纖溶酶注射液對(duì)糖尿病腎病大鼠的治療作用及機(jī)制研究

孟凡彩　李海靜　趙振瑩

【摘要】 目的 探討纖溶酶注射液（FI）對(duì)鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的大鼠糖尿病腎病（DN）的治療作用及機(jī)制。方法 40只SD大鼠， 隨機(jī)分成正常對(duì)照組（NC組， 10只）和研究組（30只）。研究組采用STZ注射誘導(dǎo)大鼠模型成功20只， 隨機(jī)分為DN組和DN+FI組， 各10只。DN+FI組大鼠用FI每日尾靜脈注射， 對(duì)DN組大鼠進(jìn)行連續(xù)8周治療。每日觀察各組大鼠的一般狀況， 計(jì)算腎臟臟器系數(shù)， 光鏡檢查腎組織形態(tài)改變， 生化法檢測(cè)尿蛋白（UP）量、血清超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的活性， 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)腎皮質(zhì)組織中纖溶酶原活化抑制因子-1 （PAI-1）蛋白的表達(dá)量。結(jié)果 經(jīng)FI治療后， DN組大鼠的一般狀況逐漸接近正常， 腎臟臟器系數(shù)降低， UP量減少， 腎組織病理變化明顯改善， 與NC組比較， DN組大鼠血清的SOD、CAT活性明顯降低， UP含量明顯增加， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而與DN組大鼠比較， DN+FI組大鼠的SOD、CAT活性顯著提高， UP含量明顯降低， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 FI對(duì)STZ誘導(dǎo)的DN大鼠腎臟具有明顯的保護(hù)作用， 其機(jī)制可能與其提高機(jī)體抗氧化能力、降低腎組織PAI-1蛋白表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 纖溶酶注射液；糖尿病腎病；大鼠；超氧化物歧化酶；過氧化氫酶；纖溶酶原活化抑制因子-1

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.20.107

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy， DN）是糖尿?。╠iabe?tesmellitus， DM）最主要的微血管并發(fā)癥， 也是導(dǎo)致慢性腎衰竭的主要原因之一。DM病程10年以上者約50%并發(fā)DN。每年新增終末腎病中， DN所占比例逐年升高[1]。DN早期的主要病理特征是腎小球肥大， 腎小球和腎小管基底膜增厚、系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)的進(jìn)行性積聚以及微血栓的形成。后期為腎小球、腎小管間質(zhì)的纖維化， 最終導(dǎo)致蛋白尿和腎功能衰竭。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致DM慢性并發(fā)癥的最根本原因之一[2]。由于DN患者體內(nèi)糖代謝紊亂， 持續(xù)清除活性氧簇（reactive oxygen species， ROS）的抗氧化酶如超氧化物歧化酶（superoxide dismutas， SOD）、過氧化氫酶（catalase， CAT）等含量明顯降低， 導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平增高， 最終損傷腎組織[3]。凝血和纖溶系統(tǒng)的紊亂也是DN發(fā)生的一種重要機(jī)制。DN患者體內(nèi)血液普遍存在的高凝狀態(tài)和血管病變與纖溶酶原活化抑制因子-1 （plasminogen activator inhibitor-1， PAI-1）的高表達(dá)高度相關(guān)[4]， 這提示PAI-1的表達(dá)增多在DN發(fā)生中發(fā)揮重要作用。對(duì)DN患者進(jìn)行早期干預(yù)治療具有重要的臨床意義。改善腎微循環(huán)是對(duì)DN患者早期干預(yù)治療的一個(gè)重要方面[5]。纖溶酶注射液（fibrinogenase injection， FI）內(nèi)含纖維蛋白溶解酶， 能夠降低血小板聚集及血液粘度， 改善微循環(huán)。纖溶酶注射液常用于治療心血管疾病如動(dòng)脈硬化性腦病、腦梗死、下肢深靜脈血栓等具有較好的療效[6]。然而， FI用于早期干預(yù)治療DN還未有報(bào)導(dǎo)。鑒于此， 本文誘導(dǎo)了DN大鼠來研究FI對(duì)DN大鼠的治療效果， 并探討可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取清潔級(jí)雄性SD大鼠40只， 8周齡， 體重180～220 g， 購自臨沂市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物單籠飼養(yǎng)， 自由攝食、飲水， 飼養(yǎng)室溫度保持在（22±2）℃， 自然光照， 適應(yīng)3 d后用于實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分成正常對(duì)照組（NC組， 10只）和研究組（30只）。

1. 2 試劑 鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）、SOD、CAT檢測(cè)試劑盒均購自Sigma 公司（St. Louis， MO， USA）；尿蛋白（urine protein， UP）考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司；FI購自北京賽升藥業(yè)股份有限公司；PAI-1小鼠單克隆抗體（C-9）、兔抗鼠IgG-HRP單克隆抗體均購自Santa Cruz 公司（Santa Cruz， CA， USA）。

1. 3 試驗(yàn)方法 研究組大鼠禁食12 h后一次性腹腔注射STZ 50 mg/kg（溶于0.1 mol/L， pH=4.2的無菌枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液中， 終濃度為1%， 現(xiàn)配現(xiàn)用）， 注射72 h后連續(xù)3 d大鼠尾靜脈采血檢測(cè)血糖。以連續(xù)3次血糖濃度>16.7 mmol/L， 尿量>原尿量150%， UP排泄>30 mg/24 h尿者為成模標(biāo)準(zhǔn)。最終， 建模成功的大鼠20只， 成功率67%。NC組大鼠給予等量緩沖液注射。研究組大鼠隨機(jī)分為DN組和DN+FI組， 各10只。

1. 4 動(dòng)物給藥及樣品收集 DN+FI組大鼠采用尾靜脈注射2 U/kg的FI（溶于生理鹽水， 1 U/ml）， 連續(xù)給藥8周， NC組和DN組給予等量的生理鹽水。各組實(shí)驗(yàn)大鼠于8周后處死， 處死前1 d代謝籠收集24 h尿液， 記錄尿量， 麻醉后， 稱重、頸動(dòng)脈取血， 分離血清。尿液、血清置于﹣80℃冰箱保存， 用于檢測(cè)生化指標(biāo)。同時(shí)分離腎臟， 用濾紙吸干后稱重， 一側(cè)腎臟置﹣80℃冰箱保存供Western blotting檢測(cè)用， 部分腎臟以10%中性甲醛固定， 用于組織病理學(xué)檢查。

1. 5 組織病理學(xué)檢查 經(jīng)甲醛溶液固定的腎臟組織， 常規(guī)酒精脫水、透明、石蠟包埋后， 連續(xù)4 μm 切片， 蘇木素伊紅染色（HE）后， 在光鏡下觀察腎臟的組織形態(tài)學(xué)變化。

1. 6 生化指標(biāo)測(cè)定 檢測(cè)UP、血清SOD、CAT的含量， 均按試劑盒的說明書操作。血糖濃度用強(qiáng)生血糖儀測(cè)定。

1. 7 蛋白質(zhì)印跡法 腎皮質(zhì)組織經(jīng)充分勻漿， 離心后取上清作為蛋白提取物。等量的蛋白 （50 μg） 在加入上樣緩沖液充分混勻后， 沸水浴煮5 min， 瞬時(shí)離心后進(jìn)行 SDS-PAGE。電泳后的蛋白用恒流濕法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。蛋白膜經(jīng)封阻、洗滌后與PAI-1一抗在4℃孵育雜交過夜。洗膜后加入IgG-HRP二抗， 在室溫下孵育雜交2 h。蛋白膜洗滌后， 在膜的蛋白面滴加等比例混合 ECL 檢測(cè)液 A 和 B， 用 Bio-Rad ChemiDocXRS （Hercules， CA， USA） 曝光， 截獲圖像。endprint

1. 8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 一般狀況 DN組注射STZ誘導(dǎo)DM后， 進(jìn)食量在病變初期增加， 病變后期食量減少、尿頻且量多、體重減輕、生長(zhǎng)緩慢、毛發(fā)枯槁發(fā)黃等狀況。而NC組大鼠食量、飲水、尿量及精神狀態(tài)基本正常。經(jīng)FI治療后， DN+FI組大鼠的飲水、食量、尿量、體重、毛發(fā)均逐漸接近正常。

2. 2 臟器系數(shù) 與NC組大鼠比較， DN組大鼠其臟器系數(shù)顯著增加， 經(jīng)DN+FI組大鼠臟器系數(shù)明顯降低。

2. 3 腎組織病理變化 病理組織學(xué)檢查顯示， DN組大鼠腎小球充血水腫明顯， 體積增大， 腎小管上皮細(xì)胞變性壞死脫落， 基底膜破壞， 部分結(jié)構(gòu)不清。DN+FI組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)明顯改善， 只表現(xiàn)為輕微的充血， 管腔分開， 基底膜完整， 結(jié)構(gòu)清晰， 腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)接近正常。見圖1。

2. 4 血清中SOD、CAT、UP情況 與NC組比較， DN組大鼠血清的SOD、CAT活性明顯降低， UP含量明顯增加， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而與DN組大鼠比較， DN+FI組大鼠的SOD、CAT活性顯著提高， UP含量明顯降低， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2. 5 腎皮質(zhì)組織中PAI-1蛋白表達(dá) 各實(shí)驗(yàn)組大鼠腎皮質(zhì)組織中均可檢測(cè)到PAI-1蛋白的表達(dá)。DN組大鼠腎皮質(zhì)組織中PAI-1的表達(dá)量明顯高于NC組大鼠。相對(duì)于DN組大鼠， DN+FI組其腎皮質(zhì)組織中PAI-1的表達(dá)量顯著降低。見圖2。

3 討論

DN是DM常見而嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥， 與血栓形成密切相關(guān)， 改善微循環(huán)是治療DN的一個(gè)重要方面。臨床上已經(jīng)證實(shí)FI可以改善纖溶系統(tǒng)的功能， 在治療動(dòng)脈硬化性腦病、腦梗死、下肢深靜脈血栓等疾病時(shí)獲得了較好的效果。然而， FI用于早期干預(yù)治療DN卻未見報(bào)導(dǎo)。在本研究中， 通過建立DN大鼠模型來初步探討FI對(duì)DN的治療作用及其可能的機(jī)制。

采用FI對(duì)DN大鼠模型進(jìn)行8周的治療后發(fā)現(xiàn)， DN大鼠的主要癥狀和腎臟病理改變均得到很大的改善。經(jīng)過治療后， DN大鼠的飲水、食量、尿量、體重、毛發(fā)均逐漸接近正常， 臟器系數(shù)明顯降低。病理組織學(xué)檢查顯示， 治療后DN大鼠腎組織結(jié)構(gòu)明顯改善， 只表現(xiàn)為輕微的充血， 管腔分開， 基底膜完整， 結(jié)構(gòu)清晰， 腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)接近正常。這說明FI對(duì)DN大鼠的干預(yù)治療是有效的。以往的臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)， FI治療血栓行心血管疾病效果明顯， 且不降解凝血因子、補(bǔ)體、血漿蛋白等， 出血并發(fā)癥少， 是直接作用于血栓病灶的溶栓藥物， 安全性高[7]。但FI是否真正能夠應(yīng)用于臨床上治療DN還需要嚴(yán)格的臨床實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

近年來越來越多的證據(jù)表明氧化應(yīng)激是各種途徑導(dǎo)致DN病變的共同機(jī)制。在本研究中， 用FI對(duì)DN大鼠模型進(jìn)行治療后， 其血清中抗氧化酶SOD、CAT活性顯著提高。這提示DN大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)得到明顯的改善， FI可能通過提高DN大鼠體內(nèi)的抗氧化能力的機(jī)制來保護(hù)腎臟。PAI-1主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成， 可抑制纖溶酶原的活化， 降低腎小球和腎小管間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解， 促進(jìn)組織細(xì)胞外基質(zhì)的積聚， 加速DN的發(fā)生[8-10]。本研究結(jié)果顯示， DN大鼠在經(jīng)FI治療后， 其腎皮質(zhì)組織中PAI-1的表達(dá)量顯著降低。這提示FI對(duì)DN大鼠的治療作用可能是通過抑制PAI-1的表達(dá)， 促進(jìn)纖溶酶原的活化， 從而加快腎小球和腎小管間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解的機(jī)制來實(shí)現(xiàn)。

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[收稿日期：2017-04-28]endprint