CD147對前列腺癌細胞雄激素受體磷酸化的影響及其作用機制

方芳，趙臣，郝峰，王立國

(吉林醫(yī)藥學院檢驗學院，吉林吉林132013)

CD147對前列腺癌細胞雄激素受體磷酸化的影響及其作用機制

方芳，趙臣，郝峰，王立國

(吉林醫(yī)藥學院檢驗學院，吉林吉林132013)

目的 探討白細胞分化抗原(CD147)對前列腺癌細胞雄激素受體(AR)磷酸化的影響及其作用機制。方法 選擇前列腺癌LNCaP細胞，隨機分為LNCaP/Scramble組、LNCaP/shCD147組，分別感染陰性對照病毒、CD147 RNA干擾病毒，采用Western blotting法檢測沉默CD147表達效率。收集兩組細胞，加或不加磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路抑制劑LY294002處理，采用Western blotting法檢測磷酸化AKT(p-AKT)、磷酸化AR(p-AR)和前列腺特異性抗原(PSA)表達。結果 LNCaP/Scramble組CD147相對表達量為1.19±0.09，LNCaP/shCD147組為0.71±0.03，兩組比較P<0.01。與LNCaP/Scramble組比較，LNCaP/shCD147組p-AKT、p-AR和PSA相對表達量均明顯降低(P均<0.05)；加入PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002處理后，LNCaP/shCD147組p-AKT、p-AR和PSA相對表達量進一步下降(P均<0.05)。結論 沉默CD147可降低AR磷酸化水平,其機制可能與影響PI3K/AKT信號通路有關。

前列腺癌；白細胞分化抗原；磷酸化雄激素受體；磷酸化蛋白激酶B；前列腺特異性抗原

近年來，我國前列腺癌的發(fā)病率逐年升高[1]。前列腺癌的早期癥狀不明顯，甚至沒有任何癥狀，多數(shù)患者就診時病情已至中晚期，失去根治性手術機會。針對雄激素-雄激素受體(AR)的雄激素剝奪療法(ADT)是目前治療中晚期前列腺癌的主要方法，但術后2～3年雄激素依賴性前列腺癌(ADPC)可轉(zhuǎn)化為去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)。此時，ADT不再有效，可出現(xiàn)腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移，患者平均生存時間多不足2年[2]。研究發(fā)現(xiàn)，有轉(zhuǎn)錄活性的AR在CRPC細胞內(nèi)廣泛表達，且在CRPC的發(fā)展過程中具有關鍵作用[3]。因此，發(fā)現(xiàn)促進AR轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)分子對前列腺癌的治療具有重要意義。CD147是一種跨膜糖蛋白，屬于IgSF成員，在多種惡性腫瘤細胞中表達升高，具有促進腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，CD147與前列腺癌的治療反應和預后密切相關[5]，但其對AR活性的影響目前尚不清楚。2015年12月～2016年5月，本研究探討沉默前列腺癌細胞CD147表達對AR磷酸化的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 前列腺癌LNCaP細胞，由中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供。CD147 RNA干擾慢病毒、陰性對照病毒，上海吉凱基因化學技術有限公司。倒置顯微鏡，上海醫(yī)用分析儀器廠；電泳槽和轉(zhuǎn)膜儀，美國Bio-Rad公司；RPMI 1640培養(yǎng)液，美國Gibco公司；FBS，美國HyClone公司；RIPA裂解液、PMSF和BCA蛋白定量試劑盒，南京碧云天生物技術有限公司；兔抗CD147、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化AR(p-AR)、前列腺特異性抗原(PSA)、β-actin抗體和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信號通路抑制LY294002，美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG，北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及CD147基因沉默 取LNCaP細胞接種于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，當細胞生長至80%以上融合時傳代。取傳3代細胞，胰酶消化后計數(shù)，吹打成單細胞懸液，接種于6孔板，每孔2 mL(含1×106個細胞)，混勻后置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隨機將細胞分為LNCaP/Scramble組、LNCaP/shCD147組，當細胞生長至約50%融合時，分別加入1∶20倍稀釋的陰性對照病毒、CD147 RNA干擾病毒，同時加入適量凝聚胺，使其終濃度為5 μg/mL，培養(yǎng)24 h更換為正常培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3 沉默CD147表達效率檢測 采用Western blotting法。收集兩組細胞，加入RIPA裂解液，反復吹打，充分裂解，12 000×g離心15 min，取上清，BCA法進行蛋白定量。將蛋白裂解液加入上樣緩沖液，加熱變性；取蛋白樣品30 μg行SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)印至醋酸纖維素膜上，4 ℃、50 g/L脫脂奶粉封閉2 h；然后加入兔抗CD147(1∶3 000)和β-actin抗體(1∶3 000)，4 ℃孵育過夜；次日TBST洗膜，加入HRP標記的山羊抗兔抗體(1∶3 000)室溫避光孵育2 h；TBST洗膜，ECL發(fā)光顯影。采用Quantity One軟件分析各蛋白電泳條帶的灰度值。

1.4 p-AR、p-AKT和PSA表達檢測 采用Western blotting法。收集兩組細胞，分別置于含或不含20 μmol/L LY294002的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，加入RIPA裂解液，反復吹打，充分裂解，12 000×g離心15 min，取上清，BCA法進行蛋白定量。將蛋白裂解液加入上樣緩沖液，加熱變性；取蛋白樣品30 μg行SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)印至醋酸纖維素膜上，4 ℃、50 g/L脫脂奶粉封閉2 h；分別加入兔抗p-AR(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)、PSA抗體(1∶1 000)和β-actin 抗體(1∶3 000)，4 ℃孵育過夜；次日TBST洗膜，加入HRP標記的山羊抗兔抗體(1∶3 000)室溫避光孵育2 h；TBST洗膜，ECL發(fā)光顯影。采用Quantity One軟件分析各蛋白電泳條帶的灰度值。

2 結果

2.1 兩組CD147表達比較 LNCaP/Scramble組CD147相對表達量為1.19±0.09，LNCaP/shCD147組為0.71±0.03，兩組比較P<0.01。

2.2 兩組p-AR、p-AKT表達比較 見表1。

表1 兩組有或無LY294002時p-AR、p-AKT相對表達量比較

注：與LNCaP/Scramble組比較，*P<0.05；與同組無LY294002比較，#P<0.05。

2.3 兩組PSA表達比較 見表2。

表2 兩組有或無LY294002時PSA相對表達量比較

注：與LNCaP/Scramble組比較，*P<0.05；與同組無LY294002比較，#P<0.05。

3 討論

前列腺癌具有雄激素依賴性，雄激素與AR結合后，能將活化信號傳導至細胞核內(nèi)，繼而促進腫瘤細胞生長。ADT是目前前列腺癌的主要治療手段，但幾乎所有患者最終會對該療法產(chǎn)生抗性而失效。

有研究認為，大部分CRPC細胞可通過AR基因擴增、AR基因活性增強和AR敏感性升高等方式，導致AR能夠在去勢治療后被體內(nèi)低濃度的雄激素激活，從而維持前列腺癌細胞的生長和增殖[6,7]。AR存在多種翻譯后修飾方式，如磷酸化、乙?；头核鼗龋@些修飾方式對AR的轉(zhuǎn)錄活性具有不同的調(diào)控作用[8]。磷酸化是目前研究較多的一種AR修飾和調(diào)控方式。當AR絲氨酸第80、93、641位點發(fā)生磷酸化時，其處于穩(wěn)定狀態(tài)并能抵抗蛋白酶解作用；而當磷酸化發(fā)生在絲氨酸第213、506、650位點時，AR的轉(zhuǎn)錄被活化，可促進腫瘤細胞生長[9,10]。因此，研究影響AR磷酸化的因素及其磷酸化位點非常重要。

PI3K作為聯(lián)系細胞外信號與細胞應答效應的橋梁分子，在一些上游分子的作用下活化，進而募集和激活下游靶分子，啟動一系列信號級聯(lián)反應。絲氨酸、蘇氨酸激酶是PI3K下游的靶分子之一。PI3K/AKT信號通路的過度激活在腫瘤細胞中普遍存在，活化的腫瘤細胞往往表現(xiàn)出抗凋亡和增殖活躍[11]。最近有研究表明，PI3K/AKT信號通路與AR信號通路的相互作用是CRPC發(fā)生、發(fā)展的重要分子機制。AKT能夠?qū)е翧R在第213位點的絲氨酸磷酸化。當AR磷酸化發(fā)生在絲氨酸第213位點時，AR的轉(zhuǎn)錄被活化，繼而促進腫瘤細胞增殖[12，13]。CD147在前列腺癌細胞中高表達，并與前列腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CD147能夠活化PI3K/AKT信號通路，抑制饑餓誘導的前列腺癌細胞自噬性死亡[14]。本研究通過RNAi技術沉默前列腺癌LNCaP細胞中CD147表達，并觀察了細胞中p-AKT、p-AR表達變化；結果顯示，LNCaP/shCD147組p-AKT、p-AR相對表達量明顯低于LNCaP/Scramble組。提示CD147可能通過PI3K/AKT信號通路導致AR磷酸化。利用PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002作用于兩組細胞，結果發(fā)現(xiàn)，加入PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002后，LNCaP/shCD147組p-AKT、p-AR相對表達量進一步降低。進一步證實，CD147可能通過PI3K/AKT信號通路導致AR磷酸化。

前列腺癌是一種雄激素依賴性腫瘤，雄激素彌散到前列腺上皮細胞中，迅速轉(zhuǎn)變?yōu)楦叽x活性的雙氫睪酮，與AR結合后，導致AR構象發(fā)生變化，繼而轉(zhuǎn)移到前列腺癌細胞核內(nèi)，結合在含有雄激素元件的DNA序列上，從而啟動相應基因的轉(zhuǎn)錄。PSA是前列腺癌的特異性標志物，在臨床上PSA是診斷前列腺癌的分子生物學標志物之一[15]。PSA基因啟動子區(qū)含有雄激素應答元件[16]。AR可促進PSA基因的轉(zhuǎn)錄，增加PSA表達。本研究結果顯示，LNCaP/shCD147組PSA相對表達量明顯低于LNCaP/Scramble組，加入PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002后，PSA相對表達量進一步降低。提示沉默CD147表達可抑制PI3K/AKT信號通路，使PSA表達下降。

綜上所述，CD147可能通過PI3K/AKT信號通路導致AR磷酸化，加速前列腺癌進程。

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Effects of CD147 on phosphorylation of AR in prostate cancer cells

FANGFang,ZHAOChen,HAOFeng,WANGLiguo

(CollegeofLaboratory,JilinMedicalUniversity,Jilin132013,China)

Objective To investigate the effects of leukocyte differentiation antigen (CD147) on phosphorylation of androgen receptor (AR) in prostate cancer cells and its mechanism. Methods The prostate cancer LNCaP cells were selected and then were randomly divided into the LNCaP/Scramble group and LNCaP/shCD147 group. LNCaP cells in the above two groups were transfected with the negative control virus and CD147 interference virus, respectively. The CD147 expression was detected by Western blotting. The expression of phosphorylated protein kinase B (p-AKT), phosphorylated androgen receptors (p-AR) and prostate specific antigen (PSA) in cells of the two group treated with or without LY294002 was detected by Western blotting. Results The expression of CD147 in the LNCaP/Scramble group was 1.19±0.09, versus 0.71±0.03 in the LNCaP/shCD147 group (P<0.01). We found that the expression of p-AKT, p-AR, and PSA was decreased in the LNCaP/shCD147 group as compared with that of the LNCaP/Scramble group (allP<0.05). When cells were treated with LY294002 for 24 h, the expression of p-AKT, p-AR, and PSA protein was significantly decreased in the LNCaP/Scramble group (allP<0.05). Conclusion CD147 can cause phosphorylation of AR through PI3K/AKT pathway and then increase PSA expression in prostate cancer, which facilitates prostate cancer progress.

prostate cancer; leukocyte differentiation antigen; phosphorylated androgen receptors; phosphorylated protein kinase B; prostate specific antigen

國家自然科學基金資助項目(81202031)；吉林省科技發(fā)展計劃項目(20130101154JC)。

方芳(1973-)，女，副教授，主要研究方向為前列腺癌的分子生物學機制。E-mail： jillmcfang@163.com

王立國(1971-)，男，主任醫(yī)師，主要研究方向為前列腺癌的分子生物學機制。E-mail： urolancet@sina.com

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.28.003

R737.25

A

1002- 266X(2017)28- 0009- 03

2017- 02-21)