負(fù)載山梨酸的殼聚糖微囊-EVOH抗菌薄膜對(duì)黑魚魚肉保鮮的影響

戶帥鋒，于 潔，趙碧潔，王 喆，李 立,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.吉林大學(xué)珠海學(xué)院，廣東 珠海 519041；3.中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，生物醫(yī)用材料與界面研究中心，廣東 深圳 518055）

負(fù)載山梨酸的殼聚糖微囊-EVOH抗菌薄膜對(duì)黑魚魚肉保鮮的影響

戶帥鋒1，于 潔1，趙碧潔2，王 喆3，李 立1,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.吉林大學(xué)珠海學(xué)院，廣東 珠海 519041；3.中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，生物醫(yī)用材料與界面研究中心，廣東 深圳 518055）

分別以質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%山梨酸（sorbic acid，S）、3%殼聚糖（chitosan，CS）、3%山梨酸-殼聚糖微囊粉末（sorbic acid-chitosan microcapsules，S-MP）為抗菌物質(zhì)，以乙烯-聚乙烯醇共聚物（ethylene-vinyl alcohol，EVOH）為基材樹脂，通過共混造粒、擠出吹塑等工藝，制備山梨酸-EVOH（S-EVOH）、殼聚糖-EVOH（CSEVOH）、山梨酸-殼聚糖微囊-EVOH（S-MP-EVOH）3 種抗菌薄膜，并以對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）薄膜為外層薄膜進(jìn)行復(fù)合，制備出S-EVOH/PET、CS-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET復(fù)合薄膜以及純EVOH/PET，在（4±1） ℃對(duì)黑魚魚塊進(jìn)行冷藏保鮮，通過菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮含量、硫代巴比妥酸值、pH值、汁液流失率、K值和感官評(píng)定對(duì)抗菌薄膜的保鮮效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，若以菌落總數(shù)小于6 （lg（CFU/g））為可食用的標(biāo)準(zhǔn)，在（4±1） ℃貯藏環(huán)境下，相對(duì)于EVOH/PET薄膜，CS-EVOH/PET薄膜能有效延長黑魚貨架期2 d，S-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET兩種復(fù)合薄膜均能有效延長黑魚貨架期4 d。

山梨酸；殼聚糖；山梨酸-殼聚糖微囊；乙烯-聚乙烯醇共聚物；黑魚；貨架期

黑魚在中國是一種常見的食用魚，骨刺少，含肉率高，營養(yǎng)豐富，受到消費(fèi)者喜愛。但黑魚體表體內(nèi)黏附大量細(xì)菌、體內(nèi)酶活性強(qiáng)等因素，導(dǎo)致魚肉極易腐敗變質(zhì)，導(dǎo)致其經(jīng)濟(jì)效益不高[1-2]。隨著生鮮電商行業(yè)快速發(fā)展，如何解決生鮮食品配送“最后一公里”的難題成為廣大社會(huì)群體和相關(guān)行業(yè)的關(guān)注焦點(diǎn)。而抗菌包裝薄膜能夠有效地抑制生鮮食品表面微生物生長，延長生鮮食品的貨架期，有助于解決生鮮食品配送這一難點(diǎn)。

山梨酸（sorbic acid，S）是一種高效無毒的防腐保鮮劑，對(duì)酵母、霉菌和許多真菌均具有抑制作用。但山梨酸的水溶性較差，其在食品保鮮中的應(yīng)用受到限制[3]。殼聚糖（chitosan，CS）是由甲殼素脫乙酰制得的一種直鏈多糖，具有良好的抗菌活性，對(duì)食源性絲狀真菌、細(xì)菌具有抑制作用，是食品工業(yè)中常用的保鮮劑[4-6]。殼聚糖無毒無味、具有良好的生物組織相容性和生物可降解性，能夠與聚陰離子通過離子交聯(lián)法制備載藥微囊[7]，能夠起到緩釋的作用，并減少外界環(huán)境對(duì)被包埋藥物的影響[8-9]。

將山梨酸、殼聚糖、山梨酸-殼聚糖微囊粉末（sorbic acid-chitosan microcapsules，S-MP）分別以質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%添加到乙烯-聚乙烯醇共聚物（ethylene-vinyl alcohol，EVOH）樹脂顆粒中，通過擠出吹塑法，制備出純EVOH、山梨酸-EVOH（S-EVOH）、殼聚糖-EVOH（CS-EVOH）、山梨酸-殼聚糖微囊-EVOH（S-MP-EVOH） 4 種不同的薄膜。因EVOH樹脂的分子結(jié)構(gòu)中存在著羥基，EVOH樹脂具有親水性和吸濕性。當(dāng)吸附水蒸氣后，氣體的阻隔性能會(huì)受到影響[10]。以對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）預(yù)涂膜為外層薄膜，對(duì)4 種單層EVOH薄膜進(jìn)行復(fù)合，制得EVOH/PET、S-EVOH/PET、CS-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET復(fù)合薄膜，減少吸濕作用對(duì)EVOH薄膜的氣體阻隔性的影響。

本實(shí)驗(yàn)以EVOH/PET、S-EVOH/PET、CS-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET復(fù)合薄膜制備成包裝袋，用于4 ℃環(huán)境下黑魚魚肉的冷藏保鮮，并以菌落總數(shù)（total viable counts，TVC）、揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量、pH值、硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA）值、汁液流失率、K值等作為鮮度指標(biāo)，同時(shí)進(jìn)行感官評(píng)定，評(píng)價(jià)抗菌薄膜的保鮮效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑魚購于上海農(nóng)工商超市，每條黑魚質(zhì)量約1 000 g。

EVOH（H171B） 日本可樂麗公司；PET預(yù)涂膜（總厚度：25 μm，PET基材厚度：12 μm、EVA膠層厚度：13 μm） 伊路順軟包裝材料有限公司。

山梨酸、三氯乙酸、硼酸、TBA、高氯酸（分析純）、溴甲酚綠（試劑純）、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、甲醇（色譜純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；殼聚糖（脫乙酰度≥95%，黏度100～200 MPa?s） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）（HPLC純度≥95%） 美國Sigma公司；腺苷一磷酸（adenosine monophosphate，AMP）、肌苷一磷酸（inosine monophosphate，IMP）（HPLC純度≥99%） 北京曼哈格生物科技有限公司；次黃嘌呤（hypoxanthine，Hx）、次黃嘌呤核苷酸（hypoxanthine nucleotide，HxR）（HPLC純度≥98%）美國Chromadex公司。

單增李斯特菌ATCC19114（Listeria monocytogenes）、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13076（Mouse enterica）和大腸桿菌ATCC 25922（Escherichia coli）由農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海）提供。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南省予華儀器有限公司；UV2100分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；KJELTEC2300凱氏定氮儀 丹麥FOSS有限公司；PHS-3C pH計(jì) 上海精科雷磁有限公司；拍打式勻漿器 法國Interscience公司；2695高效液相色譜儀美國Waters公司；H2050R-1高速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗菌薄膜的制備

山梨酸、殼聚糖、S-MP以質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的比例分別添加到EVOH樹脂顆粒中，經(jīng)充分?jǐn)嚢杈鶆蚝螅ㄟ^雙螺桿擠出機(jī)進(jìn)行共混改性，造粒機(jī)剪切，制得S-EVOH、CS-EVOH、S-MP-EVOH 3 種改性樹脂。雙螺桿擠出機(jī)的1～7區(qū)溫度分別為150、185、190、190、190、180 ℃和165 ℃；雙螺桿轉(zhuǎn)速為60 r/min。純EVOH顆粒及3 種改性母粒分別通過擠出吹塑法制備得到純EVOH、S-EVOH、CS-EVOH、S-MP-EVOH 4 種薄膜。單螺桿擠出機(jī)各區(qū)溫度分別為154、190、185、170 ℃，單螺桿轉(zhuǎn)速為35 r/min。

1.3.2 抗菌薄膜的抑菌測(cè)定

參考Muriel-Galet等[11]的抗菌薄膜的抑菌性能測(cè)試方法，具體修改如下：金黃色葡萄球菌ATCC 6538、大腸桿菌ATCC 25922和單增李斯特菌ATCC 19114菌種分別用營養(yǎng)肉湯10 mL在37 ℃條件下培養(yǎng)活化24 h，連續(xù)培養(yǎng)活化2 次后，用生理鹽水溶液依次做10 倍遞增稀釋液，選擇菌液濃度為5.0×105CFU/mL的稀釋液作為實(shí)驗(yàn)用菌濃度的細(xì)菌懸浮液。取5 種薄膜各0.40 g分別放置于含有10 mL營養(yǎng)肉湯的試管中，在室溫條件下放置2 d。然后向試管中接入100 μL實(shí)驗(yàn)用菌懸浮液，在37 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng) 24 h。根據(jù)0.5麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)，以生理鹽水為稀釋液對(duì)各試管進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋。取200 μL不同梯度的稀釋液，在含有15 mL營養(yǎng)瓊脂的培養(yǎng)皿中涂布，然后放置在（37±1）℃條件下培養(yǎng)48 h后，按GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[12]的方法測(cè)定活菌數(shù)。

1.3.3 黑魚樣品的處理

以PET預(yù)涂膜為外層薄膜，對(duì)純EVOH、S-EVOH、CS-EVOH、S-MP-EVOH 4 種薄膜進(jìn)行復(fù)合，制備出EVOH/PET、S-EVOH/PET、CS-EVOH/PET、S-MPEVOH/PET 4 種復(fù)合薄膜。并以這4 種薄膜為包裝材料制袋，進(jìn)行黑魚魚肉保鮮實(shí)驗(yàn)。

對(duì)黑魚進(jìn)行擊暈、去頭、去腮、去內(nèi)臟、去骨、剝皮處理，用1～4 ℃的去離子水沖洗，然后置于冰中待處理。將處理好的黑魚魚肉切成大約30 g的魚塊。魚塊被隨機(jī)分成4 組，分別裝于EVOH/PET、S-EVOH/PET、CS-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET 4 種不同復(fù)合薄膜制成的包裝袋內(nèi)。魚肉樣品處理方案設(shè)計(jì)為：魚肉樣品包裝后，置于（4±1） ℃環(huán)境中貯藏。在第0、2、4、6、8、10天，每次取出16 個(gè)樣品（每組4 個(gè)樣品，共4 組），進(jìn)行微生物、理化指標(biāo)的檢測(cè)，并進(jìn)行感官評(píng)定，共計(jì)取樣144 個(gè)魚肉樣品。

1.3.4 指標(biāo)測(cè)定

1.3.4.1 菌落總數(shù)的測(cè)定

根據(jù)GB 4789.2—2010進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定。

1.3.4.2 TVB-N含量的測(cè)定

根據(jù)半微量凱氏定氮的原理，利用Kjeltee2300自動(dòng)凱氏定氮儀對(duì)魚肉的TVB-N含量進(jìn)行[13]測(cè)定。

1.3.4.3 TBA值的測(cè)定

參考顧海寧等[14]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行TBA值的測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以每千克魚肉中所含丙二醛的量表示：

式中：A532nm為樣液在532 nm波長處吸光度；A600nm為樣液在600 nm波長處吸光度。

1.3.4.4 pH值的測(cè)定

將樣品魚肉絞碎后稱取10.0 g于燒杯中，加入新鮮冷卻煮沸的蒸餾水100 mL，用高速勻漿機(jī)勻漿1 min，勻漿結(jié)束后，靜置30 min，用PHS-3C型pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定[15]。

1.3.4.5 汁液流失率的測(cè)定

參考?zogul等[16]的方法，測(cè)定汁液流失率，略作修改：各組樣品分別稱質(zhì)量，記錄為m1，然后封裝于包裝袋內(nèi)。測(cè)試指標(biāo)前，剪開包裝袋，用濾紙將樣品表面的汁液吸干后，稱質(zhì)量，記錄為m2。計(jì)算公式如式（2）所示。

1.3.4.6 K值的測(cè)定

ATP及其降解產(chǎn)物的提取和測(cè)定參照奚春蕊等[17]的方法。K值計(jì)算公式如式（3）所示。

式中：MATP為樣品中腺苷三磷酸的含量/（μmol/g）；MADP為樣品中腺苷二磷酸的含量/（μmol/g）；MAMP為樣品中腺苷酸的含量/（μmol/g）；MIMP為樣品中肌苷酸的含量/（μmol/g）；MHxR為樣品中次黃嘌呤核苷的含量/（μmol/g）；MHx為樣品中次黃嘌呤的含量/（μmol/g）。1.3.5 感官評(píng)定

根據(jù)Chamanara等[18]的方法，略作修改。魚肉樣品由一個(gè)6 人（3 男3 女）感官評(píng)定小組進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。所有樣品2 d評(píng)價(jià)一次。魚肉樣品隨機(jī)的獨(dú)立放置在白色塑料托盤中，所有托盤均獨(dú)立編號(hào)。感官評(píng)定小組成員按照9 分嗜好程度（1 分，極端不喜歡；2 分，非常不喜歡；3 分，一般不喜歡；4 分，稍微不喜歡；5 分，最低可接受值；6 分，稍微喜歡；7 分，一般喜歡；8 分，非常喜歡；9 分，極端喜歡）對(duì)樣品的氣味、質(zhì)構(gòu)、色澤以及總體可接受度進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有分析均重復(fù)3 次，每重復(fù)3 個(gè)平行（n=3×3），所有數(shù)據(jù)均通過SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用最小顯著差數(shù)法（LSD）（P＜0.05）進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄膜的抑菌效果

圖1 薄膜對(duì)沙門氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌的抑菌效果Fig. 1 Inhibitory effect of antimicrobial fi lms on tested bacteria

圖1顯示S-EVOH、S-MP-EVOH、CS-EVOH這3種薄膜對(duì)單增李斯特菌、沙門氏菌和大腸桿菌均具有不同程度的抑菌作用。在接種培養(yǎng)24 h后，相對(duì)于純EVOH薄膜，S-EVOH、S-MP- EVOH、CS-EVOH薄膜使單增李斯特菌菌落總數(shù)分別減少2.32、2.23、2.01（lg（CFU/g）），使沙門氏菌的菌落總數(shù)分別減少5.00、4.54、4.08（lg（CFU/g）），使大腸桿菌的菌落總數(shù)分別減少3.30、2.59、2.32（lg（CFU/g））。結(jié)果顯示，S-MP-EVOH薄膜的抗菌效果較S-EVOH薄膜弱，這可能是因?yàn)镋VOH在溶液中結(jié)構(gòu)疏松，導(dǎo)致薄膜中山梨酸的釋放速率較S-MP-EVOH薄膜快，且釋放含量高，發(fā)揮抑菌效果更好。S-MP-EVOH、CS-EVOH薄膜的抑菌效果依賴于從薄膜中溶出的和薄膜表面的CS、S-MP。EVOH在溶液中結(jié)構(gòu)疏松，使CS、S-MP更容易從EVOH薄膜中溶出。S-MP-EVOH薄膜的抗菌效果強(qiáng)于CS-EVOH薄膜，是因?yàn)樵谌芤褐蠸-MP的山梨酸更易釋放到溶液中和溶于溶液中的部分殼聚糖發(fā)揮協(xié)同抑菌作用。

抑菌結(jié)果顯示S-EVOH、S-MP-EVOH、CS-EVOH薄膜均對(duì)革蘭氏陰性菌（沙門氏菌和大腸桿菌）的抑菌效果要優(yōu)于革蘭氏陽性菌（單增李斯特菌）。Hauser等[19]的研究表明含有0.7%或更高含量CS的聚乙烯薄膜對(duì)沙門氏菌和大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的抑菌效果要好于革蘭氏陽性菌（單增李斯特菌）。Park等[20]的研究同樣表明，將山梨酸溶于聚乙烯醇溶液中，涂膜于聚乙烯薄膜表面，對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌均具良好的抑菌效果，與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相似。

2.2 冷藏過程中菌落總數(shù)的變化

圖2 冷藏過程中魚肉樣品菌落總數(shù)的變化Fig. 2 Changes in total viable counts of fi sh samples during cold storage

魚肉的腐敗與細(xì)菌的生長繁殖密切相關(guān)。細(xì)菌總數(shù)是評(píng)價(jià)黑魚貨架期長短的重要鮮度指標(biāo)。如圖2所示，所有魚肉樣品組的細(xì)菌菌落總數(shù)都隨著貯藏時(shí)間的延長而逐漸升高。4 組黑魚樣品的初始菌落總數(shù)為2.99 （lg（CFU/g））。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，EVOH/PET組的菌落總數(shù)都要高于其他實(shí)驗(yàn)組。Huang等[21]研究指出魚肉中細(xì)菌總數(shù)的最大可接受限值為6 （lg（CFU/g））。在第6天，EVOH/PET組的菌落總數(shù)為6.02 （lg（CFU/g）），超過最大可見接受限值，且與3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的差異顯著（P＜0.05）；S-EVOH/PET、CS-EVOH/PET、 S-MP-EVOH/PET組的菌落總數(shù)分別為4.31、4.85、4.56（lg（CFU/g）。EVOH/PET組在第8天的菌落總數(shù)為6.89 （lg（CFU/g）），而S-EVOH/PET與S-MP-EVOH/PET組的菌落總數(shù)分別為5.21、5.5 （lg（CFU/g）），且差異不顯著（P＞0.05）。第10天，S-EVOH/PET與S-MP-EVOH/PET兩組的菌落總數(shù)均超過最大可接受限值。結(jié)果證明，相對(duì)于EVOH/PET復(fù)合薄膜，CS-EVOH/PET復(fù)合薄膜能夠延長黑魚的貨架期2 d，而S-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET兩種復(fù)合薄膜能夠延長黑魚的貨架期4 d。

EVOH樹脂具有親水性和吸濕性，直接在EVOH中添加山梨酸，使得山梨酸能夠較快從薄膜中遷移至魚肉的表面，而在冷藏2～4 d時(shí)魚肉的pH值相對(duì)較低，所以S-EVOH/PET復(fù)合薄膜能有效抑制魚肉表面的細(xì)菌生長。S-MP-EVOH/PET復(fù)合薄膜由于將山梨酸包埋在殼聚糖微球中，山梨酸釋放較S-EVOH/PET復(fù)合薄膜緩慢但抑菌時(shí)間更長[22-23]，而且能夠協(xié)同殼聚糖發(fā)揮抗菌作用，所以也能夠有效抑制魚肉表面細(xì)菌的生長繁殖。

2.3 冷藏過程中TVB-N含量的變化

TVB-N指動(dòng)物性食品在酶和細(xì)菌的作用下，蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)。GB 2733—2015《鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[24]要求淡水魚蝦的TVB-N值不大于20 mg/100 g。

圖3 冷藏過程中魚肉樣品TVB-N含量的變化Fig. 3 Changes in TVB-N value of fi sh samples during cold storage

4 種復(fù)合薄膜對(duì)（4±1） ℃條件下貯藏黑魚TVB-N含量的影響見圖3。黑魚樣品的初始TVB-N含量為9.93 mg/100 g，在不同復(fù)合薄膜的處理下，黑魚樣品的TVB-N含量隨著貯藏時(shí)間的延長逐漸增加。在第6天，EVOH/PET、S-EVOH/PET、CS-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET組的TVB-N含量分別為19.38、14.96、17.92、16.04 mg/100 g，EVOH/PET組的TVB-N含量顯著高于其他各組（P＜0.05），而S-EVOH/PET組最低。在第8天，EVOH/PET、CS-EVOH/PET兩組的TVB-N含量均高于最大可接受20 mg/100 g，已經(jīng)腐??；S-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET組的TVB-N含量分別為18.34、19.42 mg/100 g，未腐敗。在第10天，S-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET組的TVB-N含量大于20 mg/100 g，腐敗變質(zhì)，說明相對(duì)于其他兩組，這兩組均能延長黑魚貨架期2 d。可以看出在2～10 d，EVOH/PET組的TVB-N含量增長速率明顯高于其他各組，S-EVOH/PET組的TVB-N含量上升趨勢(shì)低于S-MP-EVOH/PET組，說明S-EVOH/PET薄膜的保鮮效果優(yōu)于S-MP-EVOH/PET薄膜。

2.4 TBA值的變化

圖4 冷藏過程中魚肉樣品TBA值的變化Fig. 4 Changes in TBA value of fi sh samples during cold storage

TBA可以用來反映肉中脂肪的最終氧化程度，TBA值越大，說明脂肪氧化程度越高，魚肉的腐敗程度越高。冷藏期間，4 種復(fù)合薄膜對(duì)魚肉TBA值變化的影響如圖4所示。黑魚樣品的初始TBA值為0.22 mg/kg，在不同薄膜的處理下，黑魚樣品的TBA值隨著貯藏時(shí)間的延長逐漸增加。在冷藏期間，3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的TBA值顯著低于對(duì)照組EVOH/PET組（P＜0.05）。在第6天，S-EVOH/PET和S-M P-E V O H/P E T兩組的T B A值差異不顯著（P＞0.05），分別為0.46、0.45 mg/kg；CS-EVOH/PET組的TBA值為0.56 mg/kg。在第8天，S-EVOH/PET組的TBA值最低，但與S-MP-EVOH/PET組差異不顯著。4 種復(fù)合薄膜內(nèi)層均以EVOH為基材，對(duì)氧氣的阻隔性很好，優(yōu)于外層PET薄膜。在初期外界氧氣極少能進(jìn)入包裝袋內(nèi)，所以初期的脂肪氧化是由包裝袋內(nèi)的氧氣引起[25]。隨著冷藏時(shí)間的延長，魚肉產(chǎn)生的水分增多，EVOH的吸濕性和親水性導(dǎo)致以EVOH為基材的內(nèi)層薄膜對(duì)氧氣的阻隔性降低，所以在后期，4 種復(fù)合薄膜對(duì)氧氣的阻隔性依賴于外層PET薄膜，脂肪的氧化程度加劇。EVOH/PET組的TBA值高于3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，可能是由細(xì)菌的生長繁殖引起。

2.5 冷藏過程中pH值的變化

圖5 冷藏過程中魚肉樣品pH值的變化Fig. 5 Changes in pH value of fi sh samples during cold storage

黑魚冷藏過程中pH值的變化如圖5所示。在冷藏期間，所有魚肉樣品組的pH值都呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)。魚體在宰殺以后，魚肉中CO2的溶解，糖原經(jīng)無氧降解產(chǎn)生的乳酸，ATP和磷酸肌酸分解產(chǎn)生的磷酸，都會(huì)造成pH值的下降。隨著冷藏時(shí)間的延長，魚體內(nèi)蛋白質(zhì)逐漸被微生物分解，以及酶類代謝造成的氨基酸脫氨基、核苷降解、胺類物質(zhì)氧化為堿性含氮小分子物質(zhì)，致使pH值不斷上升[26]。由圖5可以看出，黑魚樣品的初始pH值為6.67。在冷藏期間，3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的pH值都顯著低于EVOH/PET組（P＜0.05）。在第6天，S-EVOH/PET組樣品的pH值為6.51，顯著低于CS-EVOH/PET組（P＜0.05），與S-MP-EVOH/PET組差異不顯著（P＞0.05）。在第8天，S-EVOH/PET組樣品的pH值為6.8，與CS-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET兩組差異均不顯著（P＞0.05）。由圖2、5可知，黑魚樣品pH值的變化和樣品菌落總數(shù)的變化具有一定的相關(guān)性，S-EVOH/PET、CS-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET 3 種抗菌復(fù)合薄膜均能在一定程度上抑制魚肉表面微生物的生長繁殖，延緩其pH值的變化。在0～6 d，4 組黑魚樣品的pH值上升較為緩慢，是因?yàn)? 組樣品的菌落總數(shù)較低導(dǎo)致；在6～10 d，4 組樣品的細(xì)菌生長繁殖快，堿性含氮小分子物質(zhì)積累導(dǎo)致pH值上升速率加快。

2.6 冷藏過程中持水率的變化

圖6 冷藏過程中魚肉樣品汁液流失率的變化Fig. 6 Changes in drip loss of fi sh samples during cold storage

如圖6所示，在冷藏條件下，EVOH/PET、S-EVOH/PET、CS-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET 4 組黑魚樣品的汁液流失率都呈逐漸上升趨勢(shì)。在整個(gè)冷藏過程中EVOH/PET組的汁液流失率明顯高于3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組。在第6天，S-EVOH/PET組的汁液流失率為3.17%，與CS-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET兩組無顯著差異（P＞0.05）。在第8天，S-EVOH/PET組的汁液流失率3.93%，與CS-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET兩組差異顯著（P＜0.05）。4 組樣品汁液流失率的變化與使用的薄膜的抑菌性能相關(guān)，可見汁液的流失是因?yàn)榧?xì)菌的生長繁殖，使黑魚組織分解，細(xì)胞破裂，營養(yǎng)物質(zhì)被細(xì)菌分解、氧化和水解導(dǎo)致的[27]。

2.7 冷藏過程中K值的變化

K值是評(píng)估魚肉質(zhì)量的一個(gè)重要鮮度指標(biāo)。魚死后肌肉中的ATP在內(nèi)源酶作用下發(fā)生降解，降解中間產(chǎn)物依次為ADP、AMP、IMP、HxR和Hx。它能反映魚宰殺后從僵直到自溶不同階段的不同新鮮度。一般來講，活魚的K值在10%以下，可生食魚肉的K值在20%以下，超過60%即開始腐敗[28]。

圖7 冷藏過程中魚肉樣品K值的變化Fig. 7 Changes in K value of fi sh samples during cold storage

（4±1）℃條件下貯藏黑魚樣品的K值變化趨勢(shì)如圖7所示。隨著冷藏時(shí)間的延長， EVOH/PET、S-EVOH/PET、CS-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET 4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的K值逐漸上升，從初始的9.43%分別上升到第10天的75.13%、60.31%、63.76%、67.07%。初始K值低于10%主要是由于魚肉組織中的內(nèi)源酶促降解，而菌落的生長繁殖導(dǎo)致K值在貯藏期間快速上升。在第2天EVOH/PET組和CS-EVOH/PET組的K值分別為27.38%、21.62%，超過20%，不宜生食，實(shí)驗(yàn)組S-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET的K值分別為15.3%、15.91%，未超過20%。在第8天EVOH/PET組的K值為68.49%，超過60%，進(jìn)入腐敗期，S-EVOH/PET、CS-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET 3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的K值分別為52.22%、59.15%、56.18%，均未達(dá)到60%。殼聚糖雖然能夠抑制5-核苷酸酶的活性，但是在EVOH中難以遷移，難以有效抑制ATP的降解。Matsumato等[29]的研究同樣發(fā)現(xiàn)Hx含量的增加是微生物生長的結(jié)果。因此K值的變化很可能與殼聚糖及山梨酸的抑菌效果有關(guān)，S-EVOH和S-MP-EVOH中的山梨酸能夠遷移至魚肉表面，能更有效地抑制細(xì)菌的生長繁殖，因此K值得增加較CS-EVOH/PET組更為緩慢。

2.8 感官評(píng)分結(jié)果

感官評(píng)定是通過視覺、聽覺、嗅覺、味覺、觸覺這5 個(gè)方面對(duì)食品的各項(xiàng)指標(biāo)及可接受程度的評(píng)價(jià)，在食品評(píng)定中占有很大地位。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)氣味、質(zhì)構(gòu)、色澤、總體可接受度4 個(gè)方面對(duì)黑魚魚肉進(jìn)行評(píng)價(jià)。從表1可以看出，在4 ℃冷藏條件下貯藏，黑魚魚肉樣品的感官評(píng)分隨時(shí)間延長逐漸下降，S-EVOH/PET、CS-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET 3 組的感官評(píng)分的下降速率較EVOH/PET組慢。在冷藏第2天，S-EVOH/PET和S-MP-EVOH/PET兩組的感官品質(zhì)保持在第0天的初始水平，而EVOH/PET組和CS-EVOH/PET組的感官品質(zhì)出現(xiàn)一定程度的降低，肉質(zhì)堅(jiān)韌有彈性、無汁液析出、顏色呈鮮紅色，但魚肉表面較為黏稠，稍有魚腥味。在第6天，S-EVOH/PET組的感官評(píng)分最高，樣品袋內(nèi)有少量汁液，無異味，顏色變化不明顯，肉質(zhì)有彈性；而EVOH/PET組樣品的肉質(zhì)松軟，表面黏稠，帶有黃色，包裝袋內(nèi)出現(xiàn)大量黃紅色汁液，其氣味、質(zhì)構(gòu)、顏色和總體可接受度均低于最低可接受值5 分。在第8天，CS-EVOH/PET組的感官評(píng)分低于5 分。在第10天，S-EVOH/PET和S-MP-EVOH/PET兩組的感官評(píng)分低于5 分，而EVOH/PET組樣品表面顏色黃青，肉質(zhì)極其松軟，袋中有大量黃色渾濁汁液，異味刺激強(qiáng)烈，不適宜進(jìn)行感官評(píng)定。

表1 冷藏過程中魚肉樣品感官評(píng)分的變化Table 1 Changes in sensory scores of fi sh samples during cold storage

蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)生NH3、三甲胺、硫化氫、組胺、尸胺等物質(zhì)，脂肪氧化酸敗產(chǎn)生丙二醛等物質(zhì)，這些化學(xué)變化產(chǎn)生的物質(zhì)均具有刺激氣味，使樣品的氣味評(píng)分下降[30]。蛋白質(zhì)的分解導(dǎo)致魚肉的組織結(jié)構(gòu)被破壞使魚肉肉質(zhì)變軟、疏松，魚肉的黏彈性和硬度均發(fā)生變化。微生物的代謝產(chǎn)物，脂肪氧化導(dǎo)致的色素分解均能導(dǎo)致魚肉樣品顏色變化，S-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET、CS-EVOH/PET 3 種復(fù)合薄膜的抑菌效果以及對(duì)氧氣的高阻隔性[31]，導(dǎo)致4 組樣品顏色的評(píng)分變化比氣味、質(zhì)構(gòu)及總體可接受度的評(píng)分變化慢。

3 結(jié) 論

所有鮮度指標(biāo)及感官評(píng)定結(jié)果均反映S-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET復(fù)合薄膜對(duì)黑魚魚肉的保鮮效果最好。若以菌落總數(shù)小于6 （lg（CFU/g））為可食用的標(biāo)準(zhǔn)，在4 ℃環(huán)境中CS-EVOH/PET復(fù)合薄膜能使黑魚魚肉的貨架期延長至8 d；S-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET復(fù)合薄膜則能使黑魚魚肉的貨架期延長至10 d。相對(duì)于EVOH/PET復(fù)合薄膜，CS-EVOH薄膜能有效延長黑魚貨架期2 d，S-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET兩種復(fù)合薄膜均能有效延長黑魚貨架期4 d。S-EVOH/PET、S-MP-EVOH/PET抗菌薄膜均具有良好的抗菌保鮮效果，而S-MP-EVOH/PET抗菌復(fù)合薄膜相對(duì)于S-EVOH/PET抗菌復(fù)合薄膜具有山梨酸使用量少、易于熔融加工、在薄膜貯藏過程中不易氧化變色等優(yōu)點(diǎn)，在生鮮食品保鮮中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Effect of Antimicrobial Ethylene-Vinyl Alcohol (EVOH) Copolymer Film Based on Sorbic Acid-Loaded Chitosan Microcapsules on the Preservation of Snakehead

HU Shuaifeng1, YU Jie1, ZHAO Bijie2, WANG Zhe3, LI Li1,*
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Zhuhai College of Jilin University, Zhuhai 519041, China; 3. Center for Biomedical Materials and Interfaces, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen 518055, China)

Using three different antimicrobials: sorbic acid, chitosan (CS) and sorbic acid-chitosan microcapsules (S-MP), each added at a level of 3%, antimicrobial ethylene-vinyl alcohol (EVOH) copolymer fi lms, sorbic acid-EVOH (S-EVOH), chitosan-EVOH (CS-EVOH) and sorbic acid-chitosan microcapsules-EVOH (S-MP-EVOH), were prepared by sequential blending, granulation, extrusion and blow molding. Using polyethylene terephthalate (PET) pre-coated fi lm as outer fi lm, EVOH/PET, S-EVOH/PET, CS-EVOH/PET and S-MP-EVOH/PET composite films were prepared and applied to the preservation of snakehead fi llets at (4 ± 1) ℃. The total viable count (TVC), total volatile basic nitrogen (TVB-N), pH, thiobarbituric acid (TBA), drip loss, K value and sensory evaluation were analyzed periodically during cold storage. The results indicated that CS-EVOH/PET fi lm could extend the shelf-life of snakehead fi llet by 2 days, and S-EVOH/PET and S-MP-EVOH/PET fi lms could extend the shelf-life by 4 days compared to EVOH/PET fi lm.

sorbic acid; chitosan; sorbic acid-chitosan microcapsules (S-MP); ethylene-vinyl alcohol (EVOH); snakehead; shelf-life

10.7506/spkx1002-6630-201715038

TS254.4

A

1002-6630（2017）15-0237-07

戶帥鋒, 于潔, 趙碧潔, 等. 負(fù)載山梨酸的殼聚糖微囊-EVOH抗菌薄膜對(duì)黑魚魚肉保鮮的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(15): 237-243. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201715038. http://www.spkx.net.cn

HU Shuaifeng, YU Jie, ZHAO Bijie, et al. Effect of antimicrobial ethylene-vinyl alcohol (EVOH) copolymer fi lm based on sorbic acid-loaded chitosan microcapsules on the preservation of snakehead[J]. Food Science, 2017, 38(15): 237-243. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201715038. http://www.spkx.net.cn

2016-06-30

上海市教育委員會(huì)科研創(chuàng)新項(xiàng)目（14YZ120）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2012AA0992301）

戶帥鋒（1989—），男，碩士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品貯藏加工及食品包裝技術(shù)。E-mail：hu983179529@163.com

*通信作者：李立（1977—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒b材料與工藝。E-mail：l-li@shou.edu.cn