萃取吸附法分離萃取發(fā)酵液中紅曲黃色素

唐 銳,譚海玲,石 侃,2,田霄飛,吳振強(qiáng),*

(1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510006; 2. 東莞市天益生物工程有限公司,廣東東莞 523521)

唐 銳1,譚海玲1,石 侃1,2,田霄飛1,吳振強(qiáng)1,*

(1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510006; 2. 東莞市天益生物工程有限公司,廣東東莞 523521)

萃取發(fā)酵是紅曲色素發(fā)酵生產(chǎn)的一種新技術(shù),可促進(jìn)胞內(nèi)色素分泌到胞外,但存在發(fā)酵液中紅曲色素與萃取劑(表面活性劑Triton X-100)難以分離純化的問題。本研究采用三氯甲烷萃取結(jié)合堿性S-8樹脂吸附的方法,分離了發(fā)酵液中黃色素和表面活性劑。通過該方法色素的回收率達(dá)到64.5%,表面活性劑的去除率為97.47%。在有機(jī)溶劑中,樹脂對(duì)黃色素吸附的過程符合Freundlich熱力學(xué)吸附平衡模型和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。吸附的黃色素用含0.5%(w/v)鹽酸的甲醇溶液被有效洗脫,總洗脫率達(dá)到79.48%。該方法為萃取發(fā)酵液中紅曲黃色素的有效分離純化提供了新途徑。

紅曲黃色素,大孔樹脂,萃取分離,吸附分離,動(dòng)力學(xué)

紅曲色素在東亞及東南亞國(guó)家被廣泛用作食品色素,其應(yīng)用具有悠久的歷史[1-2]。紅曲色素種類很多,主要包括紅曲黃色素、紅曲橙色素及紅曲紅色素[3-4]。紅曲黃色素是含有醌酮結(jié)構(gòu)的天然化合物,具有良好的酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和耐光性。它能夠減少糖尿病和肥胖病發(fā)病率,因而具有較好的應(yīng)用前景[5]。紅曲色素滲透萃取發(fā)酵是一種新型的發(fā)酵技術(shù),通過添加Triton X-100表面活性劑將胞內(nèi)紅曲色素萃取至胞外,進(jìn)而極大地提高了紅曲色素的產(chǎn)量[5-6]。

在萃取發(fā)酵中,疏水的胞內(nèi)色素被Triton X-100萃取至發(fā)酵液中,存在于表面活性劑水包油的膠束中。由于膠束結(jié)構(gòu),表面活性劑與紅曲色素具有很強(qiáng)的親和性。從Triton X-100膠束溶液中提取紅曲色素是下游色素分離純化的一個(gè)主要難題[7]。目前,用于紅曲色素和Triton X-100直接分離的方法是使用乙醚進(jìn)行微乳液萃取[7]。Shen[8]等也用憎水性的離子液體[Bmim]PF6分離了表面活性劑和紅曲色素,其中紅曲黃色素有較好的回收率,但表面活性劑濃度未知,且離子液體的成本較高,不適合大規(guī)模使用。近些年來,大孔樹脂被廣泛地應(yīng)用于分離天然活性物質(zhì)[9-10],具有吸附容量大、成本低廉、對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物選擇性好、操作程序簡(jiǎn)單以及安全環(huán)保等特點(diǎn)[11-12]。大孔樹脂中常見的吸附選擇作用力多樣,主要有范德華力、氫鍵作用力、疏水性作用和靜電作用[13-14]。在萃取發(fā)酵液中,使用大孔樹脂吸附的方法選擇性地分離紅曲色素和表面活性劑,具有重要的應(yīng)用潛力,目前還未見報(bào)道。本研究提出了有機(jī)溶劑微乳液萃取和大孔樹脂吸附聯(lián)合的方法,實(shí)現(xiàn)對(duì)紅曲黃色素和表面活性劑的有效分離。在有機(jī)相中,通過比較色素-表面活性劑的吸附選擇性,對(duì)一系列的酸堿改性的大孔樹脂進(jìn)行了比較。同時(shí),研究了黃色素在堿處理的大孔樹脂S-8上的吸附動(dòng)力學(xué),并對(duì)酸化甲醇洗脫劑的性能進(jìn)行了初步的篩選。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

色素發(fā)酵用菌株紅曲霉菌(Monascusanka GIM 3.592)保藏于廣東省微生物菌種保藏中心;S-8(強(qiáng)極性,粒徑范圍0.3～1.25 mm)、AB-8(弱極性,粒徑范圍0.3～1.2 mm)和X-5(非極性,粒徑范圍0.315～1.25 mm)樹脂 東鴻化工有限公司;ADS-17(中極性,粒徑范圍0.315～1.25 mm)樹脂 杭州凱英公司。葡萄糖、酵母浸粉、KCl等 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。甲醇、乙醇、乙酸乙酯等(分析純) 天津市大茂化學(xué)試劑廠。液相甲醇為色譜純。

西林瓶 廣州睿致遠(yuǎn)玻璃包裝材料廠;ZWYR-D2402型搖床 上海智城分析儀器制造有限公司;UV-2802S型紫外可見光光度計(jì) 上海尤尼科儀器有限公司;高效液相色譜儀 Waters(USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅曲色素發(fā)酵液的制備 種子培養(yǎng)基成分包含(g/L):葡萄糖 20,酵母浸粉3,魚粉蛋白胨10,KCl 0.5,KH2PO44,FeSO4·7H2O 0.01,pH自然。發(fā)酵培養(yǎng)基成分包含(g/L):Triton X-100 40,葡萄糖 50,(NH4)2SO45,KH2PO45,MgSO4·7H2O 0. 5,KCl 0. 5,ZnSO4·7H2O 0.01,MnSO4·H2O 0.03,FeSO4·7H2O 0.01,pH自然。

紅曲霉菌在PDA平板上30 ℃培養(yǎng)7 d。用含有0.1%(w/w)的吐溫80無菌水沖洗PDA平板,制成孢子懸液。稀釋后的孢子懸液(106/mL)3 mL接種于50 mL滅菌的種子培養(yǎng)基中,在30 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)28 h。按8%接種量(v/v)將種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)液中,30 ℃、180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)7 d。收集發(fā)酵液,8000 r/min離心10 min移除菌絲體,得到紅曲色素發(fā)酵液[15]。

1.2.2 紅曲色素發(fā)酵液中的色素分離

1.2.2.1 有機(jī)溶劑的篩選 選用不同log P值(辛醇水分配系數(shù))的有機(jī)溶劑(乙酸乙酯(0.68)、異丁醇(0.8)、乙醚(0.85)、二氯甲烷(1.01)、三氯甲烷(2)、石油醚(3.1)、環(huán)己烷(3.2)、正己烷(3.5)和正庚烷(4))和等體積的發(fā)酵液混勻后密封在25 mL的西林瓶中,置于10 ℃搖床中,80 r/min振蕩下過夜,進(jìn)行兩相萃取[7]。萃取結(jié)束后,萃取液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中,8000 r/min離心10 min,記錄體積比(v/v)。分別取出兩相,稀釋后檢測(cè)表面活性劑的含量和色素含量,計(jì)算有機(jī)溶劑對(duì)其萃取率。有機(jī)溶劑對(duì)色素和表面活性劑的萃取率分別由公式(1)和(2)計(jì)算:

色素萃取率(%)=(A1×V1)/(A×V)×100

式(1)

式(1)中,A為發(fā)酵液中色素濃度(AU/mL);A1為萃取后有機(jī)相中色素濃度(AU/mL);V為發(fā)酵液體積(mL);V1為萃取后有機(jī)相體積(mL)。

表面活性劑萃取率(%)=(C1×V1)/(C×V)×100

式(2)

式(2)中,C為發(fā)酵液中表面活性劑濃度(mg/mL);C1為萃取后有機(jī)相中表面活性劑濃度(mg/mL);V為發(fā)酵液體積(mL);V1為萃取后有機(jī)相體積(mL)。

1.2.2.2 分析方法 Triton X-100的測(cè)量:樣品用甲醇稀釋適當(dāng)倍數(shù)后,使用高效液相色譜測(cè)量表面活性劑的含量,所用色譜柱為C18(5 μm,250×4.6 mm),檢測(cè)器為Waters 2998紫外檢測(cè)器,流動(dòng)相為甲醇,流速是1 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm[16]。紅曲黃色素的測(cè)量:樣品使用乙醇(70%,v/v,pH=2)稀釋合適的倍數(shù),用分光光度計(jì)UV-2802S測(cè)定410 nm的吸光度(AU/mL)來表示黃色素含量[17]。

1.2.3 大孔樹脂的預(yù)處理 大孔樹脂使用95%(v/v)的乙醇浸泡24 h活化,再用4%(w/v)HCl或4%(w/v)NaOH浸泡4 h,用超純水將樹脂洗至中性,再用無水乙醇置換脫水干燥,分別得到酸處理后及堿處理后的大孔樹脂,保存在干燥皿中備用。

1.2.4 靜態(tài)吸附 樹脂篩選:精確稱取250 mg(干重)經(jīng)酸或堿處理的大孔樹脂于10 mL西林瓶中,加入5 mL三氯甲烷萃取液,30 ℃、200 r/min條件下吸附180 min。取樣分別檢測(cè)萃取液中殘留的表面活性劑和色素濃度。紅曲黃色素和表面活性劑吸附率分別由式(3)和式(4)計(jì)算:

色素吸附率(%)=(A0-A1)/A0×100

式(3)

式(3)中,A0為樹脂吸附前三氯甲烷萃取液中色素濃度(AU/mL);A1為樹脂吸附后三氯甲烷萃取液中色素濃度(AU/mL)。

表面活性劑吸附率(%)=(C0-C1)/C0×100

式(4)

式(4)中,C0為樹脂吸附前三氯甲烷萃取液中表面活性劑濃度(mg/mL);C1為吸附后三氯甲烷萃取液中表面活性劑濃度(mg/mL)。

1.2.5 等溫吸附 等溫吸附實(shí)驗(yàn):精確稱取250 mg堿處理過的S-8樹脂于10 mL西林瓶中,加入5 mL三氯甲烷萃取液,在相應(yīng)的溫度(20、25、30 ℃)下進(jìn)行振蕩(200 r/min)吸附,待樹脂達(dá)到吸附平衡,取樣測(cè)定殘留的色素濃度,計(jì)算吸附量。依照Langmuir(式5)和Freundlich(式6)吸附模型探討黃色素等溫吸附規(guī)律[12]。

ce/qe=ce/qm+1/(qm×KL)

式(5)

其中,KL是Langmuir常數(shù),Qm是平衡吸附狀態(tài)下樹脂對(duì)色素的最大吸附量(AU/g)。

lnqe=1/n×lnce+lnKf

式(6)

式(5)和式(6)中,Kf和n是Freundlich常數(shù),Qe是吸附達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)樹脂對(duì)色素的最大吸附量(AU/g),Ce吸附達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)色素的濃度(AU)。

1.2.6 樹脂的吸附動(dòng)力學(xué)模型構(gòu)建 稱取250 mg堿處理的S-8樹脂于10 mL西林瓶中,加入5 mL三氯甲烷萃取液,在30 ℃、200 r/min條件下吸附360 min。分別在第30、60、90、120、180、240、300、360 min取樣,測(cè)定溶液中色素含量。構(gòu)建吸附動(dòng)力學(xué)模型。

使用Origin 9.0分別擬合準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型(式7),準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型(式8)以及Weber-Morris粒內(nèi)擴(kuò)散模型(式9)曲線[18]。

ln(qe-qt)=lnqe-k1×t

式(7)

式(8)

q=ki×t1/2+I式(9)

式(7)、式(8)、式(9)中,t是吸附時(shí)間(min);qt,qe分別是樹脂在t時(shí)間對(duì)色素的吸附量和吸附平衡狀態(tài)時(shí)對(duì)色素的吸附量(AU/g 干樹脂);k1、k2、ki分別是準(zhǔn)一級(jí)、準(zhǔn)二級(jí)以及Weber-Morris動(dòng)力學(xué)模型的速率常數(shù);I是Weber-Morris粒內(nèi)擴(kuò)散模型的常數(shù)。

1.2.7 樹脂解吸 本研究中選用了以甲醇和乙醇為主要成分的12種洗脫劑對(duì)吸附的色素進(jìn)行洗脫。包括:純甲醇,0.5%(v/v)醋酸甲醇溶液,1%(v/v)醋酸甲醇溶液、純乙醇、0.5%(v/v)醋酸乙醇溶液、1%(v/v)醋酸乙醇溶液、0.5%(w/v)HCl甲醇溶液、1%(w/v)HCl甲醇溶液、5%(w/v)HCl甲醇溶液、0.5%(w/v)NaOH甲醇溶液、1%(w/v)NaOH甲醇溶液、5%(w/v)NaOH甲醇溶液。洗脫條件為:吸附有色素的樹脂0.25 g,洗脫溶劑5 mL,在30 ℃、180 r/min條件下振蕩下洗脫60 min,共洗脫5次。色素的解吸率P使用公式(10)計(jì)算:

解吸率(%)=(A2×V2)/(A0×V0-A1×V1)×100

式(10)

式(10)中,A0和A1分別是樹脂吸附前和吸附后溶液中色素濃度(AU/mL);V0和V1分別是樹脂吸附前和吸附后溶液的體積(mL);A2是解吸液色素濃度(AU/mL);V2是解吸液體積(mL)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

差異顯著性分析使用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)的方法(IBM SPSS Statistics 22,NY,USA)。數(shù)據(jù)作圖使用Origin 9.0(Originlab corporation,Inc. MA,USA)。

2 結(jié)果與討論

2.1 有機(jī)溶劑萃取分離紅曲黃色素

圖1顯示了有機(jī)相中表面活性劑和色素的萃取率。10 ℃下,表面活性劑在不同log P值的有機(jī)溶劑中的分配比不同。在log P<2的乙酸乙酯、異丁醇、二氯甲烷、三氯甲烷中,表面活性劑萃取率分別是76.1%、84.98%、87.22%和91.87%,這四種有機(jī)溶劑對(duì)表面活性劑的萃取率沒有顯著性差異(p>0.05);同時(shí)黃色素的萃取率分別是82.70%、77.72%、87.13%和86.38%,這四種有機(jī)溶劑對(duì)黃色素的萃取率也沒有顯著性差異(p>0.05)。這些數(shù)據(jù)表明,乙酸乙酯、異丁醇、二氯甲烷、三氯甲烷對(duì)表面活性劑和黃色素都具有良好的萃取能力,但是萃取的兩者含量相近,無法將兩者分離開來,選擇性較差。在log P>2的強(qiáng)非極性的有機(jī)溶劑中,例如:石油醚、環(huán)己烷、正己烷和正庚烷,表面活性劑的萃取率也沒有顯著性差異,均小于5%。盡管它們對(duì)黃色素萃取率較表面活性劑高,但仍然小于20%,分離效果也不明顯。由于表面活性劑和黃色素都更傾向于保留在同一相中,直接通過微乳液萃取實(shí)現(xiàn)黃色素和表面活性劑的分離效率較低。在選用的所有有機(jī)溶劑中,乙醚對(duì)表面活性劑和黃色素的萃取率分別是23.43%和53.43%。較之其他的有機(jī)溶劑,乙醚-水微乳液萃取法可以將表面活性劑同黃色素較好地分離開來,這與Shen[7]等人報(bào)道的結(jié)果一致。

圖1 不同log P值的有機(jī)溶劑對(duì)黃色素和表面活性劑Triton X-100的萃取率 Fig.1 Extraction yields of yellow pigments and Triton X-100 using organic solvents with different log P Significant differences among the extraction yields with distinct letters(p<0.05)注:標(biāo)注的不同字母代表不同的有機(jī)溶劑萃取率具有顯著性差異(p<0.05)。

使用大孔樹脂直接對(duì)紅曲色素發(fā)酵液中色素進(jìn)行選擇性吸附時(shí),表面活性劑與疏水的黃色素形成的膠束結(jié)構(gòu)干擾了大孔樹脂表面官能團(tuán)對(duì)色素分子的作用。同時(shí),膠束中表面活性劑與色素的緊密結(jié)合,無法實(shí)現(xiàn)色素的選擇性吸附。雖然有機(jī)溶劑無法直接用于黃色素與表面活性劑的有效分離,但是使用log P<2的有機(jī)溶劑微乳液萃取,能夠破壞發(fā)酵液中表面活性劑與色素形成的膠束結(jié)構(gòu),導(dǎo)致色素從膠束中釋放和游離[19]。因此,本研究采用了萃取和吸附相結(jié)合的方法,先使用有機(jī)溶劑對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行萃取,黃色素和表面活性劑的膠束結(jié)構(gòu)被萃取到有機(jī)相中并被破壞,再使用大孔樹脂選擇性吸附有機(jī)相中游離的色素,實(shí)現(xiàn)色素與表面活性劑的分離。

根據(jù)有機(jī)溶劑篩選的結(jié)果,三氯甲烷的色素萃取效率最高,且它是工業(yè)上應(yīng)用最廣泛的有機(jī)溶劑之一。本研究選用三氯甲烷作為色素萃取的理想溶劑,用于下一步的研究。

2.2 大孔樹脂對(duì)紅曲黃色素吸附的選擇性

圖2 三氯甲烷萃取液中樹脂對(duì)黃色素及表面活性劑Triton X-100的吸附率Fig.2 Adsorption yield of yellow pigments(A)and Triton X-100(B)on different resins after chloroform extraction注:A：黃色素;B：Triton X-100；標(biāo)注的不同字母代表吸附率具有顯著性差異(p<0.05)。

樹脂對(duì)三氯甲烷萃取液中黃色素和表面活性劑的吸附效率如圖2所示,不同的樹脂樣品展現(xiàn)了不同的選擇性吸附色素的性能。本研究結(jié)果表明,所有的樹脂對(duì)表面活性劑的吸附率都較小,沒有顯著性差距(p>0.05),所以對(duì)黃色素吸附效果最好的樹脂分離黃色素和表面活性劑的效果最好。經(jīng)過堿處理的極性大孔樹脂S-8對(duì)色素的吸附率最高,達(dá)到了81.17%,酸處理的S-8樹脂和堿處理的中極性大孔樹脂ADS-17對(duì)色素的吸附率無顯著性差異,分別為31.11%、35.06%。其余樹脂對(duì)黃色素的吸附率沒有顯著性差異,酸堿處理的弱極性AB-8樹脂對(duì)表面活性劑和色素吸附容量都較小,且對(duì)色素選擇性吸附效果不明顯。非極性X-5樹脂展現(xiàn)了一定的色素選擇吸附的能力,但是色素的吸附容量小。在所有的樹脂中,效果最好的是堿處理的極性大孔樹脂S-8,對(duì)表面活性劑和色素的吸附率分別是2.53%和81.17%。

鑒于堿處理的極性大孔樹脂S-8對(duì)色素有良好的選擇性且色素吸附容量大。本研究對(duì)堿性S-8樹脂對(duì)色素的吸附行為進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。

2.3 堿性S-8樹脂對(duì)紅曲黃色素的等溫吸附特性

從兩模型計(jì)算的結(jié)果來看,Freundlich等溫線模型比Langmuir等溫線模型具有更大的R2。這說明Freundlich等溫線模型可以相對(duì)較好地描述S-8堿性樹脂對(duì)色素的吸附的規(guī)律(表1)。Langmuir等溫線模型描述的吸附行為是均勻的表面單分子層吸附,且被吸附的分子之間無相互作用力[20]。據(jù)此可以推算,S-8樹脂對(duì)紅曲黃色素的吸附行為可能不是單分子吸附。在Freundlich吸附模型中,Freundlich常數(shù)n反映了吸附劑的不均勻性或吸附反應(yīng)強(qiáng)度[21],當(dāng)它的倒數(shù)1/n=0.1～1時(shí),吸附能夠進(jìn)行;當(dāng)1/n>1時(shí),表明吸附過程難以進(jìn)行[18]。由于在三個(gè)溫度下Freundlich常數(shù)n值均大于1,說明色素很容易被堿性S-8樹脂吸附,過程容易進(jìn)行。

圖3 堿性S-8樹脂對(duì)黃色素平衡吸附的模型回歸(A)Langmuir和(B)Freundlich模型Fig. 3 Modeling of the equilibrium adsorption data with(A)Langmuir and(B)Freundlich models注：初始色素濃度為12.6～48.7 AU/mL。

表2 S-8堿性樹脂對(duì)色素吸附的熱力學(xué)常數(shù)Table 2 Thermodynamic parameters of the pigment adsorption with alkali S-8 resin

圖4 堿性S-8樹脂對(duì)紅曲黃色素的吸附動(dòng)力學(xué)模型回歸分析Fig.4 Regression of the kinetic models for the pigments adsorption with alkali S-8 resin注：A. 吸附動(dòng)力學(xué)曲線;B. 準(zhǔn)一級(jí)模型回歸;C. 準(zhǔn)二級(jí)模型回歸;D. Weber and Morris粒內(nèi)擴(kuò)散模型回歸(吸附溫度為30 ℃)。

表2列出了堿性S-8樹脂的吸附等溫線的熱力學(xué)參數(shù)。通過計(jì)算,ΔH是正值,說明吸附反應(yīng)是吸熱反應(yīng),升高溫度能增大樹脂的吸附能力。同時(shí),ΔH的絕對(duì)值小于40 kJ/mol,表明堿性S-8對(duì)黃色素的吸附過程僅是物理吸附。吉布斯自由能(ΔG)的變化是指在特定溫度下樹脂吸附單元吸附物所需的能量。所測(cè)溫度下的吉布斯自由能(ΔG)都是負(fù)數(shù),說明堿性S-8樹脂對(duì)黃色素的吸附是自發(fā)進(jìn)行的。同時(shí)ΔG的絕對(duì)值小于20 kJ/mol,支持了該吸附過程是物理吸附過程的推斷。ΔS是正值,說明吸附反應(yīng)是一個(gè)熵增反應(yīng)[22]。

2.4 堿性S-8樹脂對(duì)紅曲黃色素的吸附動(dòng)力學(xué)模型

堿性S-8大孔樹脂對(duì)黃色素的吸附迅速,靜態(tài)吸附30 min左右能吸附64%的黃色素,經(jīng)過3 h后基本達(dá)到吸附平衡(圖4A),隨著時(shí)間的繼續(xù)增加,吸附率沒有明顯增大。堿性S-8對(duì)紅曲黃色素的吸附是一個(gè)快速吸附平衡過程,快速吸附就是在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到吸附平衡,在工業(yè)上應(yīng)用能夠節(jié)省成本。為了進(jìn)一步分析吸附過程中紅曲黃色素的擴(kuò)散機(jī)制,對(duì)樹脂吸附黃色素的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)一級(jí)、準(zhǔn)二級(jí)和Weber-Morris模型的擬合(圖4B、圖4C、圖4D),結(jié)果如圖所示。準(zhǔn)一級(jí)、準(zhǔn)二級(jí)模型的k值和qe值分別是擬合直線的斜率和截?fù)?jù)。30 ℃時(shí),準(zhǔn)一級(jí)和準(zhǔn)二級(jí)模型的相關(guān)系數(shù)分別是0.9320和0.9997。準(zhǔn)二級(jí)模型更適用于描述黃色素在堿性S-8大孔樹脂上的吸附動(dòng)力學(xué)行為。

有機(jī)物質(zhì)在多孔吸附劑上的吸附行為由三個(gè)連續(xù)的過程組成[23]。第一,從邊界膜通過膜擴(kuò)散或外部擴(kuò)散傳質(zhì)到樹脂表面(液膜擴(kuò)散);第二,吸附物擴(kuò)散(顆粒擴(kuò)散);第三,分子在樹脂的內(nèi)表面的活性位點(diǎn)吸附(化學(xué)反應(yīng))。一般情況下,樹脂對(duì)色素的吸附率會(huì)受到第一步和(或)第二步限制[24]。由圖4D可以看出,函數(shù)分成了兩個(gè)階段,且都沒有通過原點(diǎn),這表明顆粒擴(kuò)散不是色素吸附過程中唯一的限速步驟,其他步驟如液膜擴(kuò)散也可能涉及。張新林[25]等研究D750對(duì)甘蔗糖蜜的脫色吸附動(dòng)力學(xué)過程符合顆粒擴(kuò)散過程,但同時(shí)也受到化學(xué)反應(yīng)和液膜擴(kuò)散的共同作用。

表3 不同溶液對(duì)色素的洗脫效率Table 3 Effect of different solutions on the pigment elution efficiency

注：相同洗脫次數(shù)下不同字母表示洗脫率具有顯著性差異(p<0.05)。吳振強(qiáng)[26]等研究DA201-C對(duì)水溶性紅曲黃色素的吸附動(dòng)力學(xué)過程不僅受到液膜擴(kuò)散影響,同時(shí)也受到化學(xué)反應(yīng)及顆粒擴(kuò)散影響,與本文研究結(jié)論相似。

2.5 紅曲黃色素的洗脫和純化

陳智勇等[27]用大孔吸附樹脂S-8富集紫膠色酸后選用95%的乙醇洗脫,解吸率大于95%。Wang等[28]用乙醇的水溶液解吸大孔樹脂從糖蜜酒精廢水中吸附的色素,解吸率能達(dá)到98%。Liu等[29]則使用不同濃度的乙酸乙酯-乙醇溶液來洗脫番茄紅素,解吸率可達(dá)到66.9%?？紤]到成本和溶劑的回收,選用表3中的試劑進(jìn)行洗脫。當(dāng)直接使用甲醇和乙醇溶液作為洗脫溶劑時(shí),色素洗脫效果均不理想,洗脫效率僅有7.64%和5.83%。添加少量的有機(jī)酸-醋酸,能提高單次黃色素的洗脫率,但效果并不顯著(p>0.05)。當(dāng)使用無機(jī)強(qiáng)酸的甲醇溶液時(shí),黃色素被很好地洗脫,樹脂顏色基本恢復(fù)。黃色素的五次總洗脫率隨著無機(jī)酸的濃度(0.5%、1.0%和5.0%,w/v)增加分別為79.48%、76.18%和71.78%,因此可以選擇0.5%的鹽酸甲醇溶液進(jìn)行洗脫,洗脫后的黃色素溶液,通過結(jié)晶或者制備液相色譜等方法進(jìn)行精制。此外,甲醇洗脫液中添加無機(jī)堿也可以提高對(duì)黃色素的總洗脫率,添加0.5%、1.0%、5.0%的無機(jī)堿對(duì)黃色素的總洗脫率分別提高了5.14%、15.21%和 36.07%,但是相比較無機(jī)酸,效率仍然有待提高。在應(yīng)用中,色素在堿性條件下的穩(wěn)定性較差也不利于堿性洗脫液的使用。

3 結(jié)論

微乳液萃取和大孔樹脂吸附的方法可以實(shí)現(xiàn)從紅曲色素發(fā)酵液中選擇分離黃色素成分。三氯甲烷萃取紅曲色素發(fā)酵液時(shí),黃色素和表面活性劑都有較高的萃取率(分別是86.38%和91.87%)。然而,有機(jī)溶劑萃取可以破壞發(fā)酵液中表面活性劑形成的膠束結(jié)構(gòu),膠束中色素得到釋放并游離于有機(jī)溶劑中。通過下一步樹脂選擇性吸附,可以實(shí)現(xiàn)表面活性劑與色素的高效分離。堿性S-8大孔樹脂對(duì)黃色素的吸附率可達(dá)81.17%,而對(duì)表面活性劑的吸附率僅為2.53%。樹脂對(duì)色素的吸附是自發(fā)進(jìn)行的物理過程,符合Freundlich模型和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。根據(jù)Weber and Morris粒內(nèi)擴(kuò)散模型,色素的吸附過程受膜擴(kuò)散和顆粒內(nèi)擴(kuò)散等步驟限速。吸附的黃色素可以被含0.5%(w/v)鹽酸的甲醇溶液有效洗脫。洗脫5次后總洗脫率可達(dá)79.48%。

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Extraction and adsorption ofMonascusyellow pigments from extractive fermentation broth

TANG Rui1,TAN Hai-ling1,SHI Kan1,2,TIAN Xiao-fei1,WU Zhen-qiang1,*

(1.School of bioscience and bioengineering South China University of Technology,Guangzhou 510006 China; 2.Tianyi Biotech. Co.,Ltd,Dongguan 523521 China)

Extractive fermentation was an advanced technology for a high-yield productivity ofMonascuspigments. Intracellular pigments could be extracted to the extracellular broth with surfactant Triton X-100. However,the solid bonding between pigments and Triton X-100 micelles challenged a subsequent separation and purification of the pigments from fermentation broth. This study demonstrated a selective isolation ofMonascusyellow pigments from the extractive fermentation broth through a dual-phase chloroform extraction and subsequent adsorption using S-8 alkali resin. Recovery of the pigments and efficiency of Triton X-100 removal reached 64.5% and 97.47%,respectively. The pigment adsorption could be described by Freundlich equilibrium model with a pseudo-second order kinetic course. The use of methanol solution containing 0.5%(w/v)HCl led to the highest elution efficiency with a total pigment recovery yield of 79.48%. The method was demonstrated to be a new approach for pigment isolation in extractive fermentation.

Monascusyellow pigments;marcoporous resin;extraction;adsorption;kinetics

2017-01-19

唐銳(1992-),女,碩士研究生,研究方向:發(fā)酵工程,E-mail:513156749@qq.com。

*通訊作者:吳振強(qiáng)(1963-),男,博士,教授,研究方向:發(fā)酵工程、生物工程、生物化工、生態(tài)環(huán)境,大健康產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域理論與應(yīng)用研究,E-mail:btzhqwu@scut.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31271925);廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(2013B090600015);廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014J4100192)。

TS264.4

A

1002-0306(2017)13-0169-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.032