自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床研究

沈華超，丁海霞，李曉波，曹菁菁，馬虎龍，張云云，吳春平，孫波，王杰,，丁新生,

自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床研究

沈華超1,2，丁海霞3，李曉波2，曹菁菁2，馬虎龍4，張云云2，吳春平4，孫波2，王杰2,3，丁新生1,2,3

目的：探討應(yīng)用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床療效。方法：收集患者24例，包括持續(xù)植物狀態(tài)（PVS）12例、運動神經(jīng)元病11例、橋腦小腦萎縮1例。入院后經(jīng)骨髓穿刺采集自體骨髓，當(dāng)天分離回輸1×108個單個核細(xì)胞，剩余細(xì)胞進行MSCs培養(yǎng)擴增，待MSCs數(shù)量增至約1×108個細(xì)胞后收集細(xì)胞，經(jīng)腰椎穿刺推注。治療前后對患者神經(jīng)功能變化分別進行評價。結(jié)果：12例PVS患者中，PVS評分提高、肌力改善5例；11例運動神經(jīng)元病患者和1例橄欖橋腦小腦萎縮患者中，肌力、構(gòu)音障礙改善5例。結(jié)論：MSCs移植治療可以部分緩解神經(jīng)系統(tǒng)疾病的癥狀，近期療效明顯，無不良反應(yīng)，遠(yuǎn)期療效還需進一步隨訪和觀察。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；移植；持續(xù)植物狀態(tài)；運動神經(jīng)元病

腦卒中和腦外傷后的持續(xù)性植物狀態(tài)（persistent vegetable state，PVS）、運動神經(jīng)元病的病死率和致殘率很高，療效不盡如人意，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種主要存在于骨髓中的非造血干細(xì)胞，是中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞。通過體外貼壁培養(yǎng)加以分離，分化為多種造血以外的組織細(xì)胞，特別是中胚層和外胚層來源的組織細(xì)胞。由于其來源方便、擴增相對容易、自體移植不存在免疫排斥反應(yīng)；不存在胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞有可能涉及到的倫理道德問題，不必使用大量免疫抑制劑；易于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達，因此MSCs有望成為較理想的神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞和基因治療理想的種子細(xì)胞及組織再生的工具，在臨床應(yīng)用上受到越來越廣泛的關(guān)注。

目前自體MSCs移植已用于治療終末期充血性心衰、心肌梗死、糖尿病足、下肢缺血性疾病等及神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦卒中、阿爾茨海默病、脊髓損傷等。本研究在體外實驗成功培養(yǎng)MSCs的基礎(chǔ)上，應(yīng)用自體MSCs移植治療PVS12例和運動神經(jīng)元病11例、橋腦小腦萎縮1例，現(xiàn)將治療過程和隨訪情況報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2003年10月至2013年11月江蘇省人民醫(yī)院和南京紫金醫(yī)院的住院患者24例，其中PVS12例、運動神經(jīng)元病11例、橋腦小腦萎縮1例，見表1、表2。

1.2 方法

1.2.1 材料 肝素（購于常州千紅生化制藥股份有限公司），F(xiàn)icoll、氯化銨、人MSCs基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基、人MSCs培養(yǎng)基添加物（購于加拿大Stem Cell公司）。

1.2.2 骨髓采集方法 患者或其家屬同意并簽署手術(shù)協(xié)議書和干細(xì)胞治療知情同意書后，在嚴(yán)格無菌條件下行骨髓穿刺術(shù)。在局部麻醉下，取髂骨上緣為穿刺點，抽取骨髓約50 mL。術(shù)中監(jiān)測患者血壓等生命體征變化，術(shù)后在監(jiān)護病房觀察24 h。

1.2.3 MSCs細(xì)胞的分離、提取、培養(yǎng) 采集的骨髓用肝素抗凝，采集后立即送實驗室，用Ficoll密度梯度離心法去除紅細(xì)胞、多核細(xì)胞、血清和細(xì)胞碎片，分離獲得骨髓單個核細(xì)胞（mononuclear cells，MNCs）。所有骨髓均經(jīng)涂片、染色、鏡檢明確細(xì)胞無異常，MNCs分離液均取樣進行活細(xì)胞計數(shù)。取1×108個細(xì)胞加入1%白蛋白3 mL，腰穿當(dāng)天回輸。其余細(xì)胞按2～5×107/皿接種，每3～4 d換液。待MSCs細(xì)胞長至約1×108個細(xì)胞時（平均10 d），收集細(xì)胞后腰穿回輸1次。

1.2.4 治療方法和評價 提取的MNCs懸液、分離培養(yǎng)的MSCs懸液均經(jīng)腰椎穿刺蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)一次性注射。其中11和14號患者各接受2次細(xì)胞移植。干細(xì)胞治療前和治療后1 d、1月、6月、2年分別評價患者神經(jīng)功能及不良反應(yīng)。

2 結(jié)果

自體MSCs治療因車禍所致顱腦外傷后PVS 5例，PVS評分較前提高2例，刺激后四肢有不自主活動及頭部轉(zhuǎn)動，眼球震顫及吞咽動作，失訪1例；治療腦出血后PVS 4例，治療后2周仍神志不清2例，但眼球跟蹤較前明顯，有時對聲音刺激表現(xiàn)流淚等情感反應(yīng)，隨訪中發(fā)現(xiàn)該病例能對家屬的言語用眼球活動示意，失訪1例；治療腦炎后PVS 1例，出院時其PVS評分較前提高4分，神志未清，無情感反應(yīng)及完成指令動作，四肢肌張力較高，刺激時有肌強直發(fā)作；治療因皮質(zhì)紋狀體變性后PVS 1例，其肌張力有所下降，但仍意識不清，腦電圖及誘發(fā)電位無明顯改善，見表1。治療運動神經(jīng)元病11例、橋腦小腦萎縮1例，5例有不同程度的肌力、構(gòu)音障礙改善，見表2。24例患者中共有2例移植干細(xì)胞后出現(xiàn)一過性發(fā)熱，無其他不良反應(yīng)。

3 討論

近年來，神經(jīng)細(xì)胞移植被用來修復(fù)或重建神經(jīng)組織因疾病和損傷而造成的功能缺失。如用胎兒中腦細(xì)胞移植治療Parkinson病，部分患者的癥狀明顯改善，PET檢查腦內(nèi)多巴胺的合成增加[1,2]。但胎兒細(xì)胞來源明顯受到許多因素如免疫反應(yīng)等的限制，很難廣泛應(yīng)用。早在19世紀(jì)中葉，就有人發(fā)現(xiàn)骨髓具有成骨能力，MSCs具有高度增殖、自我更新和多向分化潛能，在不同誘導(dǎo)條件下，可分化為軟骨、骨、骨骼肌、肌腱、脂肪等中胚層細(xì)胞，同時還可以向外胚層的神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)胚層的肝卵圓性細(xì)胞分化[3,4]。MSCs移植在腦創(chuàng)傷[5,6]、腦梗死[7,8]等的動物實驗治療中，都取得明顯的效果；近幾年，其在腦復(fù)蘇[9]、腦卒中[10,11]、脊髓損傷[12]等的臨床應(yīng)用中也取得一定的療效。本研究采用蛛網(wǎng)膜下腔途徑移植MSCs，對PVS及運動神經(jīng)元病等的臨床療效及不良反應(yīng)進行初步觀察，取得了一定的臨床效果。由于運動神經(jīng)元病為神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)生于老年患者，從老年患者分離提取的骨髓干細(xì)胞活力相對較差，可能影響該部分患者的骨髓干細(xì)胞移植治療效果。

本研究采用的腰椎穿刺蛛網(wǎng)膜下腔移植的方法，循腦脊液循環(huán)能夠直接進入腦組織內(nèi)，有利于進一步遷移、分化，從而修復(fù)缺損。諸多動物實驗已證實MSCs移植治療后，神經(jīng)功能缺失癥狀能明顯改善。大鼠永久性腦缺血后當(dāng)天和第3天尾靜脈注射MSCs，均可改善神經(jīng)功能缺損評分，同時降低死亡率，減少梗死體積，促進血管再生及側(cè)腦室下區(qū)的細(xì)胞增殖[13]。新生大鼠腦缺血缺氧后MSCs移植可減少梗死體積，增加神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化，抑制炎性細(xì)胞的增加，并促進神經(jīng)功能恢復(fù)[14]，大鼠永久性腦缺血后立即靜脈注射MSCs，14 d及28 d的神經(jīng)功能缺損評分較對照組均有所提高，并發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）及CXCR4的表達上調(diào)，推測MSCs可能通過SDF-1/CXCR4調(diào)節(jié)其從嗅球遷移至病灶區(qū)，從而改善神經(jīng)功能[15]；Yoo等[16]認(rèn)為MSCs促進神經(jīng)功能恢復(fù)，一方面由于其增加了內(nèi)源性神經(jīng)再生，另一方面由于其能保護新生的神經(jīng)元免受損害。其可能機制具體有以下幾個方面：替代作用，MSCs可分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，取代已死亡的神經(jīng)細(xì)胞；支持作用，MSCs能分泌腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子和白介素等營養(yǎng)因子，如增加缺血腦組織的TNF-α、IL-10等因子的釋放發(fā)揮抗炎作用[17]，還有研究顯示MSCs移植后可產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)對神經(jīng)元發(fā)揮保護作用[18]；誘導(dǎo)作用，Liu等[19]研究證實缺血缺氧的環(huán)境下，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)MSC分化為內(nèi)皮細(xì)胞，同時MSCs可通過旁分泌的作用促進腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移。

表1 PVS患者的臨床資料

MSCs以其他來源細(xì)胞無法比擬的優(yōu)勢成為細(xì)胞和基因治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病理想的供體細(xì)胞，目前已顯示出其不凡的分化能力和一定的治療作用。進一步探索決定MSCs向神經(jīng)系細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)影響其分化的細(xì)胞、免疫、分子學(xué)機制，找到調(diào)控細(xì)胞遷移和整和的方法等是在真正臨床運用MSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病之前所必須要完成的。相信隨著對MSCs研究的不斷深入，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞基因治療將會有廣闊的前景。

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表2 神經(jīng)變性病患者的臨床資料

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（本文編輯：王晶）

Clinical Study of Treating Incurable Neurologic Diseases with Autologous Mesenchymal Stem Cells

SHEN Hua-chao1,2,DING Hai-xia3,LI Xiao-bo2,CAO Jing-jing2,MA Hu-long4,ZHANG Yun-yun2,WU Chun-ping4,SUN Bo2,WANG Jie2,3,DING Xin-sheng1,2,3.
1.Department of Neurology,BenQ Hospital Affilicated to Nanjing Medical University,Nanjing 210019,China;2.Institute of Neurology,BenQ Hospital Affilicated to Nanjing Medical University,Nanjing 210019,China;3.Department of Neurology,The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China;4.Department of Internal Medicine,Nanjing Zijing Hospital,Nanjing 210007,China

Objective:To explore the clinical effects of auto-mesenchymal stem cells(MSCs)transplantation on treatment of patients with incurable neurologic diseases.Methods:The 24 patients with persistent vegetative state(n=12),motor neuron disease(n=11)and olivoponto-cerebellar atrophy(n=1)were harvested for bone marrow.The mononuclear cells(MNCs)were isolated and 1×108MNCs were injected into subarachnoid space by lumbar puncture one the same day.The remaining cells were cultured,amplified and then injected into subarachnoid space by lumbar puncture when MSCs were increased to 1×108or so.The neurologic functions were observed before and after MSCs transplantation.Results:Five of 12 PVS patients had elevated PVS score at various degree and improved motor function.Among 11 motor neuron disease and 1 olivopontocerebellar atrophy patients,5 patients had some improvement at various degrees in muscle strength,and speech.Conclusion: There were significant clinical effects in treatment of neurologic diseases with MSCs transplantation in a short term,and with no severe side effects and complications.The long-term clinical effect needs more observation with larger samples.

mesenchymal stem cells;transplantation;persistent vegetable state;motor neuron disease

R741;R741.05

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.03.003

1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬明基醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

南京 210029

2.南京醫(yī)科大學(xué)明基神經(jīng)病學(xué)研究所

南京 210029

3.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

南京 210029

4.南京紫金醫(yī)院內(nèi)科

南京 210007

國家自然科學(xué)基金（No.30971022）

2015-05-25

丁新生

dingxs666888@ 163.com