阿托伐他汀對(duì)2型糖尿病小鼠腸道菌群的影響

吳琳英+鄧順有+王毅飛

【摘要】 目的 探索阿托伐他汀作用于2型糖尿病小鼠對(duì)其腸道菌群的影響。方法 20只小鼠隨機(jī)按照1∶3分成對(duì)照組和模型組， 采用高糖高脂喂食及鏈脲佐菌素腹腔注射的15只成模模型組小鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組、阿托伐他汀組， 每組5只， 二甲雙胍組和阿托伐他汀組各分別給予20 mg/kg和4 mg/kg 20 d灌胃干預(yù)。干預(yù)后收集小鼠血清及新鮮糞便， 血清檢測(cè)隨機(jī)血糖、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）， C反應(yīng)蛋白（CRP）、內(nèi)毒素（LPS）以及應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)（qPCR）絕對(duì)定量檢測(cè)腸道菌群（腸桿菌、乳桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌、腸球菌和總菌）數(shù)量。結(jié)果 對(duì)照組與模型組的血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、體重、CRP、LPS比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)照組與二甲雙胍組的TC、TG、HDL-C、LDL-C、體重、CRP、LPS比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)照組與阿托伐他汀組的血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、體重、CRP比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。二甲雙胍組與阿托伐他汀組的血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、LPS比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組腸道總菌比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 表明各組腸道菌群總量一致。與對(duì)照組比較， 模型組2型糖尿病腸道菌群中腸桿菌、腸球菌增加， 乳桿菌、雙歧桿菌和擬桿菌減少， 且干預(yù)后具體菌屬改變主要表現(xiàn)為：二甲雙胍組和阿托伐他汀組腸桿菌和腸球菌均減少， 乳桿菌、雙歧桿菌和擬桿菌增加（P<0.05）；而二甲雙胍組較阿托伐他汀組更加能提高雙歧桿菌和擬桿菌的數(shù)量（P<0.05）， 阿托伐他汀組較二甲雙胍組更加能減少腸桿菌、腸球菌和提高乳桿菌的數(shù)量（P<0.05）。結(jié)論 阿托伐他汀可以通過(guò)減少腸桿菌和腸球菌致病菌和增加乳桿菌益生菌以及減少其代謝產(chǎn)物L(fēng)PS來(lái)調(diào)節(jié)2型糖尿病腸道菌群， 其可能是他汀降脂藥作用于2型糖尿病的機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】 2型糖尿??；阿托伐他汀；腸道菌群；炎癥

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.22.074

肥胖、身體脂肪過(guò)多等不良生活習(xí)慣是導(dǎo)致2型糖尿病的主要因素， 2型糖尿病主要表現(xiàn)為胰島素抵抗或胰島素相對(duì)不足， 胰島素參與脂質(zhì)調(diào)控。血脂高常伴隨2型糖尿病發(fā)生， 是慢性代謝綜合征疾病中的主要組成部分， 已成為威脅全世界人民健康的主要問(wèn)題。2型糖尿病常伴著高脂血癥會(huì)增加心血管及腎臟等并發(fā)癥的發(fā)生， 甚至明顯增加死亡率， 因此如何從改善高脂血癥防治2型糖尿病成為現(xiàn)在糖尿病研究領(lǐng)域的重點(diǎn)問(wèn)題[1]。目前很多研究發(fā)現(xiàn)糖尿病和肥胖的發(fā)生發(fā)展與腸道菌群密切相關(guān)， 機(jī)制可能與腸道菌群及其代謝產(chǎn)物L(fēng)PS參與了胰島素抵抗、糖尿病慢性炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)血糖血脂代謝、免疫等相關(guān)[2]。因此， 從腸道菌群角度去探索如何防治2型糖尿病已成為目前研究的熱點(diǎn)。目前最主要的降脂藥他汀類藥物能有效延緩冠狀動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管病變， 且已成為治療2型糖尿病的二線藥物。但目前并不清楚其是否能影響2型糖尿病的腸道菌群從而改善糖尿病。本研究通過(guò)使用阿托伐他汀干預(yù)2型糖尿病小鼠以探索其對(duì)2型糖尿病的腸道菌群的影響， 從而為降脂類藥物更好地用于防治2型糖尿病提供新的思路。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性昆明小鼠20只， 體重（20±2）g， 由廣東省動(dòng)物中心提供， 先在檢疫室檢疫7 d后轉(zhuǎn)入SPF級(jí)動(dòng)物房。

1. 2 主要試劑 高糖高脂小鼠飼料由廣東省動(dòng)物中心訂做（廣州）， 鏈脲佐菌素（STZ）購(gòu)于sigma公司（美國(guó)）， 鹽酸二甲雙胍片購(gòu)于中美上海施貴寶制藥公司， 阿托伐他汀片購(gòu)于輝瑞公司（美國(guó)）， TC、TG、LDL-C、HDL-C、CRP的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒購(gòu)于武漢華美生物公司， LPS檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海榕柏生物技術(shù)公司， 糞便DNA提取試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技公司， 腸道菌群qPCR試劑盒iQtm SYBR Green SuperMix（BioRad公司， 美國(guó)）， 血糖儀和血糖試紙條購(gòu)于強(qiáng)生公司（美國(guó)）。

1. 3 實(shí)驗(yàn)方法

1. 3. 1 2型糖尿病小鼠模型建立 2型糖尿病小鼠模型建立參照沈亞非等[3]的方法：20只小鼠隨機(jī)按照1∶3分成對(duì)照組和模型組。模型組每天給予高糖高脂飲食及飲水， 連續(xù)給予30 d， 且每隔2天腹腔注射無(wú)菌的1% 鏈脲佐霉素（40 mg/kg）至30 d， 斷尾取血檢測(cè)其隨機(jī)血糖≥15 mmol/L即造模成功；對(duì)照組每天給予正常飲食飲水， 且每隔2天腹腔注射等量的無(wú)菌水至30 d， 斷尾取血檢測(cè)其隨機(jī)血糖。

1. 3. 2 干預(yù)及標(biāo)本留取 15只成模模型組小鼠隨機(jī)分為三組：模型組、二甲雙胍組、阿托伐他汀組， 每組5只， 均正常飲食飲水。模型組不給予干預(yù)， 二甲雙胍組給予二甲雙胍20 mg/kg灌胃， 阿托伐他汀組給予阿托伐他汀4 mg/kg灌胃， 均干預(yù)20 d后留取小鼠新鮮糞便、血清置于-80℃低溫冰箱儲(chǔ)存。

1. 3. 3 血糖血脂及炎癥檢測(cè) 血糖采用血糖儀及試紙進(jìn)行隨機(jī)血糖檢測(cè)， 血脂指標(biāo)（TC、TG、LDL-C、HDL-C）使用血清在全自動(dòng)生化儀檢測(cè)得到， 炎癥指標(biāo)（CRP）使用血清采用ELISA法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)， LPS采用終點(diǎn)顯色鱟試劑法嚴(yán)格按照其試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1. 3. 4 腸道菌群qPCR絕對(duì)定量 各腸道菌引物參考相關(guān)文獻(xiàn)使用各菌屬通用16S rDNA進(jìn)行設(shè)計(jì)且在NCBI BLAST驗(yàn)證可用， 引物序列參考文獻(xiàn)[4]， 由華大基因公司合成引物序列及合成各細(xì)菌基因標(biāo)準(zhǔn)品。各菌標(biāo)準(zhǔn)品原液測(cè)定其DNA濃度按濃度依次10倍稀釋8個(gè)梯度待用， 各樣本糞便DNA提取嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行， 紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度及純度， 再將各樣本DNA稀釋到相同濃度備用。qPCR絕對(duì)定量采用20 μl反應(yīng)體系：樣本DNA模板/標(biāo)準(zhǔn)品DNA模板1 μl， 上、下游引物各1 μl， 滅菌蒸餾水7 μl， SYBR Green SuperMix 10 μl， 稍震蕩混勻且稍離心后進(jìn)行熒光定量PCR程序。qPCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min， 58℃15 s， 72℃30 s， 進(jìn)行40個(gè)循環(huán)， 每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次。數(shù)據(jù)由熒光PCR儀自帶軟件分析完成， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算擴(kuò)增效率E在90%～105%， 且根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程得到各樣本的拷貝數(shù)。endprint

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 血糖血脂及炎癥情況 對(duì)照組與模型組的血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、體重、CRP、LPS比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)照組與二甲雙胍組的TC、TG、HDL-C、LDL-C、體重、CRP、LPS比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)照組與阿托伐他汀組的血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、體重、CRP比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。二甲雙胍組與阿托伐他汀組的血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、LPS比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2. 2 腸道菌群變化 各組腸道總菌比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 表明各組腸道菌群總量一致。與對(duì)照組比較， 模型組2型糖尿病腸道菌群中腸桿菌、腸球菌增加， 乳桿菌、雙歧桿菌和擬桿菌減少， 且干預(yù)后具體菌屬改變主要表現(xiàn)為：二甲雙胍組和阿托伐他汀組腸桿菌和腸球菌均減少， 乳桿菌、雙歧桿菌和擬桿菌增加（P<0.05）；而二甲雙胍組較阿托伐他汀組更加能提高雙歧桿菌和擬桿菌的數(shù)量（P<0.05）， 阿托伐他汀組較二甲雙胍組更加能減少腸桿菌、腸球菌和提高乳桿菌的數(shù)量（P<0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

人體的腸道菌群包括了10～100萬(wàn)億個(gè)微生物， 1千多種不同的菌屬， 是人體所有細(xì)胞總數(shù)的10倍[5]。腸道菌群在人體的新陳代謝、營(yíng)養(yǎng)、能量、免疫等功能方面都起著非常重要的作用， 是人體最大的器官[6]。目前研究發(fā)現(xiàn)很多疾病都與腸道菌群相關(guān)[6]。2型糖尿病是目前全世界最廣泛的慢性代謝性疾病， 其發(fā)病率日益增長(zhǎng)[7]。我國(guó)2型糖尿病的發(fā)病率為11.6%， 也在迅速增加[8]。Larsen 等[9]通過(guò)使用16S rDNA測(cè)序和熒光定量PCR方法發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者腸道菌群總數(shù)不發(fā)生改變， 其多樣性發(fā)生改變， 主要是腸道益生菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量下降， 變形菌門明顯增多， 劉海霞等[10]采用qPCR檢測(cè)2型糖尿病患者糞便發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌減少， 糞腸球菌增加。作者的研究也顯示2型糖尿病腸道菌群總體不變， 會(huì)出現(xiàn)雙歧桿菌、乳桿菌的減少以及屬于變形菌門的腸桿菌、腸球菌增加相一致的結(jié)果。

近年研究發(fā)現(xiàn)， 肥胖及相關(guān)代謝性疾病如糖尿病患者血清等都存在LPS、CRP、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的升高， 慢性低度炎癥反應(yīng)一直伴隨疾病始終[11]。LPS是腸道菌群中革蘭陰性菌細(xì)胞壁成分的脂多糖， 是腸道菌群， 代謝產(chǎn)物， 其參與糖尿病等代謝疾病的腸道炎癥反應(yīng)， 且可誘導(dǎo)慢性系統(tǒng)炎癥， 從而導(dǎo)致以及加速糖尿病等代謝性疾病發(fā)生發(fā)展[12]。Cani等[13]發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌可以改善高脂肪因素的2型糖尿病小鼠胰島素抵抗情況， 且也可以降低LPS等炎癥因子， 改善腸道黏膜屏障， 可見(jiàn)腸道菌群已成為防治糖尿病的新靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)主要的降糖藥物二甲雙胍和降脂藥物阿托伐他汀均可降低糖尿病炎癥因子LPS和CRP， 且阿托伐他汀的降低LPS效果更佳。

二甲雙胍是臨床最主要廣泛的降糖藥， 為糖尿病治療的一線用藥， 其可以通過(guò)抑制肝糖原異生， 增加外周組織利用葡萄糖， 抑制腸壁細(xì)胞攝取葡萄糖， 減少胰島素抵抗， 增加胰島素敏感性， 從而降低血糖。目前研究已顯示其可以調(diào)節(jié)腸道菌群， Shin 等[14]研究發(fā)現(xiàn)， 高脂飲食喂養(yǎng)的糖尿病小鼠給予二甲雙胍治療后腸道內(nèi)粘液素降解菌Akkermansia明顯增多， 表明腸道菌群可能與二甲雙胍降糖機(jī)制相關(guān)。Forslund等[15]研究也發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對(duì)2型糖尿病患者腸道菌群有影響， 主要會(huì)顯著增加腸桿菌， intestinibacter屬顯著降低， 且不同國(guó)家2型糖尿病患者腸道菌群影響不同。本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍會(huì)減少2型糖尿病小鼠腸桿菌數(shù)量， 其可能跟種屬不同相關(guān)。阿托伐他汀是他汀類降脂藥的代表藥物， 其具有很強(qiáng)的降脂作用， 卻會(huì)產(chǎn)生血糖升高等副作用， 但是降脂也是防治糖尿病等代謝性疾病的重要環(huán)節(jié)， 且目前研究大多顯示腸道菌群與脂質(zhì)代謝緊密相關(guān)[16]。所以作者的研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可以增加益生菌乳桿菌、雙歧桿菌和擬桿菌， 減少腸桿菌及腸球菌致病菌， 且其增加乳桿菌， 減少腸桿菌和腸球菌效果明顯優(yōu)于二甲雙胍。可見(jiàn)阿托伐他汀在降脂的同時(shí)可能主要是通過(guò)調(diào)節(jié)增加乳桿菌多產(chǎn)生丁酸鹽等短鏈脂肪酸從而抑制致病菌腸桿菌和腸球菌的生長(zhǎng)， 減少其代謝產(chǎn)物L(fēng)PS的產(chǎn)生， 最終達(dá)到降低炎癥反應(yīng)的作用， 從而發(fā)揮降脂作用， 改善糖尿病。

綜上所述， 阿托伐他汀可以通過(guò)減少腸桿菌和腸球菌致病菌和增加乳桿菌益生菌以及減少其代謝產(chǎn)物L(fēng)PS來(lái)調(diào)節(jié)2型糖尿病腸道菌群， 其可能是他汀降脂藥作用于2型糖尿病的機(jī)制之一。且阿托伐他汀與二甲雙胍在對(duì)糖尿病腸道菌群影響方面各有側(cè)重點(diǎn)， 將來(lái)進(jìn)一步研究?jī)烧咴谔悄虿∧c道菌群的不同作用， 可以發(fā)揮兩種藥的協(xié)同作用， 更有利于防治2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。

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[收稿日期：2017-04-18]endprint