5例糖原貯積癥IXc型患兒臨床和PHKG2基因突變分析

周迪禹 房 迪 邱文娟 葉 軍 韓連書 張惠文 余永國 梁黎黎 顧學(xué)范

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 上海兒科醫(yī)學(xué)研究所內(nèi)分泌/遺傳室（上海 200092）

5例糖原貯積癥IXc型患兒臨床和PHKG2基因突變分析

周迪禹 房 迪 邱文娟 葉 軍 韓連書 張惠文 余永國 梁黎黎 顧學(xué)范

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 上海兒科醫(yī)學(xué)研究所內(nèi)分泌/遺傳室（上海 200092）

目的分析5例糖原貯積癥（GSD）IXc型患兒的臨床、生化及基因突變特點(diǎn)。方法回顧分析5例GSD IXc型患兒的臨床情況，并采用靶向測序技術(shù)進(jìn)行基因分析，Sanger測序驗(yàn)證所發(fā)現(xiàn)的PHKG2基因突變及其父母來源。結(jié)果

5例患兒均表現(xiàn)為明顯肝大和矮小，4例有運(yùn)動耐力差；均有空腹低血糖，肝酶中重度升高，血三酰甘油升高；肝臟超聲示無肝硬化。靶向測序發(fā)現(xiàn)5例患兒均攜帶PHKG2基因純合或復(fù)合雜合致病或可能致病突變，發(fā)現(xiàn)1種已報道突變p.E157K和5種新突變（p.E56X, p.R185X, c.79_88delinsTCTGGTCG, c.761delC, p.R279C），p.E157K為患兒的熱點(diǎn)突變（50%）。結(jié)論靶向測序有助于確診GSD IXc型，p.E157K為熱點(diǎn)突變。

糖原貯積癥IXc型； PHKG2基因； 靶向測序； 突變

糖原貯積癥（glycogen storage disease，GSD）是糖原代謝過程相關(guān)酶缺陷導(dǎo)致的一組先天性遺傳代謝病，以糖原在全身相關(guān)組織過度沉積和糖原合成或分解障礙為主要特征。GSDⅨ型由糖原磷酸化酶激酶（phosphorylase kinase，PhK）缺陷導(dǎo)致，是GSD中最常見的亞型，約占肝GSD的25%。磷酸化酶激酶可將磷酸化酶b催化轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿峄竌從而啟動肝糖原分解，PhK由α、β、γ和δ四個亞基構(gòu)成，其中α和β亞基為調(diào)節(jié)亞基，γ亞基為催化亞基，δ亞基為鈣調(diào)蛋白，α、β、γ亞基均有組織特異性的異構(gòu)體[1，2]。PHKA2基因編碼肝臟特異性PhK的α亞單位，其突變導(dǎo)致GSDⅨa型；PHKB基因編碼肝臟特異性PhK的β亞單位，突變導(dǎo)致GSDⅨb型；PHKG2基因編碼肝臟特異性PhK的γ亞單位，缺陷導(dǎo)致GSDⅨc型[3]。一般認(rèn)為GSDⅨc型臨床表現(xiàn)較重，表現(xiàn)為嚴(yán)重低血糖，多數(shù)患者后期并發(fā)肝纖維化和肝硬化[4]。迄今GSDⅨc型僅報道了20余例患者,國內(nèi)尚未見報道。GSD的致病基因眾多，部分亞型臨床表現(xiàn)相似，實(shí)驗(yàn)室檢查缺乏特異性。傳統(tǒng)的Sanger測序費(fèi)時、費(fèi)力而且價格昂貴。近年來二代測序技術(shù)具有通量高、靈敏度高、成本低、省時等優(yōu)點(diǎn)，提高了診斷效率。本研究對表現(xiàn)為肝大和低血糖的5例患兒，通過采用二代測序的靶向測序（target sequencing，TS）技術(shù)確診為GSDⅨc型，對其臨床特點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)室檢查資料進(jìn)行分析，并探討PHKG2基因的突變特點(diǎn)。

1 臨床資料

選取上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院上海兒科醫(yī)學(xué)研究所內(nèi)分泌遺傳室2010年1月至2017年1月因肝大、低血糖及肝功能異常疑診肝GSD就診的5例患兒，其分別來自5個家庭，父母均非近親婚配，男3例、女2例，就診年齡1歲5個月至3歲。收集5例患兒的臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查資料。

經(jīng)新華醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患兒家屬知情同意后，采集患兒及父母外周血各2 mL，抽提基因組DNA，使用ClearSeq Inherited Disease probe（安捷倫，Santa Clara，CA，USA）試劑盒對近2 700個常見遺傳病基因，其中包含所有GSD相關(guān)基因，進(jìn)行捕獲并擴(kuò)增，Hiseq2500高通量測序平臺測序，每個樣品產(chǎn)生至少2.5 Gb的配對末端測序數(shù)據(jù)。測序完成后利用軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，過濾后的測序數(shù)據(jù)使用BWA-0.7.10軟件與人類基因組數(shù)據(jù)庫（GRCh37/hg19）進(jìn)行比對，再使用GATK軟件實(shí)現(xiàn)對單堿基變異和插入缺失變異進(jìn)行識別與過濾，并與千人基因組、Exome Variant Server、Exome Aggregation Consortium和本科室的150個全外顯子測序的數(shù)據(jù)庫比對，用COBALT在線工具對突變位點(diǎn)進(jìn)行不同種屬間氨基酸序列的同源性比對，用SIFT、PolyPhen軟件對檢測到突變的致病性進(jìn)行預(yù)測，對檢測到突變的臨床意義按照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會（ACMG）遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)的指南進(jìn)行解釋[4]。對所發(fā)現(xiàn)的突變依據(jù)NCBI的PHKG2基因序列（NM _000294），用Primer 5.0 軟件設(shè)計引物，對患兒及其父母相關(guān)突變所在區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送上海生工有限公司測序。

根據(jù)臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)合基因分析結(jié)果，5例患兒診斷為GSDⅨc型。其臨床特點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果見表1?；純菏状闻R床癥狀均出現(xiàn)在嬰兒期（3個月～1歲），3例表現(xiàn)為腹部膨隆，1例為低血糖抽搐，1例體檢發(fā)現(xiàn)肝功能異常。首次就診的平均年齡為23個月，均有肝臟腫大及身材偏矮，平均身高位于同年齡/同性別兒童平均身高－2.05標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。5例患兒罕見低血糖表現(xiàn)，但平均空腹血糖為2.22mmol/L。肝酶水平中重度升高，超出正常范圍上限的4～20倍，血清尿酸和膽固醇水平基本在正常范圍，血清三酰甘油均升高，尿酮體均陰性。4例存在運(yùn)動耐力差和容易疲勞的表現(xiàn)，但血清肌酸激酶無升高；心臟彩超提示無心臟受累。5例患兒初次就診后開始生玉米淀粉治療，劑量為1.2～2.0 g/(kg·次)，每日2～5次，平均治療和隨訪時間為3年，治療后肝臟均有縮小，身高提高到同年齡/同性別兒童的－0.89SD。目前患兒平均年齡5歲，肝臟超聲尚未檢出肝硬化，但有2例除有肝大和肝內(nèi)回聲增強(qiáng)外伴有脾臟輕度增大。

表1 5例GSD Ⅸc型患兒臨床和實(shí)驗(yàn)室檢查特點(diǎn)

5例GSDⅨc型患兒攜帶PHKG2基因的純合或復(fù)合雜合突變，突變來源分析顯示患兒所攜帶的2個等位基因的突變均來自其父親或母親。本研究共發(fā)現(xiàn)PHKG2基因的1種已報道致病突變c.469G＞A（p.E157K）和5種新突變，新突變包含1種錯義突變、2種無義突變和2種缺失突變（表2，圖1）。c.469G＞A（p.E157K）突變?yōu)闊狳c(diǎn)突變（5/10，50%），其他突變僅見于1個等位基因。對新發(fā)現(xiàn)的c.835C＞T（p.R279C）錯義突變位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行不同種屬間的同源性分析顯示，糖原磷酸化酶激酶γ亞基蛋白的第279位氨基酸在人、褐家鼠、牛、野豬和貓5個種屬間高度保守，提示其可能為致病突變。SIFT和PolyPhen在線工具對新突變的致病性進(jìn)行預(yù)測，按照美國ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)的指南對新突變分級顯示，c.835C＞T（p.R279C）錯義突變?yōu)榭赡苤虏⊥蛔儯溆嘈峦蛔優(yōu)橹虏⌒酝蛔儯ū?）。

圖1 5例患兒中檢測到的PHKG2基因突變測序圖

2 討論

GSD的總發(fā)病率約為1:20 000～43 000，國外報道GSDⅠ、Ⅲ、Ⅸ型在GSD中所占比例約為80%，Ⅸ型最常見，約占肝GSD的25%。GSDⅨ型包含Ⅸa型、Ⅸb型和Ⅸc型， GSDⅨa型最常見，約占GSDⅨ型的75%，GSDⅨc型占Ⅸ型的10%～15%[1]。由于GSDⅨ型涉及致病基因繁多復(fù)雜，故國內(nèi)罕有GSDⅨ型臨床和遺傳學(xué)方面的研究。本研究首次對5例表現(xiàn)為肝大和低血糖的患兒通過二代測序的靶向測序技術(shù)確診為GSDⅨc型，并對這5例患兒臨床、實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)進(jìn)行分析。

與GSDⅨ型中最常見的GSDⅨa亞型的預(yù)后相對良性、青春期后自發(fā)緩解的病程不同，多數(shù)研究認(rèn)為GSDⅨc型患者臨床表現(xiàn)較重，可有明顯空腹低血糖、肝酶明顯升高,可能發(fā)展為肝纖維化或肝硬化[5-8]。迄今為止文獻(xiàn)共報道來自26個家系的28例GSDⅨc型患者，其中20例肝臟活檢或肝臟B超提示存在肝臟纖維化，9例發(fā)生肝硬化，其中1例肝硬化患者在20歲接受肝臟移植，2例病程呈現(xiàn)良性進(jìn)展[9-15]。本研究5例患兒存在明顯空腹低血糖，肝酶升高程度明顯，超過正常上限的4～20倍，但由于這5例患兒目前平均年齡僅5歲，均未行肝活檢病理檢查，肝臟B超目前尚未提示肝硬化跡象，可能與本研究所納入的患兒年齡較小有關(guān)，目前尚無法預(yù)知發(fā)生肝硬化的時間和頻度。

28例已報道的GSDⅨc型患者中7例存在肌肉癥狀，表現(xiàn)為輕到中度肌力減退或易疲勞[5,8-15]。本研究5例患兒中4例有運(yùn)動耐力差和容易疲勞的表現(xiàn)，但所有患兒的CK水平均正常。肌無力癥狀在PHKA2和PHKG2基因突變導(dǎo)致的糖原磷酸化酶激酶缺陷患者中均有報道，過去認(rèn)為這可能是糖原分解障礙后繼發(fā)性能量代謝異常所致。近期有研究表明，PHKA2和PHKG2基因很可能在肌肉組織中也有表達(dá)從而影響肌肉功能，因此建議對糖原磷酸化酶激酶缺陷患者的肌肉癥狀進(jìn)行隨訪并給予高蛋白飲食以保證肌肉組織能量需求。餐間及夜間服用生玉米淀粉可顯著改善GSDⅨc型患兒的肝大和矮小等癥狀及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。本組5例患兒治療后肝臟均有縮小，身高水平也由治療前的同年齡/同性別兒童的－2.05SD提高到平均治療3年后的－0.89SD。

本研究5例GSDⅨc型患兒中，共發(fā)現(xiàn)PHKG2基因5種新突變，包括1種錯義突變、2種無義突變、2種移碼突變。與正常人數(shù)據(jù)庫比對和突變預(yù)測軟件分析，這些新突變按照美國ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)的指南分級均為可能致病突變或致病突變。已報道的突變c.469G＞A（p.E157K）為本組的熱點(diǎn)突變（5/10，50%），其他突變均僅見于1個等位基因，該突變很可能為中國人群中GSDⅨc型的熱點(diǎn)突變。本組1例患兒為p.E157K的純合子，其臨床表現(xiàn)與其他4例無明顯差異。在28例已報道的患者中共發(fā)現(xiàn)31種突變，除3例沙特患者基因型為p.G220E純合突變外[14]，其他地區(qū)和人群的突變均較散發(fā)，基因型和表型的相關(guān)性亦不明確。

表2 5例患兒PHKG2基因的新致病突變

與GSDⅠ型相比，糖原磷酸化酶激酶缺陷患者很少發(fā)生嚴(yán)重低血糖及乳酸血癥。與早期進(jìn)展為肝硬化的GSD Ⅳ型相比，糖原磷酸化酶激酶缺陷患者肝臟形態(tài)學(xué)改變和進(jìn)展更為緩慢，因此在臨床中很難僅憑借臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查將GSDⅨc型與其他亞型進(jìn)行區(qū)分。在我們診斷的5例GSD Ⅸc型患兒中，有1例曾因肌無力臨床誤診為GSD Ⅲ型，1例臨床誤診為GSDⅣ型。肝活檢可能是監(jiān)測這些患者肝臟并發(fā)癥的重要依據(jù)，但不能用于確診。二代測序方法可以實(shí)現(xiàn)對GSD不同亞型的快速診斷，以便早期給予治療及遺傳咨詢。

綜上所述，本研究分析了5例GSDⅨc型患兒的臨床、生化及分子遺傳學(xué)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)GSDⅨc型患兒臨床表現(xiàn)較重，有明顯肝大、矮小，部分患兒有運(yùn)動不耐受，實(shí)驗(yàn)室檢查有明顯肝酶升高、空腹低血糖，經(jīng)口服生玉米淀粉治療后臨床表現(xiàn)有所改善，目前尚無1例發(fā)現(xiàn)肝硬化。本研究豐富了對中國人GSDⅨc型患兒早期臨床表現(xiàn)和分子遺傳學(xué)特點(diǎn)的認(rèn)識。

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Clinical features and PHKG2 gene mutation analysis of 5 Chinese patients with glycogen storage disease Ⅸc

ZHOU Diyu , FANG Di, QIU Wenjuan, YE Jun, HAN Lianshu, ZHANG Huiwen, YU Yongguo, LIANG Lili, GU Xuefan（Department of Pediatric Endocrinology/Genetics, Shanghai Institute of Pediatric Research, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200092, China）

ObjectiveTo investigate the clinical, laboratory and genetic features of glycogen storage disease（GSD）IXc.MethodsFive patients suspected as liver GSD were included in our study. DNA was extracted from peripheral blood of all the patients and diagnoses were made after target sequencing to nearly 2700 disease causing genes. All detected mutations were confrmed in the probands and their parents. Further analysis was based on clinical features, routine laboratory examinations and treatment.ResultsAll the 5 patients manifested with severe hepatomegaly, hypoglycemia, moderately to severely elevated liver enzyme levels, hypertriglyceridemia and growth retardation. Four cases showed poor exercise tolerance but with normal creatine kinase (CK) levels. None of the patients showed liver cirrhosis. Growth velocity and hepatomegaly was improved after the uncooked corn starch treatment was initiated. In the 5 patients, 6 different pathogenic or likely pathogenic mutations in the PHKG2 gene were identifed, including one reported mutation (p.E157K) and fve novel mutations (p.E56X, p.R185X, c.79_88delinsTCTGGTCG, c.761delC,p.R279C). The p.E157K was the most frequently mutation identified (6/12, 50%).ConclusionsThe p.E157K mutation is the hot mutation in our small cohort. Main clinical features of our patients include fasting hypoglycemia, impaired liver function，short statures and poor exercise tolerance, without developing liver cirrhosis.

glycogen storage diseaseⅨc; PHKG2 gene; target sequencing; mutation

2017-03-13)

(本文編輯：蔡虹蔚)

國家自然科學(xué)基金（No.81170811）；上海市衛(wèi)生局基金（No.20134005）；國家重點(diǎn)研發(fā)計劃精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究專項(xiàng)（No.2016YFC0905100）

邱文娟 電子信箱：qiuwenjuanxh@163.com

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.08.012