慢性應(yīng)激行為與大鼠海馬、前額葉區(qū)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶信號通路激活的關(guān)系研究

王凌霄，王培福，才麗娜，黃 佳，張 晨，彭代輝，方貽儒

·論著·

慢性應(yīng)激行為與大鼠海馬、前額葉區(qū)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶信號通路激活的關(guān)系研究

王凌霄1，王培福1，才麗娜1，黃 佳2，張 晨2，彭代輝2，方貽儒2

目的 探討慢性應(yīng)激行為與大鼠海馬、前額葉區(qū)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號通路激活的關(guān)系。方法 2011年6月—2012年8月將50只成年清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為對照組12只、藥物組12只及應(yīng)激組26只。對照組大鼠不給予任何刺激，藥物組和應(yīng)激組大鼠給予8周應(yīng)激刺激，藥物組大鼠于應(yīng)激刺激第1周開始給予鹽酸氟西汀皮下注射。各組大鼠于造模開始前、造模結(jié)束后1 d進(jìn)行糖水偏好實驗和曠場試驗，應(yīng)激刺激結(jié)束后采用Western bloting法檢測各組大鼠海馬、前額葉區(qū)ERK、磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(P-ERK)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 應(yīng)激刺激過程中共11只大鼠死亡，其中正常對照組2只、藥物組4只、應(yīng)激組5只。根據(jù)糖水偏好實驗結(jié)果將應(yīng)激組大鼠分為應(yīng)激適應(yīng)組(n=6)和應(yīng)激敏感組(n=15)。造模開始前4組大鼠跨格次數(shù)、直立次數(shù)及中心格停留時間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；造模結(jié)束后1 d，藥物組、應(yīng)激適應(yīng)組和應(yīng)激敏感組大鼠跨格次數(shù)、直立次數(shù)少于對照組，中心格停留時間長于對照組(P<0.05)，應(yīng)激敏感組大鼠跨格次數(shù)少于藥物組(P<0.05)。應(yīng)激刺激結(jié)束后，4組大鼠海馬、前額葉區(qū)ERK蛋白相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。應(yīng)激刺激結(jié)束后，應(yīng)激敏感組大鼠海馬及前額葉區(qū)P-ERK蛋白相對表達(dá)量低于藥物組和應(yīng)激適應(yīng)組(P<0.05)，而藥物組和應(yīng)激適應(yīng)組大鼠海馬及前額葉區(qū)P-ERK蛋白相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 慢性應(yīng)激刺激可導(dǎo)致大鼠自主活動水平下降，鹽酸氟西汀可在一定程度上降低慢性應(yīng)激刺激對大鼠自主活動水平的影響，海馬和前額葉區(qū)ERK信號通路激活可能與大鼠應(yīng)激適應(yīng)有關(guān)。

應(yīng)激，心理學(xué)；細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶類；海馬；前額葉區(qū)；大鼠

王凌霄，王培福，才麗娜，等.慢性應(yīng)激行為與大鼠海馬、前額葉區(qū)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶信號通路激活的關(guān)系研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2017，25(7)：57-61.[www.syxnf.net]

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心理應(yīng)激是抑郁癥的主要發(fā)病原因之一。臨床研究顯示，遭受嚴(yán)重創(chuàng)傷后大部分人表現(xiàn)為應(yīng)激適應(yīng)，10%～40%的人表現(xiàn)為應(yīng)激障礙或情緒障礙[1]。應(yīng)激適應(yīng)是指個體在遭受急性或慢性應(yīng)激、創(chuàng)傷時成功適應(yīng)逆境的能力[2]。目前，有關(guān)應(yīng)激適應(yīng)的分子機制研究較少。有研究表明，海馬部位腦源性神經(jīng)生長因子(brain derived neurophic factor，BDNF)水平與大鼠應(yīng)激適應(yīng)有關(guān)，提示神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路可能參與介導(dǎo)應(yīng)激適應(yīng)[3]。

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號通路是BDNF與受體結(jié)合后激活的重要信號通路之一，其在細(xì)胞分裂、增殖、分化、存活及神經(jīng)可塑中具有重要調(diào)節(jié)作用[4]。動物實驗及臨床研究表明，海馬區(qū)ERK信號通路激活與抑郁癥發(fā)病機制及抗抑郁藥物作用機制相關(guān)[5-7]。近期一項研究發(fā)現(xiàn)，抑制腹側(cè)被蓋區(qū)ERK信號通路激活可使大鼠發(fā)生應(yīng)激適應(yīng)，提示特定腦區(qū)的ERK信號通路可能參與調(diào)節(jié)不同應(yīng)激行為[8]。本研究立足于神經(jīng)營養(yǎng)因子失調(diào)假說，旨在探討慢性應(yīng)激行為與大鼠海馬、前額葉區(qū)ERK信號通路激活的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2011年6月—2012年8月選用清潔級雄性Sprague-Dawlwy大鼠50只，由上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物科學(xué)實驗中心提供，入組時體質(zhì)量100～300 g，曠場實驗(觀察大鼠在3 min內(nèi)穿越實驗敞箱的底面塊數(shù)及后肢直立次數(shù)的垂直活動得分)結(jié)果相近，購回后在實驗室動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，維持室溫22.0 ℃，人工明/暗12 h/12 h晝夜節(jié)律(光照時間9：00～21：00)，單籠飼養(yǎng)(鼠籠40 cm×25 cm×20 cm)，自由飲水及攝食。本研究中所有實驗操作遵守《中華人民共和國實驗動物管理條例》及《上海市實驗動物管理條例》。將大鼠隨機分為對照組12只、藥物組12只、應(yīng)激組26只。

1.2 主要試劑和實驗儀器 曠場實驗觀察箱(自制木箱：寬100 cm，高50 cm，底面用黑線劃分為25個10 cm×10 cm的方格)，F(xiàn)ujifilm LAS-3000曝光機(日本)，10%聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜裝置(美國Bio-Rad公司)，NC膜(美國millipore公司)，戊巴比妥(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)，蛋白裂解液(碧云天)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(BCA Protein Assay Kit)，Western電化學(xué)發(fā)光劑(electrogenerated chemiluminescence，ECL)(碧云天)，鼠源性ERK單克隆抗體(Santa Cruz公司)；兔源性磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(P-ERK)1/2單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)，β-actin一抗(美國Cell Signaling公司)，HRP標(biāo)記鼠二抗(碧云天)，HRP標(biāo)記兔二抗(碧云天)。

1.3 實驗方法

1.3.1 建立慢性應(yīng)激模型 根據(jù)KATZ等[9]方法建立慢性應(yīng)激模型。藥物組和應(yīng)激組大鼠均給予8周應(yīng)激刺激，單籠飼養(yǎng)，每天給予以下1或2種刺激：禁水24 h，禁食24 h，濕墊料24 h，強迫游泳5 min，夾尾1 min，斜籠24 h，光照24 h；藥物組大鼠于應(yīng)激刺激第1周開始給予鹽酸氟西汀10 mg/g皮下注射，持續(xù)治療8周；對照組大鼠不給予任何刺激。

1.3.2 曠場實驗 各組大鼠于造模開始前、造模結(jié)束后1 d進(jìn)行曠場實驗，具體步驟如下：依次將每只大鼠輕放入箱子中心格中觀察其5 min內(nèi)的自主活動，記錄跨格次數(shù)、直立次數(shù)、中心格停留時間。實驗結(jié)束后用酒精棉球擦拭箱子去除氣味。

1.3.3 糖水偏好實驗[3]各組大鼠于造模開始前、造模結(jié)束后1 d進(jìn)行糖水偏好實驗，具體步驟如下：實驗開始前給予大鼠斷水?dāng)嗉Z24 h(9：00～次日9：00)，每籠給予1瓶純水和1瓶1%蔗糖水，實驗前稱重，放置籠上1 h后再次稱重，1 h內(nèi)兩個水瓶位置隨機變換，實驗結(jié)束后計算糖水偏愛率，糖水偏愛率=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。其中以糖水偏愛率<基線值40%定義為應(yīng)激敏感，以糖水偏愛率≥基線值40%定義為應(yīng)激適應(yīng)。

1.3.4 Western bloting法 糖水偏好實驗結(jié)束后立即斷頭處死大鼠，快速分離海馬及前額葉皮質(zhì)，采用蛋白裂解液提取蛋白，儲存于-80 ℃冰箱中。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白水平，10%PAGE凝膠電泳分離樣品蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC膜，封閉液室溫封閉1 h，采用含0.5%Tween-20的Tris緩沖鹽(TBST)洗膜5 min×3次。加入鼠源性ERK單克隆抗體、兔源性P-ERK1/2單克隆抗體，4 ℃搖晃過夜，TBST洗膜5 min×3次。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體孵育，室溫1 h，TBST洗膜5 min×3次。加入Western ECL，LAS-3000曝光機顯影。使用Quantity one軟件計算蛋白條帶灰度值，將對照組蛋白條帶灰度值作為參考，分別計算藥物組、應(yīng)激敏感組、應(yīng)激適應(yīng)組大鼠海馬和前額葉區(qū)ERK及P-ERK蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 實驗結(jié)果 應(yīng)激刺激過程中共11只大鼠死亡，其中對照組2只、藥物組4只、應(yīng)激組5只。根據(jù)糖水偏好實驗結(jié)果將應(yīng)激組大鼠分為應(yīng)激適應(yīng)組(n=6)和應(yīng)激敏感組(n=15)。

2.2 曠場實驗結(jié)果 造模開始前4組大鼠跨格次數(shù)、直立次數(shù)及中心格停留時間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模結(jié)束后1 d 4組大鼠跨格次數(shù)、直立次數(shù)及中心格停留時間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中藥物組、應(yīng)激適應(yīng)組、應(yīng)激敏感組大鼠跨格次數(shù)和直立次數(shù)少于對照組，中心格停留時間長于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；應(yīng)激敏感組大鼠跨格次數(shù)少于藥物組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.3 大鼠海馬及前額葉區(qū)ERK蛋白表達(dá)情況 應(yīng)激刺激結(jié)束后，4組大鼠海馬、前額葉區(qū)ERK蛋白相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

Table 2 Comparison of relative quantity expression of ERK protein in hippocampus and prefrontal cortex among the four groups of rats

組別只數(shù)海馬區(qū)ERK蛋白相對表達(dá)量前額葉區(qū)ERK蛋白相對表達(dá)量對照組101.001.00藥物組81.06±0.120.83±0.21應(yīng)激適應(yīng)組61.20±0.200.72±0.04應(yīng)激敏感組150.94±0.060.93±0.01F值2.541.87P值>0.05>0.05

注：ERK=細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶

表1 4組大鼠造模前后曠場實驗結(jié)果比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與藥物組比較，bP<0.05

2.4 大鼠海馬及前額葉區(qū)P-ERK蛋白表達(dá)情況 應(yīng)激刺激結(jié)束后，4組大鼠海馬及前額葉區(qū)P-ERK蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中應(yīng)激敏感組大鼠海馬及前額葉區(qū)P-ERK蛋白相對表達(dá)量低于藥物組和應(yīng)激適應(yīng)組(P<0.05)；藥物組和應(yīng)激適應(yīng)組大鼠海馬及前額葉區(qū)P-ERK蛋白相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表3、圖1)。

Table 3 Comparison of relative quantity expression of P-ERK protein in hippocampus and prefrontal cortex among the four groups of rats

組別只數(shù)海馬區(qū)P-ERK蛋白相對表達(dá)量前額葉區(qū)P-ERK蛋白相對表達(dá)量對照組101.001.00藥物組81.33±0.13a1.05±0.60a應(yīng)激適應(yīng)組61.02±0.11a0.91±0.30a應(yīng)激敏感組150.69±0.080.60±0.15F值3.330.85P值<0.05<0.05

注：P-ERK=磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶；與應(yīng)激敏感組比較，aP<0.05

注：P-ERK=磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶

圖1 4組大鼠海馬和前額葉區(qū)P-ERK蛋白電泳圖

Figure 1 Electrophoretogram of P-ERK protein in hippocampus and prefrontal cortex of the four groups of rats

3 討論

目前，有關(guān)個體應(yīng)激適應(yīng)能力的相關(guān)研究主要針對抵抗應(yīng)激能力的社會心理因素，如積極情緒、自我調(diào)節(jié)能力、社會競爭力等[10]。近年來，應(yīng)激適應(yīng)的生物學(xué)機制逐漸引起臨床關(guān)注。本研究通過檢測不同應(yīng)激行為大鼠海馬及前額葉區(qū)ERK信號通路表達(dá)情況，旨在探討不同應(yīng)激反應(yīng)的生物學(xué)機制。

糖水偏好實驗是檢測實驗動物興趣度減退程度的臨床實驗，曠場實驗是檢測實驗動物自主活動水平的臨床實驗[11-12]。本研究結(jié)果顯示，藥物組、應(yīng)激適應(yīng)組及應(yīng)激敏感組大鼠跨格次數(shù)、直立次數(shù)少于對照組，中心格停留時間長于對照組，提示慢性應(yīng)激刺激可導(dǎo)致大鼠自主活動水平下降，與KRISHNAN等[13]研究結(jié)果相一致。

目前，關(guān)于抑郁癥動物模型ERK蛋白表達(dá)情況的研究結(jié)果存在分歧。有研究結(jié)果顯示，慢性應(yīng)激動物模型及抑郁癥患者腦組織ERK蛋白水平下降[14-16]；也有研究結(jié)果顯示，慢性強迫游泳刺激大鼠和對照大鼠海馬區(qū)ERK蛋白水平間無差異[17]，分析各研究結(jié)果間存在差異的可能原因為應(yīng)激種類、應(yīng)激強度及應(yīng)激持續(xù)時間不同。本研究結(jié)果顯示，4組大鼠海馬和前額葉區(qū)ERK蛋白相對表達(dá)量間無差異，提示海馬和前額葉區(qū)ERK蛋白表達(dá)與慢性應(yīng)激行為無關(guān)。

大量研究證實，慢性應(yīng)激刺激可抑制抑郁癥大鼠海馬、前額葉區(qū)ERK信號通路激活[16]，表明局部腦組織ERK信號通路激活抑制可能與抑郁癥發(fā)病機制有關(guān)。目前，關(guān)于應(yīng)激適應(yīng)大鼠ERK信號通路激活的研究報道較少。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)激敏感組大鼠海馬、前額葉區(qū)P-ERK蛋白相對表達(dá)量低于應(yīng)激適應(yīng)組，提示海馬、前額葉區(qū)ERK信號通路激活可能參與調(diào)控不同慢性應(yīng)激行為。ERK蛋白磷酸化通過激酶級聯(lián)途徑可激活一系列下游轉(zhuǎn)錄因子，如環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cyclic-AMP-responsive element-binding protein，CREB)，CREB激活后與靶基因結(jié)合可導(dǎo)致BDNF表達(dá)增加，進(jìn)而參與神經(jīng)再生或神經(jīng)可塑性的調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激適應(yīng)大鼠海馬區(qū)BDNF mRNA表達(dá)水平高于慢性應(yīng)激敏感大鼠[3]；大鼠海馬齒狀回處BDNF過度表達(dá)可表現(xiàn)出應(yīng)激適應(yīng)行為和抗抑郁效應(yīng)[18]。以上研究提示BDNF表達(dá)增加與應(yīng)激適應(yīng)行為有關(guān)，且大鼠海馬和前額葉區(qū)ERK信號通路激活導(dǎo)致的不同慢性應(yīng)激行為可能與調(diào)控神經(jīng)再生或神經(jīng)可塑性相關(guān)。

既往研究結(jié)果顯示，持續(xù)給予氟西汀可使大鼠腦組織P-ERK水平升高[19]，ERK信號通路阻斷劑可抑制抗抑郁藥物及BDNF的抗抑郁效果[20-22]，提示ERK信號通路激活參與抗抑郁藥物的起效機制。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)激敏感組大鼠跨格次數(shù)少于藥物組，提示鹽酸氟西汀可在一定程度上降低慢性應(yīng)激刺激對大鼠自主活動水平的影響，筆者據(jù)此推測應(yīng)激適應(yīng)可能與抗抑郁藥物起效過程具有相似的分子信號機制，但仍有待于進(jìn)一步研究證實。

綜上所述，慢性應(yīng)激刺激可導(dǎo)致大鼠自主活動水平下降，鹽酸氟西汀可在一定程度上降低慢性應(yīng)激刺激對大鼠自主活動水平的影響，海馬和額葉區(qū)ERK信號通路激活可能與大鼠應(yīng)激適應(yīng)有關(guān)。

作者貢獻(xiàn)：王凌霄、王培福、彭代輝進(jìn)行實驗設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文；彭代輝、方貽儒指導(dǎo)論文修改并對文章負(fù)責(zé)；才麗娜、黃佳、張晨協(xié)助進(jìn)行試驗實施、評估、資料收集。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：謝武英)

Relationship between Chronic Stress Behaviors and ERK Signal Pathway Activation of Hippocampus and Prefrontal Cortex in Rats

WANGLing-xiao1，WANGPei-fu1，CAILi-na1，HUANGJia2，ZHANGChen2，PENGDai-hui2，F(xiàn)ANGYi-ru2

1.AerospaceCentralHospital，Beijing100092，China2.MentalHealthCenterofShanghai，Shanghai200030，ChinaCorrespondingauthor：FANGYi-ru，E-mail：yirufang@aliyun.comPENGDai-hui，E-mail：pdhsh@126.com

Objective To explore the relationship between chronic stress behaviors and ERK signal pathway activation of hippocampus and prefrontal cortex in rats.Methods From June 2011 to August 2012,A total of clear 50 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into A group(n=12)，B group(n=12)and C group(n=26)，thereinto rats of A group did not

any stress stimulation，rats of B group and C group received stress stimulation for 8 weeks，meanwhile rats of B group received subcutaneous injection of fluoxetine hydrochloride at the first week of stress stimulation.Sucrose preference test and open-field test were carried out before modeling and after 1 day of modeling，Western bloting method was used to detect the protein expressions of ERK and P-ERK of hippocampus and prefrontal cortex after stress stimulation.Results A total of 11 rats died during the stress stimulation，including 2 rats in A group，4 rats in B group and 5 rats in C group.Rats of C group were divided into C1 group(with stress adaptation，n=6)and C2 group(with stress sensitive，n=15) according to sucrose preference test.No statistically significant differences of striding grid times，upright times or central square stays was found among the four groups(P>0.05)；after 1 day of modeling，striding grid times，upright times of B group，C1 group and C2 group were statistically significantly less than those of A group，central square stays of B group，C1 group and C2 group was statistically significantly longer than that of control group，meanwhile striding grid times of C2 group was statistically significantly less than that of B group(P<0.05).No statistically significant differences of relative quantity expression of ERK protein of hippocampus or prefrontal cortex was found among the four groups after stress stimulation(P>0.05).After stress stimulation，relative quantity expression of P-ERK protein of hippocampus and prefrontal cortex of C2 group was statistically significantly lower than that of B group and C1 group(P<0.05)，while no statistically significant differences of relative quantity expression of P-ERK protein of hippocampus or prefrontal cortex was found between B group and C1 group(P>0.05).Conclusion Chronic stress stimulation can reduce the autonomous activity level of rats，fluoxetine hydrochloride can reduce the impact of chronic stress stimulation on autonomous activity level of rats to some extent，and ERK signal pathway activation of hippocampus and prefrontal cortex may correlated with stress adaptation in rats.

Stress，psychological；Extracellular signal-regulated kinases；Hippocampus；Prefrontal cortex；Rat

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃“863”計劃項目(2006AA02Z430)；國家自然科學(xué)基金重大計劃項目(91232719)；國家臨床重點專科-上海市精神衛(wèi)生中心(衛(wèi)生部醫(yī)政司2011-873)；上海市自然科學(xué)基金資助項目(09ZR1427200)；上海市衛(wèi)生局公共衛(wèi)生海外人才項目(GWHW201208)；上海交通大學(xué)科學(xué)基金項目(11XJ21006)

方貽儒，E-mail：yirufang@aliyun.com 彭代輝，E-mail：pdhsh@126.com

R 395

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2017.07.013

2017-04-15；

2017-07-11)

1.100092北京市，航天中心醫(yī)院

2.200030上海市精神衛(wèi)生中心