漸增加，綜合考慮，確定水用量為2 BV。

2.2.5 40%乙醇洗脫柱體積考察 取處理好的聚酰胺樹脂3 g，濕法裝柱后上樣12 mL，以1 BV/h流速進行動態(tài)吸附，依次用2 BV水、3 BV 20%乙醇、11 BV 40%乙醇洗脫，分段收集流出液，每1 BV為一流份，依法檢測樣品中迷迭香酸、總黃酮的吸附率和解吸率，結(jié)果見表2。

由表2可知，40%乙醇洗脫部位中迷迭香酸和總黃酮主要集中在前7個柱體積中，綜合時間因素和生產(chǎn)成本，最終決定收集9個洗脫柱體積。

2.2.6 上樣液濃度考察 取經(jīng)預(yù)處理好的聚酰胺樹脂3 g，平行取5份，濕法裝柱。取上樣液12 mL，其中后4份分別加入一定量的蒸餾水，稀釋至質(zhì)量濃度分別為16、20、24、32 mL，以1 BV/h吸附流速加于層析柱上，先用2 BV水洗脫后，再用3 BV 20%乙醇和9 BV 70%乙醇洗脫，分段收集流出液，每1 BV為一流份，依法檢測樣品中迷迭香酸和總黃酮的解吸率，結(jié)果見圖3。綜合考慮迷迭香酸和總黃酮的解吸率結(jié)果，最終選定上樣液12 mL，即迷迭香酸濃度為86.3 μg/mL、總黃酮濃度為117.8 μg/mL。

2.2.7 吸附時間考察 取處理好的聚酰胺樹脂3 g，平行4份，濕法裝柱后上樣12 mL，分別考察吸附時間0、2、4、14 h對迷迭香酸和總黃酮解吸率的影響，上樣量及洗脫量按前述確定，其余條件同前，結(jié)果見圖4。可見，上樣液吸附14 h，迷迭香酸和總黃酮解吸率均較高。

2.2.8 上樣液pH值考察 取處理好的聚酰胺樹脂3 g（柱體積19 mL）于1.5 cm×30 cm層析柱內(nèi)，平行5份，上樣液用1 mol/L鹽酸和1 mol/L NaOH溶液分別調(diào)至pH值為3、4.5、5.5、6.5、8，上樣12 mL，靜置過夜后，分別考察洗脫液對迷迭香酸、總黃酮解吸率的影響，上樣量及洗脫量按前述確定，其余條件同前，結(jié)果見圖5?？梢?，總黃酮解吸率在pH=3時最高，但迷迭香酸完全未解吸，當上樣液調(diào)pH=6.5時迷迭香酸和總黃酮解吸率均較高。

2.2.9 洗脫速率考察 取處理好的聚酰胺樹脂3 g，平行4份，濕法裝柱，上樣液用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 6.5，上樣12 mL，靜置過夜后，分別考察洗脫速度為1、2、3、4 BV/h對迷迭香酸、總黃酮解吸率的影響，上樣量及洗脫量按前述確定，其余條件同前，結(jié)果見圖6?？梢?，隨著流速的升高，迷迭香酸和總黃酮的解吸率逐漸降低，綜合考慮時間和經(jīng)濟成本，最終決定選用洗脫流速為3 BV/h。

2.2.10 驗證試驗 取經(jīng)處理好的聚酰胺樹脂3 g，平行3份，濕法裝柱，取質(zhì)量濃度為10 mg/mL的神香草提取液12 mL上柱，按上述純化工藝進行3次驗證試驗，收集40%乙醇洗脫液，按“2.1.1”和“2.1.2”項下方法測定40%乙醇洗脫液中迷迭香酸和總黃酮含量并計算。結(jié)果迷迭香酸的解吸率分別為72.23%、69.84%、71.17%，平均為71.08%；總黃酮的解吸率為97.89%、98.99%、97.56%，平均為98.15%。表明該純化工藝重復(fù)性良好，所選工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

聚酰胺分子中含有豐富的酰胺基，可與多酚類化合物的酚羥基形成氫鍵結(jié)合而被吸附，化合物分子中酚羥基數(shù)目越多吸附力越強；黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中的羥基和糖苷鍵等極性基團，易于與聚酰胺形成氫鍵而被吸附[9]，且聚酰胺樹脂顆粒具有再生性好、選擇性高、操作簡便、解吸速度快的特點。因此，我們選擇聚酰胺吸附樹脂進行神香草中的黃酮類和酚類化合物的分離。

本課題組前期采用體外細胞培養(yǎng)技術(shù)檢測神香草不同極性提取物和純化物的體外抗炎活性，初步將HPLC指紋圖譜和體外藥效實驗結(jié)果相結(jié)合，采用灰色關(guān)聯(lián)度統(tǒng)計分析方法對譜效關(guān)系進行了研究，考察神香草不同極性提取物和純化物HPLC指紋圖譜特征峰對體外炎癥因子和抗腫瘤壞死因子抑制作用的相關(guān)性，通過“譜效”關(guān)系研究闡明神香草抗炎作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，進一步得到神香草抗哮喘有效部位，為后期深度開發(fā)和利用神香草提供理論依據(jù)[7]。

本試驗結(jié)果表明，最佳純化工藝參數(shù)為：聚酰胺樹脂分離純化，上樣液中迷迭香酸濃度為86.3 ?g/mL、總黃酮濃度為117.8 ?g/mL左右，上樣液調(diào)pH值至6.5，吸附時間為14 h，吸附速度為1.0 BV/h，洗脫速度為3.0 BV/h，水洗脫2 BV去除雜質(zhì)，20%乙醇洗脫3 BV，40%乙醇洗脫9 BV。40%乙醇洗脫液蒸干后測定干浸膏質(zhì)量，其中總黃酮和迷迭香酸的質(zhì)量分數(shù)分別達到35.1%和3.7%以上。該工藝操作簡單、重復(fù)性好，可作為分離純化神香草提取液的有效方法，對后期研究依從性較好的神香草新制劑工藝有一定的應(yīng)用價值。

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（收稿日期：2017-02-13）

（修回日期：2017-03-20；編輯：陳靜）