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      小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對血管內(nèi)皮祖細(xì)胞分化潛能的影響

      2017-09-03 10:27:28葛權(quán)虎吳向未程文哲萬龍飛王小義趙伯文
      山東醫(yī)藥 2017年28期
      關(guān)鍵詞:共培養(yǎng)培養(yǎng)液內(nèi)皮

      葛權(quán)虎,吳向未,2,程文哲,萬龍飛,王小義,趙伯文

      (1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,新疆石河子832008;2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

      小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對血管內(nèi)皮祖細(xì)胞分化潛能的影響

      葛權(quán)虎1,吳向未1,2,程文哲1,萬龍飛1,王小義1,趙伯文1

      (1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,新疆石河子832008;2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

      目的 探討小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)對血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)向內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)分化的影響。方法 分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增小鼠骨髓MSCs和EPCs。取5×105個EPCs接種于含5% FBS的EBM-2培養(yǎng)液,置于Transwel下室(對照組);取5×105個EPCs接種于含5% FBS的EBM-2+20 ng/mL血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的培養(yǎng)液,置于Transwell下室(VEGF組);取5×105個MSCs接種于Transwell insert膜上、5×105個EPCs接種于Transwell下室(共培養(yǎng)組),培養(yǎng)液同對照組。培養(yǎng)48 h,收集各組下室EPCs,采用RT-PCR法檢測內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)和激酶插入結(jié)構(gòu)域受體(KDR)mRNA表達(dá);ELISA法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清VEGF含量。提取MSC條件培養(yǎng)基(MSCCM)及LG-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基,ELISA法檢測VEGF含量。取傳3代EPCs,分別用LG-DMEM、MSCCM、MSCCM+IgG、MSCCM+VEGF抗體的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h(分別設(shè)為LG-DMEM組、MSCCM組、MSCCM+IgG組、MSCCM+VEGF抗體組),收集細(xì)胞,采用RT-PCR法檢測各組eNOS、KDR mRNA表達(dá)。結(jié)果 共培養(yǎng)組eNOS、KDR mRNA相對表達(dá)量明顯高于對照組和VEGF組(P<0.05或<0.01);共培養(yǎng)組、VEGF組培養(yǎng)液上清VEGF含量均明顯高于對照組(P均<0.01)。MSCCM中VEGF含量較LG-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基明顯增加(P<0.01)。MSCCM組和MSCCM+IgG組eNOS、KDR mRNA相對表達(dá)量較LG-DMEM組、MSCCM+VEGF抗體組均明顯增加(P均<0.01)。結(jié)論 小鼠骨髓MSCs可能通過旁分泌VEGF促進(jìn)血管EPCs向ECs分化。

      骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;血管內(nèi)皮祖細(xì)胞;內(nèi)皮細(xì)胞;細(xì)胞分化;血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子

      近年來,以干細(xì)胞為主的細(xì)胞療法在缺血性疾病的治療方面取得了顯著進(jìn)展[1~3]。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)主要存在于骨髓,在某些情況下可被動員到外周血,分化為內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)并歸巢到靶組織,參與血管生成和組織修復(fù)[4]。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)主要來源于骨髓的非造血成體干細(xì)胞,具有自我更新和多向分化潛能[5,6]。目前,學(xué)者們在干細(xì)胞移植時大多選擇單一移植EPCs或MSCs,尚無同時移植兩種細(xì)胞的先例。而EPCs/MSCs分化受多種因素的影響[7],一種細(xì)胞是否會影響另一種細(xì)胞的分化能力甚至是生物學(xué)行為,尚不清楚。2015年12月~2016年9月,本研究通過共培養(yǎng)小鼠MSCs和EPCs,用MSCs條件培養(yǎng)基(MSCCM)誘導(dǎo)EPCs,并用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)抗體中和MSCCM,同時檢測誘導(dǎo)細(xì)胞分化的內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志基因內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)和激酶插入結(jié)構(gòu)域受體(KDR)表達(dá)情況,旨在探討MSCs對EPCs分化的影響。

      1 材料與方法

      1.1 材料 C57BL/6小鼠24只,SPF級,雌雄不限,4~6周齡,體質(zhì)量18~22 g,購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,動物合格證號:SCXK(新)2011- 0003。低糖DMEM、胰蛋白酶,美國Gibco公司;EBM-2、EGM-2MV,美國Lonza公司;FBS,美國Hyclone公司。VEGF,美國Peprotech公司。TRIzol Reagent,美國Invitrogen公司;cDNA合成試劑盒,美國Thermo公司;熒光定量PCR試劑盒,美國Qiagen公司;VEGF ELISA試劑盒,武漢伊萊瑞特生物科技有限公司;VEGF抗體,美國Abcam公司;小鼠IgG,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Transwell小室,美國康寧公司。PCR儀,美國Thermo公司。

      1.2 MSCs、EPCs分離培養(yǎng) 參照本課題組前期研究方法[8,9]。①MSCs分離培養(yǎng):隨機(jī)選取1只C57BL/6小鼠,10%水合氯醛麻醉,頸椎脫臼法處死,乙醇消毒后置于超凈臺上,無菌條件下取出雙側(cè)股骨和脛骨,剔除兩端骨質(zhì)。用無菌注射器取MSCs培養(yǎng)基約5 mL(含10% FBS的LG-DMEM),立即更換1 mL無菌注射器針頭,反復(fù)沖洗骨髓腔,直至骨髓腔變?yōu)榘咨_洗出的骨髓液吹打均勻后接種于60 mm的無菌培養(yǎng)皿中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,PBS清洗2次,去除懸液中未貼壁細(xì)胞,同時加入新鮮配制的LG-DMEM培養(yǎng)基3 mL,隔日換液。待細(xì)胞生長至80%~90%融合時,棄去培養(yǎng)基,加入含0.25% EDTA的胰蛋白酶1 mL消化,顯微鏡下可見細(xì)胞回縮變圓、細(xì)胞間隙出現(xiàn)時,用含血清的培養(yǎng)基終止消化,用移液槍輕輕吹打,直至培養(yǎng)皿上大部分細(xì)胞脫落。收集細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min,棄去上清液,用1 mL完全LG-DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液均勻接種至2個新培養(yǎng)皿中,按1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng),取傳3代細(xì)胞用于后續(xù)研究。②EPCs分離培養(yǎng):小鼠處理及骨髓細(xì)胞提取方法同MSCs。骨髓細(xì)胞培養(yǎng)48 h首次換液時,收集未貼壁細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min,EGM-2重懸細(xì)胞,均勻接種于預(yù)先包被有人纖維連接蛋白的60 mm無菌細(xì)胞培養(yǎng)皿中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,PBS浸洗2遍,加入EPCs培養(yǎng)基,隔天換液。其余步驟同MSCs。

      1.3 細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)建立及ECs分化能力鑒定 ①細(xì)胞分組培養(yǎng):將傳3代MSCs和EPCs消化計數(shù),取5×105個EPCs接種于含5% FBS的EBM-2培養(yǎng)液,置于Transwell下室(對照組);取5×105個EPCs接種于含5% FBS的EBM-2+20 ng/mL VEGF的培養(yǎng)液,置于Transwell下室(VEGF組);取5×105個MSCs接種于Transwell insert膜上、5×105個EPCs接種于Transwell下室(共培養(yǎng)組),培養(yǎng)液同對照組。三組均置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。②eNOS、KDR mRNA表達(dá)檢測:采用RT-PCR法。收集各組下室EPCs。采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA,按第一鏈cDNA合成試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計、合成。引物序列:eNOS上游引物:5′-CATCACCTACGACACCCTCA-3′,下游引物:5′-CGGCTCTGTAACTTCCTTGG-3′;KDR上游引物:5′-TGCCTACCTCACCTGTTTCC-3′,下游引物:5′-CGGCTCTTTCGCTTACTGTT-3′;β-actin上游引物:5′-TTCCTTCTTGGGTATGGAAT-3′,下游引物:5′-GAGCAATGATCTTGATCTTC-3′。PCR反應(yīng)體系共20 μL:2×SybrGreen qPCR Master Mix混合物10 μL,上下游引物各1 μL,cDNA 3 μL,無酶水 5 μL;PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性15 s、55 ℃退火延伸30 s共40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達(dá)量。③VEGF含量:采用ELISA法。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液,3 000 r/min 離心10 min,留取上清液。將待測樣品與VEGF標(biāo)準(zhǔn)品加入包被有VEGF抗體的96孔板中,37 ℃孵育1 h;加入100 μL檢測溶液A,37 ℃孵育1 h;加入100 μL檢測溶液B,37 ℃孵育1 h;然后加入底物溶液90 μL,37 ℃避光顯色15~20 min。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品孔呈現(xiàn)明顯梯度藍(lán)色時,加入終止液50 μL終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測各孔光密度(OD)值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算待測樣本VEGF含量。

      1.4 MSCCM提取及其VEGF含量檢測 取傳3代MSCs消化計數(shù),接種于6孔板(含10% FBS的LG-DMEM),每孔1×106個,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,更換為2.5 mL無血清和生長因子的LG-DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,提取上清,3 000 r/min離心10 min,留取上清液,即為MSCCM。以LG-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基作空白對照。采用ELISA法檢測MSCCM以及LG-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中VEGF含量。具體步驟參照1.3。

      1.5 MSCCM對EPCs分化影響的觀察 取傳3代EPCs消化計數(shù),接種于6孔板(內(nèi)含10% FBS的LG-DMEM),每孔5×105個,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,分別更換為2 mL LG-DMEM、MSCCM、MSCCM+IgG(100 ng/mL)、MSCCM+VEGF抗體(100 ng/mL)的培養(yǎng)液,分別設(shè)為LG-DMEM組、MSCCM組、MSCCM+IgG組、MSCCM+VEGF抗體組,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集各組EPCs,采用RT-PCR法檢測eNOS、KDR mRNA表達(dá)。具體步驟參照1.3。

      2 結(jié)果

      2.1 各組細(xì)胞eNOS、KDR mRNA表達(dá)及VEGF含量比較 見表1。

      表1 各組細(xì)胞eNOS、KDR mRNA相對表達(dá)量及VEGF含量比較

      注:與對照組比較,*P<0.05,#P<0.01。

      2.2 MSCCM及LG-DMEM中VEGF含量比較 MSCCM中VEGF含量為(166.03±11.09)pg/mL,LG-DMEM中為(11.77±3.04)pg/mL,二者比較P<0.01。

      2.3 MSCCM對EPCs向ECs分化的影響 見表2。

      表2 各組MSCCM刺激EPCs后細(xì)胞eNOS、KDRmRNA相對表達(dá)量比較

      注:與LG-DMEM組比較,*P<0.01;與MSCCM組比較,#P<0.05;與MSCCM+IgG組比較,△P<0.05。

      3 討論

      有研究報道, EPCs能夠直接參與血管新生,或間接分化為ECs參與血管新生和組織修復(fù)[10]。過去幾十年,干細(xì)胞移植在治療缺血性疾病方面已取得了顯著進(jìn)展[11,12]。但干細(xì)胞的生物學(xué)行為易受多種因素影響,其生長環(huán)境改變后生物學(xué)行為是否會發(fā)生變化,目前尚不清楚。

      本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),MSCs和EPCs在體內(nèi)外均具有高度黏附性[13,14]。惡性腫瘤患者放療后出現(xiàn)的骨損傷,屬難治性創(chuàng)傷,治療較為棘手。Cao等[15]對小鼠股骨遠(yuǎn)端局部放射,徹底破壞放射部位骨髓組織后分別局部單純注射EPCs或MSCs和二者聯(lián)合注射,以重建骨髓微環(huán)境;結(jié)果發(fā)現(xiàn),單純注射EPCs或MSCs 3個月,骨髓內(nèi)無血管新生,而二者聯(lián)合注射血管新生良好。由此推測,骨髓血管重建需要MSCs和EPCs共同作用實現(xiàn),二者可能存在協(xié)同作用。但其相互作用機(jī)制鮮見報道。

      VEGF在細(xì)胞增殖和分化中扮演重要角色。李鵬等[16]研究發(fā)現(xiàn),在體外VEGF可誘導(dǎo)人臍帶MSCs向內(nèi)皮樣細(xì)胞分化。楊書強等[17]研究表明,人骨髓MSCs在VEGF的誘導(dǎo)下可定向分化為ECs,并保持干細(xì)胞的增殖能力。謝安明等[18]研究發(fā)現(xiàn),EPCs與VEGF均參與增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管的形成,二者可能具有協(xié)同作用。VEGF能促進(jìn)EPCs血管新生和內(nèi)皮化,這有可能為慢性缺血性心臟病和肢體缺血病提供一種新的治療方法[19]。有研究還發(fā)現(xiàn),MSCs和ECs共培養(yǎng)可生成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu),而介導(dǎo)MSCs和ECs相互作用的關(guān)鍵分子正是VEGF[20]。由此可見,VEGF在細(xì)胞分化以及介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用的過程中具有重要作用。本研究結(jié)果顯示,MSCs與EPCs共培養(yǎng)后,內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志基因eNOS、KDR mRNA相對表達(dá)量顯著增加,說明MSCs可促進(jìn)EPCs向ECs分化;同時,共培養(yǎng)體系中VEGF含量較對照組明顯升高,且MSCCM中VEGF含量亦高于LG-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)中,提示MSCs分泌的VEGF可能對共培養(yǎng)體系EPCs的分化起作用。本研究用MSCCM刺激EPCs發(fā)現(xiàn),MSCCM組eNOS、KDR mRNA相對表達(dá)量顯著增加;添加VEGF抗體中和后再次驗證發(fā)現(xiàn),MSCCM+VEGF抗體組eNOS、KDR mRNA相對表達(dá)量較MSCCM組明顯降低。證實MSCs分泌的VEGF可影響EPCs的分化。

      VEGF可能只是MSCs分泌的眾多參與EPCs分化的細(xì)胞因子之一。盡管本研究共培養(yǎng)組和VEGF組中VEGF含量比較無統(tǒng)計學(xué)差異,但共培養(yǎng)組內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志基因eNOS、KDR mRNA表達(dá)卻明顯高于VEGF組;而且中和MSCCM中的VEGF后,也只能部分削弱MSCCM對EPCs分化的影響。這說明可能存在其他旁分泌的細(xì)胞因子,而這些細(xì)胞因子對EPCs的分化可能與VEGF具有協(xié)同作用。Guo等[21]研究發(fā)現(xiàn),CD34+來源的EPCs能分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞,而這種分化過程依賴于堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和血小板衍生生長因子。Gnecchi等[22]研究發(fā)現(xiàn),MSCs可分泌包括VEGF和bFGF在內(nèi)的多種細(xì)胞因子,而這些細(xì)胞因子對血管損傷修復(fù)和血管再生具有促進(jìn)作用。這或許可解釋為何VEGF抗體只能部分削弱MSCCM對EPCs分化的影響。

      綜上所述,MSCs可能通過旁分泌VEGF促進(jìn)EPCs向ECs分化,但其具體機(jī)制尚未完全明確。本研究僅是初步的體外實驗,體內(nèi)實驗尚未開展,今后我們將進(jìn)一步研究MSCs調(diào)節(jié)EPCs分化的機(jī)制,為將來其臨床用于組織修復(fù)與血管重建提供依據(jù)。

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      Effect of mesenchymal stem cells on differentiation potential of blood endothelial progenitor cells

      GEQuanhu1,WUXiangwei,CHENGWenzhe,WANLongfei,WANGXiaoyi,ZHAOBowen

      (1TheFirstAffiliatedHospitalofShiheziUniversitySchoolofMedicine,Shihezi832008,China)

      Objective To investigate the effect of mesenchymal stem cells (MSCs) on the differentiation of endothelial progenitor cells (EPCs) into endothelial cells (ECs). Methods MSCs and EPCs were isolated, cultured, and amplified from murine bone marrow in vitro. MSCs and EPCs were cultured in Transwell co-culture system. The experiment was totally divided into three groups, EPCs cultured group (control group), co-culture group, and vascular endothelial growth factor group (VEGF group). After being cultured for 48 h, EPCs were collected and the expression of the specific markers of eNOS and KDR was measured by RT-PCR; the expression of VEGF in the culture medium of each group was detected by ELISA. MSC conditioned medium (MSCCM) was collected. EPCs which were at passage 3 were cultured in the medium of LG-DMEM, MSCCM, MSCCM+IgG, MSCCM+VEGF neutralizing antibody (Anti-VEGF), respectively, which were taken as the following four groups, LG-DMEM group, MSCCM group, MSCCM+IgG group, and MSCCM+Anti-VEGF group. After being cultured for 48 h, EPCs were collected and the expression of eNOS and KDR was measured by RT-PCR. Results The mRNA expression of the specific markers was significantly higher in the co-culture group and VEGF group than that in the control group (P<0.05 or <0.01). The expression of VEGF in the co-culture group and VEGF group was significantly increased as compared with that of the control group (P<0.01). The mRNA expression of the specific markers in the MSCCM group and MSCCM+IgG group was significantly higher than that of the LG-DMEM group and MSCCM+Anti-VEGF group (P<0.01). Conclusion MSCs can promote the differentiation of EPCs into ECs through paracrine factors such as VEGF.

      mesenchymal stem cells; endothelial progenitor cells; endothelial cells; cell differentiation; vascular endothelial growth factor

      國家自然科學(xué)基金資助項目(31271458)。

      葛權(quán)虎(1990-),男,碩士在讀,研究方向為肝膽外科疾病的基礎(chǔ)與臨床。E-mail: 282651595@qq.com

      吳向未(1973-),男、主任醫(yī)師、博士生導(dǎo)師,研究方向肝膽外科疾病的基礎(chǔ)與臨床。E-mail: wxwshz@126.com

      10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.28.004

      R329.2

      A

      1002- 266X(2017)28- 0012- 04

      2016-11- 04)

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