胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)對鏈脲佐菌素所致大鼠胰腺損傷的影響

張琪，鄭陽，楊光華，單雨靜，趙永魁，張博，陳建立，張國志，王長友

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，唐山063000)

胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)對鏈脲佐菌素所致大鼠胰腺損傷的影響

張琪，鄭陽，楊光華，單雨靜，趙永魁，張博，陳建立，張國志，王長友

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，唐山063000)

目的 探討胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)對鏈脲佐菌素(STZ)所致胰島損傷大鼠的影響并探討其機(jī)制。方法 選擇SD大鼠30只，隨機(jī)分為空白對照組、模型組、代謝手術(shù)組各10只。代謝手術(shù)組行改良Roux-en-Y胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)，空白對照組、模型組僅做單純開腹、關(guān)腹處理。手術(shù)7 d后，模型組、代謝手術(shù)組均腹腔注射STZ建立糖尿病模型，空白對照組腹腔注入等量生理鹽水。分別于造模前1天、造模后第7、14天時(shí)抽取各組大鼠空腹尾靜脈血，檢測血糖水平。于造模前1天、造模后2 h、造模后第7、14天時(shí)抽取空腹尾靜脈血，采用ELISA法檢測血漿C肽水平，以評價(jià)胰島損傷情況。于造模前1天、造模后24 h、造模后第7天時(shí)抽取空腹尾靜脈血，采用ELISA法檢測血漿TNF-α水平。于造模第2天時(shí)取胰腺組織，采用Western blotting法檢測凋亡相關(guān)蛋白B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)蛋白X(Bax)、B細(xì)胞淋巴瘤蛋白-2(Bcl2)、C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(CHOP)表達(dá)。結(jié)果 造模后第7、14天時(shí)，模型組血糖高于造模前及同時(shí)間點(diǎn)空白對照組，代謝手術(shù)組血糖低于模型組(P均<0.01)。造模后第7、14天時(shí)，模型組血漿C肽水平均低于造模前及同時(shí)點(diǎn)空白對照組，代謝手術(shù)組血漿C肽水平均低于模型組(P均<0.01)。造模后24 h及第7天時(shí)，模型組血漿TNF-α水平均高于造模前及同時(shí)間點(diǎn)空白對照組，代謝手術(shù)組血漿TNF-α水平均低于模型組(P均<0.01)。與代謝手術(shù)組相比，模型組Bcl2蛋白表達(dá)降低，CHOP、Bax蛋白表達(dá)增高(P均<0.01)。結(jié)論 胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)可減輕STZ導(dǎo)致的大鼠胰腺組織損傷，其機(jī)制可能與減輕胰島細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、抑制胰島細(xì)胞凋亡有關(guān)。

糖尿?。淮x手術(shù)；胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)；鏈脲佐菌素；胰島；凋亡；炎癥

根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，中國糖尿病總?cè)藬?shù)已達(dá)9 000萬，已經(jīng)成為糖尿病患病率最高的國家[1]。目前，我國對于糖尿病的治療方法仍然是依靠降糖藥物及胰島素注射等傳統(tǒng)藥物方式。糖尿病的外科手術(shù)由減肥手術(shù)演變而來[2]，隨后Pories等[3]第一次報(bào)道了代謝手術(shù)治療糖尿病的效果。目前，代謝手術(shù)的應(yīng)用主要包含限制性手術(shù)和胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)兩種手術(shù)方式。前瞻性研究指出，在所有手術(shù)方式中，胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)的治療效果最佳，因此，胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)已被作為代謝手術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)[4]。多個臨床研究表明，采用代謝手術(shù)可使糖尿病患者達(dá)到臨床緩解甚至臨床完全“治愈”，但具體機(jī)制尚不清楚。本課題組在進(jìn)行胰島移植實(shí)驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)，若先行胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)再經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型時(shí)，大鼠胰島的破壞及糖尿病的發(fā)生并沒有預(yù)想中的出現(xiàn)，即使出現(xiàn)也很輕微[5]。因此我們推測，胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)可能對糖尿病大鼠胰島的破壞和功能損傷具有一定的保護(hù)作用，但其是否可用于糖尿病的預(yù)防和治療尚不明確。2016年3～12月，我們對SD大鼠采用改良Roux-en-Y胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)后再經(jīng)腹腔注射STZ，觀察胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)對STZ所致大鼠胰島損傷的影響，探討代謝手術(shù)預(yù)防和治療糖尿病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 SPF級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量250～300 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。鏈脲佐菌素(STZ)購于美國Sigma-Aldrich公司；大鼠C肽酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒及炎性因子TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購于美國Rapidbio公司；B細(xì)胞淋巴瘤蛋白-2(Bcl2)、C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(CHOP)、B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)蛋白X(Bax)單抗購于美國Sigma公司；羊抗兔、羊抗鼠IgG/HRP 及Western 印跡相關(guān)試劑購于北京Solarbio科技有限公司。

1.2 分組及干預(yù)方法 應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將30只大鼠分為3組即空白對照組、模型組、代謝手術(shù)組，每組各10只。代謝手術(shù)組行改良Roux-en-Y胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)[6]。大鼠術(shù)前稱重，按0.2 g/kg水合氯醛腹腔注射麻醉后固定于手術(shù)臺,取上腹部正中切口進(jìn)入腹腔，結(jié)扎幽門后，于Treitz韌帶以遠(yuǎn)10 cm處切斷空腸并結(jié)扎封閉兩斷端，將遠(yuǎn)端空腸與胃做側(cè)側(cè)吻合，近端空腸于胃-空腸吻合口以遠(yuǎn)15 cm處與遠(yuǎn)端空腸做側(cè)側(cè)吻合。術(shù)后當(dāng)天禁食水，術(shù)后第1天喂食糖鹽水，術(shù)后第2天給予腸外營養(yǎng)液，術(shù)后第3天恢復(fù)正常飼養(yǎng)?？瞻讓φ战M、模型組僅做單純開腹、關(guān)腹處理。

1.3 模型制備 手術(shù)7 d后，模型組、代謝手術(shù)組均按60 mg/kg腹腔注射STZ建立糖尿病模型?？瞻讓φ战M腹腔注射等量生理鹽水。

1.4 血糖檢測 分別于造模前1天、造模后第7、14天時(shí)，抽取各組大鼠空腹尾靜脈血，檢測血糖水平。

1.5 血漿C肽水平檢測 分別于造模前1天、造模后2 h、造模后第7、14天時(shí)，抽取各組大鼠空腹尾靜脈血，采用ELISA法檢測血漿C肽水平，以評價(jià)胰島損傷情況。

1.6 血漿TNF-α水平檢測 分別于造模前1天、造模后24 h、造模后第7天時(shí)，抽取各組大鼠空腹尾靜脈血，采用ELISA法檢測血漿TNF-α水平。

1.7 胰腺組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法檢測胰腺組織凋亡相關(guān)蛋白Bcl2、CHOP、Bax表達(dá)。于造模第2天，各組隨機(jī)選取2只大鼠處死，取胰腺組織，組織剪剪碎胰腺組織后上勻漿機(jī)充分研磨，RIPA裂解液充分裂解組織，離心收集蛋白。BCA法定量總蛋白，加入等體積2×蛋白上樣緩沖液后100 ℃變性5 min，-80 ℃保存?zhèn)溆谩＿M(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，行轉(zhuǎn)膜、10%脫脂奶封閉，分別加入Bcl2、CHOP、Bax一抗(1∶1 000)孵育過夜，二抗(1∶100)37 ℃孵育2 h，熒光顯色。Image J軟件分析灰度值。蛋白表達(dá)量=(所測蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值)×100%。

2 結(jié)果

2.1 各組血糖比較 造模后第7、14天時(shí)，模型組血糖高于造模前及同時(shí)間點(diǎn)空白對照組，代謝手術(shù)組血糖低于模型組(P均<0.01)。見表1。

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)血糖比較

注：與空白對照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P<0.01；與代謝手術(shù)組同時(shí)點(diǎn)比較，﹟P<0.01。

2.2 各組血漿C肽水平比較 造模后第7、14天時(shí)，模型組血漿C肽水平均低于造模前及同時(shí)點(diǎn)空白對照組，代謝手術(shù)組血漿C肽水平均低于模型組(P均<0.01)。見表2。

表2 各組不同時(shí)點(diǎn)血漿C肽水平比較

注：與空白對照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P<0.01；與代謝手術(shù)組同時(shí)點(diǎn)比較，﹟P<0.01。

2.3 各組血漿TNF-α水平比較 造模后24 h及第7天時(shí)，模型組血漿TNF-α水平均高于造模前及同時(shí)間點(diǎn)空白對照組，代謝手術(shù)組血漿TNF-α水平均低于模型組(P均<0.01)。

表3 各組不同時(shí)點(diǎn)血漿TNF-α水平比較

注：與空白對照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P<0.01；與代謝手術(shù)組同時(shí)點(diǎn)比較，﹟P<0.01。

2.4 各組胰腺組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與代謝手術(shù)組相比，模型組Bcl2蛋白表達(dá)降低，CHOP、Bax蛋白表達(dá)增高(P均<0.01)。代謝手術(shù)組與空白對照組各蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表4。

表4 各組胰腺組織Bcl2、CHOP、Bax蛋白表達(dá)比較

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與代謝手術(shù)組比較，﹟P<0.01。

3 討論

與過去20年相比，我國糖尿病發(fā)病率已經(jīng)增加了近4倍，其中，2型糖尿病占93.7%[7]。外科干預(yù)治療2型糖尿病是一種新型方案。目前研究顯示，與傳統(tǒng)內(nèi)科治療方法相比，代謝手術(shù)在緩解2型糖尿病、減少并發(fā)癥發(fā)生、控制體質(zhì)量方面具有更明顯的優(yōu)勢[8, 9]。薈萃分析研究顯示[10]，在降低患者血糖水平、減少用藥量、降低并發(fā)癥發(fā)生率等方面，對

圖1 各組Bcl2、CHOP、Bax蛋白表達(dá)比較(Western blotting法)

2型糖尿病患者最有效的手術(shù)方式為胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)。目前，胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)已成為代謝手術(shù)中最有效且常用的手術(shù)方式。代謝手術(shù)方式中的胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)在治療糖尿病上的效果已經(jīng)越來越得到學(xué)術(shù)界專家的認(rèn)可，在臨床上也得到了多次的驗(yàn)證，但是對于胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)治療糖尿病的機(jī)制目前仍不明確。本課題組前期中發(fā)現(xiàn)，先行胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)再經(jīng)腹腔注射STZ時(shí)，大鼠胰島的破壞并不明顯，糖尿病也并未出現(xiàn)，因此推測胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)可能對糖尿病大鼠胰島的破壞和功能損傷具有一定的保護(hù)作用。

目前研究認(rèn)為，代謝手術(shù)治療糖尿病的主要機(jī)制是通過改變胃腸道的解剖結(jié)構(gòu)，使近端消化道分泌的抑制胰島β細(xì)胞功能、產(chǎn)生胰島素抵抗的胰島抑制性激素減少，遠(yuǎn)端消化道分泌的腸促胰島激素增加，進(jìn)而刺激胰島β細(xì)胞對胰島素的分泌和釋放[11, 12]、增強(qiáng)胰島素的敏感性[13]、促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖[14]?？崭寡獫{C肽水平與胰島功能呈正比關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，造模后第7、14天時(shí)，模型組血糖水平均高于造模前及同時(shí)點(diǎn)空白對照組和代謝手術(shù)組，模型組血漿C肽水平均低于造模前及同時(shí)點(diǎn)空白對照組和代謝手術(shù)組，提示代謝手術(shù)對于STZ所致的胰島損傷具有保護(hù)作用，可以提高大鼠胰島功能，保護(hù)胰島細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮降低血糖作用[15]。

炎癥因子和胰島β細(xì)胞凋亡在胰島素抵抗及2型糖尿病發(fā)病機(jī)理中的作用也逐漸受到學(xué)者們的關(guān)注[16～18]。胰島素抵抗和2型糖尿病均呈現(xiàn)出一種慢性低度的炎癥反應(yīng)狀態(tài)，表現(xiàn)為TNF-α等炎性因子水平升高，而TNF-α可通過使胰島β細(xì)胞產(chǎn)生過多的自由基并誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而使之凋亡[19, 20]。研究證實(shí)，代謝手術(shù)后患者炎癥因子水平明顯降低，并且對胰島素抵抗和2型糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的遠(yuǎn)期改善率有益[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，造模后24 h及第7天時(shí)，模型組血漿TNF-α水平高于空白對照組，且代謝手術(shù)組血漿TNF-α水平低于模型組，提示糖尿病大鼠血漿TNF-α水平增高，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，而代謝手術(shù)可以減輕STZ所致的胰島細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動凋亡的重要信號分子，當(dāng)出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)CHOP可被大量激活，進(jìn)而改變Bcl家族成員的表達(dá)，從而啟動細(xì)胞凋亡[22]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠胰腺組織CHOP蛋白的表達(dá)較空白對照組和代謝手術(shù)組增高，提示糖尿病大鼠的胰腺組織存在CHOP介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡活性增強(qiáng)，而代謝手術(shù)可有效干預(yù)CHOP蛋白的表達(dá)，從而改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、減少細(xì)胞凋亡，這可能是代謝手術(shù)保護(hù)胰島損傷的作用機(jī)制之一。另外，代謝手術(shù)組大鼠胰腺組織Bcl2蛋白表達(dá)較模型組顯著升高、Bax蛋白表達(dá)明顯降低，提示代謝手術(shù)可能是通過下調(diào)Bcl2/Bax表達(dá)水平、抑制糖尿病大鼠胰島細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮對胰腺組織的保護(hù)作用。

綜上所述，胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)可減輕STZ導(dǎo)致的大鼠胰腺組織損傷，其機(jī)制可能與減輕胰島細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、抑制胰島細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃項(xiàng)目(20150085)；河北聯(lián)合大學(xué)科學(xué)研究基金項(xiàng)目任務(wù)(Z201427)

王長友(E-mail: fhbj-2004@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.30.009

R587.1

A

1002-266X(2017)30-0033-04

2017-04-03)