色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)改造對(duì)大腸桿菌產(chǎn)L色氨酸的影響

李 晶,石斌超,王晨陽,趙志軍,史吉平,*

(1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200444; 2.中國科學(xué)院上海高等研究院,上海 201210)

李 晶1,2,石斌超2,王晨陽2,趙志軍2,史吉平2,*

(1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200444; 2.中國科學(xué)院上海高等研究院,上海 201210)

近年來,轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)改造已經(jīng)成為氨基酸菌株菌種改良的重要手段。本研究以工業(yè)生產(chǎn)菌EscherichiacoliMT-01/pTrp-01為出發(fā)菌株,首先利用Red重組技術(shù),在菌株MT-01/pTrp-01基因組上敲除了色氨酸吸收基因mtr,發(fā)酵結(jié)果表明,敲除敲除突變菌的L-色氨酸產(chǎn)量達(dá)到35.87 g/L,與出發(fā)菌株E.coliMT-01/pTrp-01 相比提高了32%;在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步考察了三種不同啟動(dòng)子(Pr,Ptac,PserA)控制下L-色氨酸分泌基因yddG的差異表達(dá)對(duì)菌體生長及菌株產(chǎn)L-色氨酸的影響。結(jié)果表明,當(dāng)采用組成型啟動(dòng)子tac時(shí),yddG基因的過表達(dá)菌株L-色氨酸的產(chǎn)量為41.01 g/L,比mtr敲除菌株E.coliMT-11/pTrp-01的產(chǎn)量提高了14.3%,當(dāng)采用溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pr調(diào)控yddG基因表達(dá)時(shí),L-色氨酸的產(chǎn)量與mtr敲除菌株E.coliMT-11/pTrp-01的產(chǎn)量相比提高了9.3%,L-色氨酸的產(chǎn)量達(dá)到了39.22 g/L;而采用基因serA的天然啟動(dòng)子調(diào)控yddG表達(dá)時(shí),菌體的生長受到了明顯抑制,L-色氨酸產(chǎn)量僅有27.1 g/L的色氨酸。綜上,大腸桿菌基因mtr的敲除和基因yddG的過表達(dá)均可以有效提高工程菌株生產(chǎn)色氨酸的能力。

大腸桿菌,L-色氨酸,轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),基因敲除,克隆表達(dá)

L-色氨酸(L-tryptophan,L-Trp)作為人體必需的氨基酸之一,已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和飼料等行業(yè)[1]。目前,微生物發(fā)酵法是工業(yè)生產(chǎn)L-色氨酸的主要方法;而易于培養(yǎng)、遺傳、操作簡單的大腸桿菌成為了L-色氨酸的主要生產(chǎn)菌株[2]。

L-色氨酸生產(chǎn)菌株主要是通過誘變篩選或者基因重組的方式增加L-色氨酸的代謝通量所獲得,例如:解除關(guān)鍵酶蛋白AroG和TrpE的反饋抑制作用,過量表達(dá)關(guān)鍵基因aroG、trpE和trpBA等,阻斷L-苯丙氨酸和L-酪氨酸等旁支途徑。值得注意的是,轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)改造同樣是提高L-色氨酸產(chǎn)量的重要措施[3-7]。

轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)改造是指通過提高胞內(nèi)氨基酸的分泌速率或者降低胞外氨基酸的吸收速率,從而加速氨基酸積累的一種重要方法。近年來,氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)工程已經(jīng)成功應(yīng)用于色氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和半胱氨酸等氨基酸育種研究中。例如:2007年,Lee KH等在菌株TH27C(pBRThrABC)中敲除了蘇氨酸的吸收基因tdcC,研究結(jié)果表明蘇氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量提高了15.6%,在此基礎(chǔ)上過量表達(dá)蘇氨酸分泌基因rhtC,蘇氨酸產(chǎn)量進(jìn)一步提高至11.1 g/L,提高了50.2%。Park JH等2007年則通過過量表達(dá)纈氨酸分泌基因ygaZH,使纈氨酸產(chǎn)量提高了47.1%,達(dá)到5.25 g/L。梁媛等在2014年對(duì)大腸桿菌蘇氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SstT和RhtC進(jìn)行了研究,構(gòu)建了菌株基因sstT敲除菌株并在其基礎(chǔ)上過表達(dá)了基因rhtC,發(fā)酵結(jié)果基因sstT敲除菌的L-蘇氨酸產(chǎn)量與原菌相比提高了4%,基因rhtC過表達(dá)菌株的L-蘇氨酸產(chǎn)量提高了18.16%。2016年,崔云風(fēng)等分別敲除了大腸桿菌中L-絲氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)吸收系統(tǒng)的四個(gè)基因(sdaC,cycA,sstT 和tdcC),發(fā)酵結(jié)果表明,sdaC 敲除菌與cycA 敲除菌L-絲氨酸的產(chǎn)量都得到了提高,分別達(dá)到16.3 g/L與14.1 g/L,與出發(fā)菌株相比分別提高了43%與25%[8-11]。

大腸桿菌色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)分為吸收系統(tǒng)和分泌系統(tǒng),其中L-Trp的吸收主要是由mtr,tnaB和arop三個(gè)基因編碼的通透酶所調(diào)控;Mtr和TnaB通透酶分別是高親和性的和低親和性的色氨酸專用通透酶,而Arop通透酶是芳香族氨基酸的共用通透酶。大腸桿菌中由yddG編碼的一種內(nèi)膜蛋白調(diào)控著芳香族氨基酸的胞外分泌。近年來,Wang J、Liu Q、GU P、Zhao Z等均對(duì)L-色氨酸的基因工程菌進(jìn)行了轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的改造,L-色氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量分別提高了12%～35%不等。本實(shí)驗(yàn)室保藏的L-色氨酸生產(chǎn)菌E.coliMT-01/pT-01,其宿主經(jīng)歷了數(shù)輪的誘變篩選,測(cè)序表明在其基因組上tnaB基因序列發(fā)生了誘變?nèi)笔?但mtr、arop和yddG的基因序列仍然完整。本研究以菌株E.coliMT-01/pT-01為出發(fā)菌株,考察了色氨酸吸收基因mtr的敲除和分泌基因yddG在不同啟動(dòng)子調(diào)控下的過量表達(dá)對(duì)菌體生長及其發(fā)酵生產(chǎn)色氨酸的影響[12-18]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 出發(fā)菌株為色氨酸工業(yè)生產(chǎn)菌株E.coliMT-01/pTrp-01,其宿主菌MT-01是E.coliW3110的抗色氨酸結(jié)構(gòu)類似物反饋抑制作用的化學(xué)誘變突變菌。質(zhì)粒pTrp-01是攜帶色氨酸合成關(guān)鍵酶基因aroGfbr、trpEfbrDCBA和serA,且aroGfbr和trpEfbrD為aroG和trpED的抗反饋調(diào)節(jié)突變基因,具有tac啟動(dòng)子和tet抗性的原核表達(dá)質(zhì)粒,為實(shí)驗(yàn)室保藏。本研究以E.coliMT-01/pTrp-01為出發(fā)菌株,構(gòu)建了色氨酸吸收基因mtr的敲除突變菌E.coliMT-11和yddG的表達(dá)質(zhì)粒(PACYC177-Pr-yddG,PACYC177-Ptac-yddG,PACYC177-PserA-yddG),從而獲得了基因工程菌E.coliMT-11/pTrp-01和E.coliMT-11/pTrp-01.敲除所需的工具質(zhì)粒pKD13、pKD46和pCP20購自美國耶魯大學(xué)大腸桿菌菌株庫(E.coliGenetic Stock Center,New Haven,USA)[19]。

yddG過表達(dá)所需質(zhì)粒有pACYC177,pMD19-Pr,pMD19-Ptac 和pMD19-PserA皆為實(shí)驗(yàn)室保存,其中pACYC177是一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)為p15A的低拷貝質(zhì)粒,可以與包含pMB1或ColE1復(fù)制子的質(zhì)粒共存,比如pTrp-01,pMD19-T等質(zhì)粒,pMD19-Pr,pMD19-Ptac pMD19-PserA為實(shí)驗(yàn)室保存的分別帶有啟動(dòng)子Pr,Ptac,PserA 序列的質(zhì)粒,pMD19-Pr質(zhì)粒中除了Pr啟動(dòng)子序列外,還帶有Pr啟動(dòng)子的溫度調(diào)控序列clts857。啟動(dòng)子Pr為溫敏型啟動(dòng)子,受溫度調(diào)控,啟動(dòng)子PserA為基因serA的天然啟動(dòng)子,基因serA是L-絲氨酸合成途徑中關(guān)鍵酶磷酸甘油酸脫氫酶的編碼基因,Ptac 是一種由乳糖啟動(dòng)子和色氨酸啟動(dòng)子人工構(gòu)建的雜合啟動(dòng)子,是一種強(qiáng)啟動(dòng)子[20-23]。

本研究中使用的菌株和質(zhì)粒的具體特性見表1。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

1.1.2 試劑和溶液 各種限制性內(nèi)切酶、PrimerSTAR HS DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶(Mix) 大連寶生物有限公司;DNA Ladder Mix Fementas公司;氨芐青霉素、硫酸卡那霉素,鹽酸四環(huán)素 上海捷倍思基因技術(shù)有限公司;質(zhì)粒小量制備試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒、PCR清潔試劑盒購自AxyPrep公司;L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司;其他化學(xué)試劑 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;常規(guī)試劑 采用國產(chǎn)分析純;引物合成和測(cè)序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.1.3 儀器 Gel Dox XR+凝膠成像系統(tǒng)、電轉(zhuǎn)儀Micro Pulser、S1000 PCR儀 美國BIO-RAD公司;DU730型紫外分光光度計(jì) 德國Beckman公司;SBA生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所;ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城儀器制造有限公司;Centrifuge 5430低溫離心機(jī) 德國Eppendorf公司;MLS-3780型高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋公司;高效液相色譜儀RID-10A/SPD-20A 日本島津公司;Inertsil ODS-SP色譜柱 日本GL science公司;DELTA 320型pH計(jì) 瑞士梅特勒公司;PYX-DHS-40X50-S恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;臺(tái)式高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司;Biostat A Plus發(fā)酵罐 德國Sartorius公司。

1.1.4 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基:10 g/L 蛋白胨,5 g/L 酵母粉,10 g/L 氯化鈉。發(fā)酵培養(yǎng)基:7.5 g/L葡萄糖,1.5 g/L酵母粉,2 g/L七水合硫酸鎂,1 g/L硫酸銨,2 g/L檸檬酸,3 g/L磷酸氫二銨,5 g/L氯化鉀,1 mL/L微量元素液母液(7 g/L六水合氯化鈷,2.5 g/L 五水合硫酸銅,25 g/L 硼酸,16 g/L 四水合氯化錳,1.5 g/L 二水合鉬酸鈉,3 g/L七水合硫酸鋅)。種子培養(yǎng):于LB平板挑取單菌落至裝有50 mL LB 培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中,37 ℃,200 r/min,培養(yǎng)8～10 h。

發(fā)酵罐培養(yǎng):以10% [v/v]比例轉(zhuǎn)接種子培養(yǎng)液至裝有2.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。含有溫敏型啟動(dòng)子Pr的工程菌株初始發(fā)酵溫度為32 ℃,當(dāng)菌株OD達(dá)到20以上時(shí)將發(fā)酵溫度提高至35 ℃,其余工程菌株在發(fā)酵周期內(nèi)的發(fā)酵溫度始終為35 ℃,當(dāng)發(fā)酵液中初始葡糖糖基本耗盡時(shí),開始流加600 g/L 的葡萄糖溶液,并調(diào)控流速使發(fā)酵液中的葡萄糖濃度小于5 g/L。發(fā)酵過程中,通過流加濃氨水使培養(yǎng)基pH保持在pH6.8～pH7.0[16]。

1.1.5 引物 基因敲除方面,根據(jù)E.coliMT-01的基因組序列,設(shè)計(jì)引物mtr_fw和mtr_rv,其中下劃線部分為mtr基因上下游各50 bp的同源臂序列,以pKD13 DNA為模板,擴(kuò)增mtr基因的打靶DNA片段。三對(duì)引物mtr_v1和k1,k2和mtr_v2,mtr_v1和mtr_v2分別用于鑒定mtr基因的敲除,其中引物mtr_v1和mtr_v2分別是基因組中mtr基因上游和下游的DNA序列,引物k1和k2分別為質(zhì)粒pKD13中Kan基因內(nèi)部序列。

基因的克隆表達(dá)方面,根據(jù)質(zhì)粒pMD19-Pr及基因yddG序列設(shè)計(jì)引物BglII-yddG-F和KpnI-yddG-R,根據(jù)質(zhì)粒pMD19-Ptac pMD19-PserA和基因yddG序列設(shè)計(jì)SacI-yddG-F和AvrII-yddG-R。引物BglII-yddG-F和KpnI-yddG-R用于從w3110基因組上擴(kuò)至基因片段yddG,并使其兩端分別帶有酶切位點(diǎn)BglII和KpnI,通過酶切位點(diǎn)BglII和KpnI可以將基因yddG組裝到質(zhì)粒pMD19-Pr的啟動(dòng)子Pr序列之后,用于驗(yàn)證基因yddG及啟動(dòng)子Pr的效率,同理利用酶切位點(diǎn)SacI和AvrII可以分別考察基因yddG和啟動(dòng)子Ptac及基因yddG和啟動(dòng)子PserA的效率。本研究中所用引物的合成及相應(yīng)的DNA序列測(cè)序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

因?yàn)榛蚬こ叹鶰T-21,MT-22和MT-23中除了質(zhì)粒pTrp-01,還存在重組質(zhì)粒pACYC177,pACYC177是一個(gè)可以與pTrp-01共存的低拷貝質(zhì)粒,pTrp-01為四環(huán)素抗性,pacyc177為氨芐抗性,且兩者的ori序列不同,故設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物177-F與177-R,其中177-F與pacycy的ori序列同源。本研究所用引物的DNA序列見表2。本研究中所用引物的合成及相應(yīng)的DNA序列測(cè)序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

表2 本章研究中使用的引物Table 2 Oligonucleotide primers used in this study

注：下劃線序列為目標(biāo)敲除基因的50個(gè)同源臂序列;斜體序列為限制性酶核苷序列。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1mtr基因的敲除mtr基因的敲除參照文獻(xiàn)[19,24]。

1.2.2yddG克隆與表達(dá) 首先,通過PCR的手段,用引物BglII-yddG-F和KpnI-yddG-R從大腸桿菌w3110的基因組中擴(kuò)增基因yddG片段,片段兩端帶有酶切位點(diǎn)BglII和KpnI,之后利用限制性內(nèi)切酶BglII和KpnI 雙酶切基因yddG和質(zhì)粒pMD19-Pr,切膠回收酶切后的片段,利用T4 連接酶進(jìn)行過夜連接,再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中,提取轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒進(jìn)行pcr 驗(yàn)證及測(cè)序驗(yàn)證,獲得正確的質(zhì)粒pMD19-Pr-ry;同理,通過PCR的手段,以大腸桿菌w3110的基因組為模板,用引物SacI-yddG-F和AvrII-yddG-R擴(kuò)增基因片段yddG,片段兩端帶有酶切位點(diǎn)SacI和AvrII,利用限制性內(nèi)切酶SacI和AvrII雙酶切基因yddG和載體質(zhì)粒pMD19-Ptac及pMD19-PserA,將酶切的yddG片段分別于載體質(zhì)粒pMD19-Ptac和pMD19-PserA的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接,經(jīng)過連接、轉(zhuǎn)化、PCR驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證,獲得正確的重組質(zhì)粒pMD19-Ptac-ty及pMD19-PserA-sy;最后使用限制內(nèi)切酶stuI酶切質(zhì)粒pMD19-Pr-ry,pMD19-Ptac-ty,pMD19-PserA-sy和質(zhì)粒Pacyc177,經(jīng)過上述手段,將片段Pr-ry,Ptac-ty,PserA-sy重組到質(zhì)粒Pacyc177上,分別得到重組質(zhì)粒pACYC177-Pr-yddG,pACYC177-Ptac-yddG與pACYC177-PserA-yddG[25-26]。

1.2.3 發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定 發(fā)酵液中的菌體密度以600 nm波長下分光光度計(jì)檢測(cè)的吸光值(OD600)表示,細(xì)胞干重根據(jù)前期構(gòu)建的經(jīng)驗(yàn)公式獲得(1OD=0.5 g/L細(xì)胞干重),OD值的讀數(shù)在0.2～0.8范圍內(nèi)是可靠的,當(dāng)OD值超出這一范圍,進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。發(fā)酵液中的葡萄糖濃度通過SBA生物傳感儀檢測(cè)。發(fā)酵液中的L-色氨酸濃度通過Agilent 1200 HPLC系統(tǒng)RP-HPLC測(cè)定。采用的色譜柱為:Inertsil ODS-SP色譜柱(250 mm×4.6 mm i.d.,5 μm)。流動(dòng)相為:甲醇 和 0.05% 磷酸,流速為0.8 mL/min。梯度洗脫程序?yàn)?0～3 min,2%甲醇;3～22 min,甲醇由2%升至80%;甲醇濃度保持80%至25 min;25～26 min,甲醇濃度由80%降低至2%;回到初始條件。使用紫外檢測(cè)器檢測(cè)標(biāo)樣及樣品中L-色氨酸在210 nm的吸收峰值[3]。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理方法 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取平均值,采用Origin 7.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

在大腸桿菌中L-色氨酸的生物合成途徑可以分為兩部分,由葡萄糖生成分支酸的途徑(包括中心代謝途徑與芳香族氨基酸合成的共同途徑)和由分支酸最終生成L-色氨酸的途徑。L-色氨酸的生物合成的中心代謝途徑起始于葡萄糖,通過糖酵解(EMP)途徑得到的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)與通過磷酸戊糖途徑(HMP)得到的4-磷酸赤蘚糖(E4P)進(jìn)行縮合,形成3-脫氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP);從DAHP開始經(jīng)莽草酸(SHIK)最終合成分支酸(CHA)的過程是芳香族氨基酸合成的共同途徑;色氨酸是芳香族氨基酸三條分支途徑中的一支,從分支酸開始經(jīng)鄰氨基苯甲酸(ANTA)最終合成色氨酸。大腸桿菌中L-色氨酸的代謝合成通路如圖1[6]。

圖1 大腸桿菌中L-Trp的合成代謝途徑及相關(guān)調(diào)控Fig.1 Metabolic pathways and regulation for biosynthesis of L-Trp in E. coli注:虛線表示芳香族氨基酸反饋抑制?？s寫分別表示:G6P,6-磷酸葡萄糖;HMP,磷酸戊糖途徑;EMP,糖酵解途徑;E4P,4-磷酸赤蘚糖;PEP,磷酸烯醇丙酮酸;DAHP,3-脫氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸;SHIK,莽草酸;CHA,分支酸;ANTA,鄰氨基苯甲酸;PPA,預(yù)苯酸;PPY,苯丙酮酸;PRAA,磷酸核糖鄰氨基苯甲酸;HPP,4-羥苯基丙酮酸;I3GP,吲哚-3-磷酸甘油;L-Phe,L-苯丙氨酸;L-Trp,L-色氨酸;L-Tyr,L-酪氨酸。

2.1mtr基因敲除菌的構(gòu)建

通過電轉(zhuǎn)化的手段,首先將質(zhì)粒pKD46轉(zhuǎn)化到E.coliMT-01感受態(tài)細(xì)胞中,之后利用引物mtr_fw和mtr_rv從質(zhì)粒pKD13上擴(kuò)增打靶PCR片段mtrD50-kan-mtrD50,將打靶片段轉(zhuǎn)化至含有質(zhì)粒pKD46的E.coliMT-01感受態(tài)細(xì)胞中,在kan平板上初步篩選同源重組的mtr基因的敲除突變株。以篩選到的菌株為模板,分別利用引物mtr_v1和k1,k2和mtr_v2對(duì)初選的菌株進(jìn)行菌落PCR鑒定,根據(jù)序列分析,mtr敲除菌經(jīng)擴(kuò)增后分別可得到大小為1063 bp和1343 bp的PCR片段,DNA凝膠電泳的結(jié)果與理論值相符(圖1),表明mtr基因敲除成功。最后,利用質(zhì)粒pCP20消除mtr基因敲除菌的kan抗性基因,將質(zhì)粒pCP20轉(zhuǎn)化至mtr基因敲除菌中后,在無抗平板上初步篩選kan抗性消除的mtr基因的敲除突變株,以篩選到的菌株為模板利用引物mtr_v1和mtr_v2進(jìn)行菌落PCR鑒定,根據(jù)序列分析,mtr敲除菌消抗后可得到大小為1253 bp的DNA片段,DNA凝膠電泳的結(jié)果與理論值相符(圖2),將PCR片段送至公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證mtr基因敲除正確。命名mtr敲除菌為MT-11。

圖2 大腸桿菌MT-01吸收系統(tǒng)mtr基因敲除的PCR分析Fig.2 PCR analysis of mtr knockout of L-Trp uptake system in E. coli MT-01注:Lane 1:mtr_v1→k1;Lane 2:k2→mtr_v2。

圖3 消除mtr敲除菌中kan抗性基因的PCR驗(yàn)證Fig.3 PCR verification of the elimination of Kan-resistant gene of mtr knockout mutant注:Lane 1:mtr_v1→mtr_v2。

2.2mtr基因敲除菌的分批補(bǔ)料發(fā)酵

將含有色氨酸合成關(guān)鍵酶基因的質(zhì)粒pTrp-01轉(zhuǎn)化至mtr基因敲除菌中,構(gòu)建色氨酸基因工程菌E.coliMT-11/pTrp-01。

在5 L發(fā)酵罐中對(duì)mtr基因敲除菌E.coliMT-11/pTrp-01及出發(fā)菌株E.coliMT-01/pTrp-01進(jìn)行了補(bǔ)料分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。在色氨酸生產(chǎn)方面,菌株E.coliMT-11/pTrp-01的發(fā)酵液中最高可以積累35.87 g/L色氨酸,與出發(fā)菌株E.coliMT-01/pTrp-01 相比提高了32%。研究結(jié)果表明色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)mtr基因的敲除對(duì)菌體發(fā)酵生產(chǎn)色氨酸是有利的。此外,如圖4所示,發(fā)酵罐中菌株E.coliMT-01/pTrp-01與E.coliMT-11/pTrp-01的菌體生長水平相仿,說明基因mtr的敲除并沒有影響菌株的生長。

圖4 mtr敲除菌產(chǎn)L-色氨酸情況Fig.4 The L-tryptophan yield of gene mtr deletion mutant

圖5 mtr敲除菌生長情況Fig.5 The cell growth of gene mtr deletion mutant

2.3yddG過表達(dá)基因工程菌的構(gòu)建

將PCR獲得的yddG片段,與pMD19-T載體連接后送測(cè)序,測(cè)序結(jié)果證明,yddG片段序列正確。經(jīng)過酶切酶連、轉(zhuǎn)化、PCR驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證等過程,將基因yddG重組到質(zhì)粒pACYC177上,獲得重組質(zhì)粒pACYC177-Pr-yddG,pACYC177-Ptac-yddG和pACYC177-PserA-yddG,分別將重組質(zhì)粒pACYC177-Pr-yddG,pACYC177-Ptac-yddG與pACYC177-PserA-yddG通過電轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)化至大腸桿菌MT-11/pTrp01中,在氨芐與四環(huán)素雙抗平板上挑取單菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基,過夜,取菌液,使用質(zhì)粒小量制備試劑盒抽提質(zhì)粒,分別以所提質(zhì)粒為模板,使用驗(yàn)證引物177-F和177-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)過序列分析,應(yīng)分別得到大小為4067,2468,2598 bp的條帶,通過DNA電泳,所得條帶與理論值相符合,將PCR片段送至公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果證明pACYC177-Pr-yddG,pACYC177-Ptac-yddG與pACYC177-PserA-yddG皆轉(zhuǎn)化成功,分別得到基因工程菌MT-11/pTrp01/pACYC177-Pr-yddG,MT-11/pTrp01/pACYC177-Ptac-yddG和MT-11/pTrp01/pACYC177-PserA-yddG,分別記為MT-21,MT-22和MT-23。

圖6 大腸桿菌分泌系統(tǒng)yddG基因過表達(dá)的PCR分析Fig.6 PCR analysis of yddG overexpression of L-Trp secretory system。注:1,2:177-F→177-R pACYC177-Pr-yddG;3,4:177-F→177-R pACYC177-PserA-yddG;5,6:177-F→177-R pACYC177-Ptac-yddG。

2.4yddG基因工程菌的發(fā)酵

在5 L發(fā)酵罐中對(duì)yddG過表達(dá)菌株(MT-21,MT-22和MT-23)以及mtr基因敲除菌E.coliMT-11/pTrp-01進(jìn)行了補(bǔ)料分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。如圖7所示,三株yddG基因工程菌生產(chǎn)色氨酸的能力不盡相同,在tac啟動(dòng)子調(diào)控下的yddG過表達(dá)菌株MT-22生產(chǎn)色氨酸的能力最強(qiáng),產(chǎn)量達(dá)到了41.01 g/L,比mtr敲除菌株E.coliMT-11/pTrp-01的產(chǎn)量提高了14.3%;當(dāng)采用Pr啟動(dòng)子時(shí)發(fā)酵液中最高可以積累39.22 g/L 色氨酸,與mtr敲除菌株E.coliMT-11/pTrp-01的產(chǎn)量相比提高了9.3%;在基因serA天然啟動(dòng)子調(diào)控下的yddG過表達(dá)菌株MT-23的產(chǎn)量較低產(chǎn)量只有27.1 g/L,比mtr敲除菌株E.coliMT-11/pTrp-01產(chǎn)量相比減少了24%,此外,從菌株的生長情況來看,如圖8所示,在tac啟動(dòng)子調(diào)控下的yddG過表達(dá)菌株的生長與mtr基因敲除菌E.coliMT-11/pTrp-01相比必?zé)o較大差距,而Pr啟動(dòng)子調(diào)控下的yddG過表達(dá)菌株在36 h前的生長要弱于E.coliMT-11/pTrp-01,但采用基因serA天然啟動(dòng)子的生長則受到了嚴(yán)重的影響。serA啟動(dòng)子調(diào)控下的yddG過表達(dá)菌株的色氨酸產(chǎn)量較低,因?yàn)榫闙T-23的生長狀況弱于其他兩種yddG過表達(dá)菌株,生長狀況的差異可能主要?dú)w因于三種啟動(dòng)子自身的性質(zhì)不同,三種不同啟動(dòng)子調(diào)控下的yddG的轉(zhuǎn)錄水平存在差異,可能影響了菌株自身的代謝,進(jìn)而影響菌株的生長及色氨酸的生產(chǎn),具體機(jī)理還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證;此外,Pr啟動(dòng)子為溫敏型啟動(dòng)子,因此Pr啟動(dòng)子調(diào)控下的yddG過表達(dá)菌株的發(fā)酵方式也與其他兩種啟動(dòng)子調(diào)控下的菌株存在不同,采用Pr啟動(dòng)子時(shí),初始發(fā)酵溫度為32 ℃,當(dāng)菌株OD達(dá)到20以上時(shí)才將發(fā)酵溫度提高至35 ℃,而其他兩種啟動(dòng)子的發(fā)酵過程中溫度一直保持在35 ℃,因此菌株在前期的生長不如mtr基因敲除菌,后期當(dāng)溫度提高后,生長逐漸與mtr基因敲除菌趨同。

圖7 yddG過表達(dá)菌株產(chǎn)L-色氨酸情況Fig.7 The L-tryptophan yield of gene yddG overexpression mutants

圖8 yddG過表達(dá)菌株生長情況Fig.8 The cell growth of gene yddG overexpression mutants

3 討論與結(jié)論

在色氨酸合成途徑得到充分改造之后,色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑工程同樣獲得了研究者的廣泛關(guān)注。與其它研究相比,本研究出發(fā)菌株E.coliMT-01/pTrp-01的宿主經(jīng)歷過了多輪的物理化學(xué)誘變,其基因組上存在眾多的隨機(jī)突變位點(diǎn),本研究嘗試考察在這種獨(dú)特基因組背景下,轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)改造對(duì)菌株生長和產(chǎn)L-色氨酸的影響。基因組信息表明,出發(fā)菌株基因組上的tnaB基因已經(jīng)發(fā)生了多數(shù)序列缺失突變;而前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株E.coliMT-01/pTrp-01在發(fā)酵過程中會(huì)少量積累L-苯丙氨酸和L-酪氨酸,這種情況下Arop透酶將優(yōu)先吸收L-苯丙氨酸和L-酪氨酸,因此本研究著重研究了吸收基因mtr敲除以及分泌基因yddG過表達(dá)對(duì)菌體生長和產(chǎn)酸的影響。結(jié)果表明,mtr基因的敲除可以使菌株L-色氨酸產(chǎn)量提高32%;此外,本研究還首次考察了不同啟動(dòng)子調(diào)控下分泌基因yddG過量表達(dá)對(duì)菌株L-色氨酸產(chǎn)量的影響,發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用tac啟動(dòng)子時(shí)最有利于菌株積累L-色氨酸,而當(dāng)采用基因serA天然啟動(dòng)子時(shí),菌體的產(chǎn)酸能力最差,且菌體的生長也受到了影響。上述結(jié)果表明,吸收基因mtr敲除還是大幅提升了菌株產(chǎn)L-色氨酸的能力;而分泌基因yddG因啟動(dòng)子不同而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度存在差異時(shí),菌體的產(chǎn)L-色氨酸能力以及生長能力同樣表現(xiàn)出較大差異性[16]。

[1]Leuchtenberger W,Huthmacher K,Drauz K. Biotechnological production of amino acids and derivatives:current status and prospects[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2005,69(1):1-8.

[2]Bongaerts J,Mer M K,Müller U,et al. Metabolic engineering for microbial production of aromatic amino acids and derived compounds[J]. Metabolic Engineering,2001.

[3]Zhao Z,Zou C,Zhu Y,et al. Development of l-tryptophan production strains by defined genetic modification inEscherichiacoli[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2011,38(12):1921-1929.

[4]Liu L,Duan X,Wu J. L-tryptophan production inEscherichiacoliimproved by weakening the pta-acka pathway[J]. PLOS ONE,2016,11(6):e158200.

[5]Chen L,Zeng A. Rational design and metabolic analysis ofEscherichiacolifor effective production of L-tryptophan at high concentration[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2017,101(2):559-568.

[6]Ikeda M. Towards bacterial strains overproducing L-tryptophan and other aromatics by metabolic engineering[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2006,69(6):615-626.

[7]Rodriguez A,Martnez J A,Flores N,et al. EngineeringEscherichiacolito overproduce aromatic amino acids and derived compounds[J]. Microbial Cell Factories,2014.

[8]Lee K H,Park J H,Kim T Y,et al. Systems metabolic engineering ofEscherichiacolifor L-threonine production[J]. Mol Syst Biol,2007,3:149.

[9]Park J H,Lee K H,Kim T Y,et al. Metabolic engineering ofEscherichiacolifor the production of L-valine based on transcriptome analysis and in silico gene knockout simulation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,2007,104(19):7797-7802.

[10]崔云風(fēng),石斌超,李晶,等. 大腸桿菌絲氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)單基因敲除對(duì)絲氨酸生產(chǎn)的影響[J]. 食品工業(yè)科技,2016(14):191-195.

[11]梁媛,楊書堯,劉宏亮,等. 大腸桿菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SstT和RhtC的改造對(duì)L-蘇氨酸產(chǎn)量的影響[J]. 現(xiàn)代食品科技,2014,4(4):99-103.

[12]Doroshenko,Airich V,Vitushkina L,et al. yddG fromEscherichiacolipromotes export of aromatic amino acids[J]. Fems Microbiology Letters,2007.

[13]Liu Q,Cheng Y,Xie X,et al. Modification of tryptophan transport system and its impact on production of L-tryptophan inEscherichiacoli[J]. Bioresource Technology,2012.

[14]Wang J,Cheng L K,Wang J,et al. Genetic engineering ofEscherichiacolito enhance production of L-tryptophan[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2013.

[15]Ikeda M,Katsumata R. Tryptophan production by transport mutants of Corynebacterium glutamicum[J]. Bioscience Biotechnology &Biochemistry,1995.

[16]Zhao Z,Chen S,Wu D,et al. Effect of gene knockouts of L-tryptophan uptake system on the production of l-tryptophan inEscherichiacoli[J]. Process Biochemistry,2012.

[17]Gu P,Yang F,Kang J,et al. One-step of tryptophan attenuator inactivation and promoter swapping to improve the production of L-tryptophan inEscherichiacoli[J]. Microbial Cell Factories,2012,11(1):30.

[18]Gu P,Yang F,Li F,et al. Knocking out analysis of tryptophan permeases inEscherichiacolifor improving L-tryptophan production.[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2013,97(15):6677-6683.

[19]Baba T,Ara T,Hasegawa M,et al. Construction ofEscherichiacoliK-12 in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection[J]. Molecular Systems Biology,2006,2:2006-2008.

[20]董洪亮,韓先干,白灝,等. λpL/pR-cI857溫控系統(tǒng)的改造及其對(duì)大腸桿菌菌蛻制備的影響[J]. 生物工程學(xué)報(bào),2012(12):1423-1430.

[21]周麗,鄧璨,崔文璟,等. 溫度調(diào)節(jié)基因開關(guān)調(diào)控大腸桿菌發(fā)酵合成L-丙氨酸[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2015(11):2272-2281.

[22]張大軍,馮博,皇甫永穆. 雙Tac啟動(dòng)子的構(gòu)建及其對(duì)人白細(xì)胞介素2在大腸桿菌中表達(dá)的影響[J]. 同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1993(4):226-229.

[23]唐瑋,李鍵,陳軍,等. 大腸桿菌異源生產(chǎn)丁醇途徑組裝及啟動(dòng)子優(yōu)化[J]. 生物工程學(xué)報(bào),2012(11):1328-1336.

[24]張雪,溫廷益. Red重組系統(tǒng)用于大腸桿菌基因修飾研究進(jìn)展[J]. 中國生物工程雜志,2008(12):89-93.

[25]張緒梅,郭長江,劉云,等. 大腸桿菌trpBA基因的克隆表達(dá)[J]. 生物技術(shù)通訊,2006(1):12-14.

[26]鄭麗娟,陳少云,徐剛,等. 利用雙啟動(dòng)子載體構(gòu)建產(chǎn)異丁醇大腸桿菌[J]. 中國生物工程雜志,2013(8):66-72.

Effect of engineering ofL-tryptophan transport system onL-tryptophan production inEscherichiacoli

LI Jing1,2,SHI Bin-chao2,WANG Chen-yang2,ZHAO Zhi-jun2,SHI Ji-ping2,*

(1.College of Life Science,Shanghai University,Shanghai 200444,China; 2.Shanghai Advanced Research Institute of Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201210,China)

In recent years,the strategy of transport system modification has been widely employed for the development of amino acid production strains. In the present study,the industrial production strainEscherichiacoliMT-01/pTrp-01 was chose as the start strain,theL-tryptophan uptake gene ofmtrknockout mutant strain were built by the method of Red homologous recombination,the fermentation results of themtrmutant showed that the production of tryptophan was 35.87 g/L,which was 32% higher than that of the origin strain. Furthermore,theL-tryptophan excretion gene ofyddGwas overexpressed at different levels by fusing with three different promoter(Pr,Ptac and PserA),and theL-tryptophan yield and the cell growth of geneyddGoverexpression mutants were studied.The fermentation results showed that the yddG overexpression mutant fused with the constitutive promoter of tac increased the production ofL-tryptophan to 41.01 g/L,which was 14.3% higher than that of the genemtrknockout strain,the yddg overexpression mutant driven by the temperature inducible promoter Pr produced 39.22 g/LL-tryptophan,which was 9.3% higher than that of the genemtrknockout strain. However,the yddg overexpression mutant driven by the promoter serA only produced 27.1 g/LL-tryptophan,and the cell growth of strain got significantly restrained. To sum up,overexpression of geneyddGand knockout of genemtrare beneficial to improve the ability of engineering strains to produceL-tryptophan.

Escherichiacoli;L-tryptophan;transport system;gene knockout;cloning and expression

2017-03-03

李晶(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail:18989875099@126.com。

*通訊作者:史吉平(1964-),男，博士，研究員，研究方向：生物化工產(chǎn)品生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究，E-mail:shijp@sari.ac.cn。

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31300048)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)15-0157-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.030